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Cancer Research

ल्यूसिफेरस-ट्रांसड्यूस्ड मानव टी कोशिकाओं का उपयोग करके द्वि-विशिष्ट एंटीबॉडी-प्रेरित टी सेल तस्करी पर नज़र रखना

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64390
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Summary

यहां, हम ल्यूसिफेरस के साथ मानव टी कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं ताकि एंटी-ट्यूमर प्रभावकारिता और टी सेल-एंगेजिंग बायोस्पेसिफिक एंटीबॉडी के तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए अध्ययन में ट्यूमर के लिए बायोस्पेसिफिक एंटीबॉडी-प्रेरित टी सेल तस्करी के विवो ट्रैकिंग में सुविधा हो सके।

Abstract

टी सेल-एंगेजिंग बाइस्पेसिफिक एंटीबॉडी (टी-बीएसएबी) ठोस ट्यूमर के लिए प्रीक्लिनिकल विकास और नैदानिक परीक्षण के विभिन्न चरणों में हैं। वैधता, स्थानिक व्यवस्था, इंटरडोमेन दूरी और एफसी उत्परिवर्तन जैसे कारक इन उपचारों की एंटी-ट्यूमर प्रभावकारिता को प्रभावित करते हैं, आमतौर पर ट्यूमर के लिए टी कोशिकाओं के होमिंग को प्रभावित करके, जो एक बड़ी चुनौती बनी हुई है। यहां, हम ल्यूसिफेरस के साथ सक्रिय मानव टी कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने की एक विधि का वर्णन करते हैं, जिससे टी-बीएसएबी थेरेपी अध्ययनों के दौरान टी कोशिकाओं की विवो ट्रैकिंग की अनुमति मिलती है। टी कोशिकाओं को ट्यूमर में पुनर्निर्देशित करने के लिए टी-बीएसएबीएस की क्षमता का उपचार के दौरान कई समय बिंदुओं पर मात्रात्मक रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है, जिससे शोधकर्ताओं को ट्यूमर में टी कोशिकाओं की दृढ़ता के साथ टी-बीएसएबीएस और अन्य हस्तक्षेपों की एंटी-ट्यूमर प्रभावकारिता को सहसंबंधित करने की अनुमति मिलती है। यह विधि टी सेल घुसपैठ का हिस्टोलॉजिकल रूप से आकलन करने के लिए उपचार के दौरान जानवरों की बलि देने की आवश्यकता को कम करती है और उपचार के दौरान और बाद में टी सेल तस्करी के कैनेटीक्स को निर्धारित करने के लिए कई समय बिंदुओं पर दोहराया जा सकता है।

Introduction

टी सेल-एंगेजिंग बाइस्पेसिफिक एंटीबॉडी (टी-बीएसएबी) इंजीनियर एंटीबॉडी हैं जिनका उपयोग पॉलीक्लोनल टी कोशिकाओं को कृत्रिम विशिष्टता प्रदान करने के लिए किया जाता है, जिसमें टी कोशिकाओं को एक बाध्यकारी हाथ के माध्यम से और एक ट्यूमर एंटीजन को दूसरे बाध्यकारी हाथ के माध्यम से संलग्न किया जाता है। इस तकनीक को सफलतापूर्वक हेमेटोलॉजिकल कैंसर (सीडी 19-टारगेटिंग ब्लिनाटुमोमैब1) पर लागू किया गया है, और कई टी-बीएसएबी विभिन्न प्रकार के ठोस ट्यूमर के लिए प्रीक्लिनिकल और नैदानिक विकासमें हैं। टी-बीएसएबी पॉलीक्लोनल टी कोशिकाओं को एक प्रमुख हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) -स्वतंत्र तरीके से संलग्न करते हैं, और इसलिए यहां तक कि ट्यूमर जो मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन (एचएलए) को डाउनरेगुलेट करते हैं, इस प्रकारकी चिकित्सा के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। टी-बीएसएबीएस को दर्जनों अलग-अलग प्रारूपों में विकसित किया गया है, जिसमें टी सेल और ट्यूमर बाइंडिंग आर्म्स की वैधता और स्थानिक व्यवस्था, इंटरडोमेन दूरी और एफसी डोमेन को शामिल करने में अंतर है, जो आधे जीवन को प्रभावित करता हैऔर वर्तमान में प्रभावी कार्यों को प्रेरित कर सकता है। हमारी प्रयोगशाला में पिछले काम से पता चला है कि ये कारक टी-बीएसएबीएस की एंटी-ट्यूमर प्रभावकारिता को काफी प्रभावित करते हैं, शक्ति6 में 1,000 गुना अंतर के साथ। इस काम के माध्यम से, हमने टी-बीएसएबी के लिए आदर्श मंच के रूप में आईजीजी-[एल]-एससीएफवी प्रारूप की पहचान की (टी-बीएसएबी प्रारूपों के बारे में अधिक जानकारी के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें), और इस मंच को जीडी 2 (न्यूरोब्लास्टोमा), एचईआर 2 (स्तन कैंसर और ओस्टियोसारकोमा), जीपीए 33 (कोलोरेक्टल कैंसर), एसटीईएपी 1 (इविंग सारकोमा), सीडी 19 (बी सेल मैलिग्नेंसी), और सीडी 33 (बी सेल मैलिग्नेंसी) सहित लक्ष्यों पर लागू किया है। 8,9,10,11,12,13.

ठोस ट्यूमर में टी-बीएसएबी थेरेपी को सफलतापूर्वक लागू करने के लिए प्रमुख चुनौतियों में से एक ट्यूमर14 में टी सेल तस्करी को चलाने के लिए इम्यूनोसप्रेसिव ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) पर काबू पाना है। ऊपर वर्णित टी-बीएसएबी प्रभावकारिता को प्रभावित करने वाले कारकों का ट्यूमर के लिए टी सेल होमिंग को प्रभावी ढंग से प्रेरित करने के लिए टी-बीएसएबीएस की क्षमता पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है, लेकिन वास्तविक समय में विवो सिस्टम में इस प्रभाव का मूल्यांकन करना मुश्किल है। यह पांडुलिपि उपचार के दौरान प्रयोगात्मक इम्युनोकॉम्प्रोमाइज्ड माउस मॉडल में विभिन्न ऊतकों में टी सेल तस्करी का मूल्यांकन करने के लिए टी-बीएसएबीएस के प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में ल्यूसिफेरस-ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाओं के उपयोग का विस्तृत विवरण प्रदान करती है। इस पद्धति का समग्र लक्ष्य ट्यूमर और अन्य ऊतकों में टी सेल घुसपैठ का मूल्यांकन करने के लिए एक साधन प्रदान करना है, साथ ही उपचार के दौरान जानवरों की बलि देने की आवश्यकता के बिना टी सेल होमिंग कैनेटीक्स और दृढ़ता में वास्तविक समय की अंतर्दृष्टि प्रदान करना है। सेलुलर इम्यूनोथेरेपी पर ध्यान केंद्रित करने वाले शोधकर्ताओं की बढ़ती संख्या के लिए, प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल में विवो में टी कोशिकाओं को ट्रैक करने की क्षमता महत्वपूर्ण है। हमारा उद्देश्य उस विधि का संपूर्ण, विस्तृत विवरण प्रदान करना है जिसे हमने ल्यूसिफेरस-ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए नियोजित किया है ताकि अन्य शोधकर्ता इस तकनीक को आसानी से दोहरा सकें।

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Protocol

निम्नलिखित प्रक्रियाओं का मूल्यांकन और अनुमोदन मेमोरियल स्लोन केटरिंग की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा किया गया है।

1. ल्यूसिफेरस के साथ 293 टी कोशिकाओं का अभिकर्मक और वायरल सुपरनैटेंट की फसल

  1. 293T कोशिकाओं की संस्कृति
    1. डीएमईएम के एक लीटर में निम्नलिखित जोड़कर मीडिया तैयार करें: 110 एमएल गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 11 एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन।
    2. 5 x 106 293 टी कोशिकाओं को पिघलाएं और उन्हें ऊपर वर्णित मीडिया के साथ टी 175 फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
    3. 293T कोशिकाओं को 6 दिनों के लिए हर 3 दिनों में 1:10 विभाजित करें। कोशिकाओं को 90% से अधिक कंफ्लुएंट न बनने दें।
  2. 293 टी कोशिकाओं का अभिकर्मक।
    नोट: अभिकर्मकों की निम्नलिखित मात्रा की गणना 293 टी कोशिकाओं के एक टी 175 फ्लास्क को स्थानांतरित करने के लिए की जाती है। यदि अधिक फ्लास्क को ट्रांसड्यूस किया जाना है तो तदनुसार समायोजित करें।
    1. एक पिपेट का उपयोग करके दो 50 एमएल ट्यूबों में से प्रत्येक में 1.5 एमएल मीडिया स्थानांतरित करें। एक ट्यूब में, 10 μg VSV-G प्लास्मिड, 20 μg Gag / pol, और 20 μg क्लिक बीटल लाल टीडी टमाटर (CBR-TDR) ल्यूसिफेरस प्लास्मिड जोड़ें और मिलाएं। अन्य ट्यूब में, इन विट्रो अभिकर्मक अभिकर्मक में डीएनए के 100 μL जोड़ें और मिलाएं। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर दोनों ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
      नोट: इस पांडुलिपि में वर्णित सभी प्लास्मिड डॉ व्लादिमीर पोनोमारेव द्वारा प्रदान किए गए थे।
    2. डीएनए इन विट्रो अभिकर्मक अभिकर्मक वाले मीडिया को डीएनए प्लास्मिड (लगभग 30 सेकंड से अधिक) युक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें और धीरे से एक पिपेट के साथ मिलाएं। 20 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    3. इस 20 मिनट इनक्यूबेशन के दौरान, 0.05% ट्रिप्सिन के 5-10 एमएल जोड़कर 293 टी कोशिकाओं को अलग करें। एक बार जब कोशिकाएं अलग हो जाती हैं, तो 5 मिनट के लिए 800 x g पर 10 मिलीलीटर मीडिया और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। 1.5 एमएल मीडिया में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    4. 293 टी कोशिकाओं में डीएनए इन विट्रो अभिकर्मक अभिकर्मक और डीएनए प्लास्मिड युक्त मीडिया जोड़ें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. टी 175 फ्लास्क में स्थानांतरित करें और 18 एमएल मीडिया जोड़ें। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    6. अगले दिन, कोशिकाओं को अलग किए बिना एक ग्लास पिपेट के साथ मीडिया को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें। 18 एमएल ताजा मीडिया के साथ बदलें। इनक्यूबेटर में रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. वायरल सुपरनैटेंट की कटाई
    1. बर्फ पर लगाए गए पिपेट का उपयोग करके वायरल सुपरनैटेंट को हटा दें। कोशिकाओं और मलबे को पेलेट करने के लिए 5 मिनट के लिए 800 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
      नोट: यदि सेल गोली बड़ी है, तो सतह पर तैरनेवाला को हटाने पर फ्लास्क से कोशिकाओं को बाधित करने की संभावना थी। इन कोशिकाओं को ताजा मीडिया के साथ एक नए फ्लास्क में फिर से चढ़ाया जा सकता है।
    2. 0.22 μm फ़िल्टर का उपयोग करके वायरल सुपरनैटेंट को फ़िल्टर करें।
    3. वायरल सुपरनैटेंट का तुरंत उपयोग करें। इसे बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे तक रखें, या इसे लंबे समय तक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।

2. ल्यूसिफेरस के साथ सक्रिय मानव टी कोशिकाओं का विस्तार और पारगमन

  1. विट्रो में मानव टी कोशिकाओं का सक्रियण।
    1. 15 एमएल ट्यूब में 0.1% बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) और 2 एमएम एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) युक्त फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 10 मिलीलीटर को जोड़कर मोतियों को धोएं, मोती (एक मोती प्रति दो टी कोशिकाएं), 2 मिनट के लिए चुंबक रैक में रखें, और पीबीएस को चूषण करें।
    2. चरण 1.1.1 में वर्णित मीडिया तैयार करें, फिर आईएल -2 को 30 आईयू / एमएल की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें और धुले हुए मोती जोड़ें। प्रत्येक दो मिलियन टी कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए 2.5 एमएल मीडिया बनाएं।
    3. हेमोसाइटोमीटर और ट्राइपैन ब्लू स्टेन का उपयोग करके टी कोशिकाओं (ताजा शुद्ध या पहले से शुद्ध, जमे हुए, पिघले और धोए गए) की गणना करें। चरण 2.1.2 में तैयार किए गए मीडिया में टी कोशिकाओं को जोड़ें और धीरे से मिश्रण करने के लिए ट्यूब को उल्टा करें। टी कोशिकाएं स्रोत और कोशिकाओं के सामान्य स्वास्थ्य के आधार पर कम से कम 20 गुना का विस्तार करेंगी। चूहों के इलाज के लिए आवश्यक संख्या की गणना करके और 20 से विभाजित करके सक्रिय करने के लिए टी कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें। यहां, प्रारंभिक प्रयोगों के आधार पर प्रति माउस 20 x 106 टी कोशिकाओं का उपयोग किया गया था।
    4. प्लेट 2.5 एमएल मीडिया जिसमें 24-वेल टिशू कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं में दो मिलियन टी कोशिकाएं, मोती और आईएल -2 होते हैं। एक ह्यूमिडिफ़ाइड 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति।
    5. अगले 3 दिनों के लिए हर दिन 20x माइक्रोस्कोप के तहत टी कोशिकाओं की जांच करें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि ल्यूसिफेरस के साथ कब ट्रांसड्यूस करना है। कोशिकाएं तब तैयार होती हैं जब वे एक साथ टकराते हैं और मीडिया को कम करते हैं, इसे लाल / गुलाबी से हल्के नारंगी में बदल देते हैं।
  2. रेट्रोनेक्टिन प्लेटों की तैयारी
    नोट: रेट्रोनेक्टिन का उपयोग पारगमन में उपयोग की जाने वाली प्लेटों को कोट करने के लिए किया जाता है क्योंकि यह जीन ट्रांसडक्शन15 को बढ़ाता है।
    1. पीबीएस में 20 μg / mL रेट्रोनेक्टिन के 2 मिलीलीटर को अनुपचारित 6-वेल प्लेट के कुएं में जोड़ें। आरटी पर 2 घंटे या 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। प्रत्येक दो मिलियन टी कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने के लिए एक रेट्रोनेक्टिन-लेपित कुएं की आवश्यकता होती है।
    2. प्लेट के निचले हिस्से को खरोंचे बिना रेट्रोनेक्टिन को एस्पिरेट करें।
    3. 6-वेल प्लेट में प्रति कुएं पीबीएस (बाँझ फ़िल्टर्ड) में 2% बीएसए के 3 एमएल जोड़ें। आरटी पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. स्पोक्युलेशन
    1. प्लेट के निचले हिस्से को खरोंचे बिना बीएसए को एस्पिरेट करें।
    2. प्रति कुएं 3 मिलीलीटर पीबीएस के साथ एक बार कुओं को धो लें। ताजा पीबीएस के साथ जारी रखें या बदलें और प्लेट को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर कवर छोड़ दें।
    3. प्रति कुएं सीबीआर-टीडीआर ल्यूसिफेरस वायरल सुपरनैटेंट (चरण 1.3 में एकत्र) के 2 एमएल जोड़ें।
    4. 32 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए 1,240 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  4. पारक्रमणअ
    1. टी कोशिकाओं की गिनती करें।
    2. प्लेट के निचले हिस्से को खरोंचे बिना वायरल सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करें।
    3. डलबेकको के संशोधित ईगल ्स मीडियम (डीएमईएम) के 6 एमएल में प्रति कुएं दो मिलियन टी कोशिकाओं को प्लेट करें जिसमें 30 आईयू / एमएल मानव आईएल -2 होता है।
    4. रोजाना टी कोशिकाओं की जांच करें। टी कोशिकाएं विस्तारित होने के लिए तैयार होती हैं जब वे लगभग स्थिर होती हैं, आमतौर पर 2 दिनों के बाद।
    5. जब कोशिकाएं लगभग स्थिर हो जाती हैं, तो धीरे से उन्हें पिपेट का उपयोग करके प्लेट के नीचे से धो लें और प्रत्येक अच्छी तरह से एक अलग टी 75 फ्लास्क में स्थानांतरित करें। प्रति फ्लास्क कुल 15 एमएल मीडिया के लिए 9 एमएल मीडिया जोड़ें।
    6. अगले दिन, अतिरिक्त 15 एमएल मीडिया जोड़ें। मीडिया के इस अतिरिक्त के एक दिन बाद कोशिकाओं को चूहों में इंजेक्ट करने के लिए तैयार होना चाहिए। फ्लो साइटोमेट्री करके सफल पारगमन की पुष्टि करें (लूसिफेरस निर्माण में एक टीडी टमाटर फ्लोरोफोरे होता है जो पीई चैनल में दिखाई देता है)16।

3. इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड चूहों में ल्यूसिफेरस-ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाओं का एन्ग्राफमेंट।

  1. इंजेक्शन के लिए टी कोशिकाओं को तैयार करें और गिनें।
    1. फ्लास्क से टी कोशिकाओं को निकालें और गिनती करें। कोशिकाएं इंजेक्शन के लिए तैयार होती हैं जब वे 20x-30x का विस्तार कर लेती हैं, आमतौर पर दिन 7 पोस्ट-सक्रियण तक।
    2. 5 मिनट के लिए 800 x g पर T कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। 2 एमएल मीडिया में पुन: निलंबित करें और चुंबक रैक का उपयोग करके मोतियों को हटा दें।
    3. प्रयोगों के लिए जहां टी कोशिकाओं को द्विविशिष्ट एंटीबॉडी से अलग से इंजेक्ट किया जाएगा, टी कोशिकाओं की गणना करें और फिर से निलंबित करें ताकि अंतिम एकाग्रता प्रति 100 μL मीडिया में 20 मिलियन टी कोशिकाएं हों। चरण 3.2 पर जाएं। एक्स विवो सशस्त्र टी कोशिकाओं (ईएटी) का उपयोग करने वाले प्रयोगों के लिए, चरण 3.1.4 पर जाएं।
    4. एक्स विवो सशस्त्र टी कोशिकाओं का उपयोग करने वाले प्रयोगों के लिए, टी कोशिकाओं की गणना करें और उन्हें प्रत्येक समूह के लिए अलग-अलग 1.5 एमएल ट्यूबों में अलग करें, जिसमें प्रति माउस 20 मिलियन कोशिकाएं हों। उदाहरण के लिए, यदि प्रत्येक में पांच चूहों के तीन समूह हैं, तो प्रत्येक 100 मिलियन टी कोशिकाओं के साथ तीन 1.5 एमएल ट्यूब तैयार करें।
    5. 5 मिनट के लिए 800 x g पर 1.5 mL ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। टी सेल गोली को परेशान किए बिना मीडिया को सावधानी से हटा दें। द्विविशिष्ट एंटीबॉडी युक्त मीडिया के 50 μL से अधिक में पुन: निलंबित करें। 30 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: इस अध्ययन में किए गए प्रयोगों के प्रयोजनों के लिए, प्रयोगशाला में उत्पन्न मालिकाना आईजीजी-[एल]-एससीएफवी टी सेल-एंगेजिंग बाइस्पेसिफिक एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था। टी सेल आर्मिंग के लिए, प्रति 20 x 106 टी कोशिकाओं में एंटीबॉडी के 5 μg का उपयोग करें। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध द्विविशिष्ट एंटीबॉडी का भी उपयोग किया जा सकता है।
    6. प्रत्येक ट्यूब में 1,450 μL मीडिया जोड़कर अतिरिक्त एंटीबॉडी को धोएं। 5 मिनट के लिए 800 x g पर सेंट्रीफ्यूज, मीडिया को ध्यान से एस्पिरेट करें, और प्रति 100 μL मीडिया में 20 मिलियन सशस्त्र टी कोशिकाओं की एकाग्रता पर फिर से निलंबित करें।
  2. चूहों में इंजेक्शन और एनग्राफ्टमेंट।
    1. चूहों को एक कक्ष में एनेस्थेटाइज करें जो 1 एल / मिनट ऑक्सीजन में 3.5% (वी / वी) इनहेल्ड आइसोफ्लुरेन की आपूर्ति करता है। चूहों को पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है जब पिछले अंग पेडल वापसी रिफ्लेक्स गायब हो जाता है।
      नोट: पूरी प्रक्रिया के दौरान थर्मल समर्थन प्रदान करें।
    2. 26 ग्राम सुई का उपयोग करके, प्रति माउस रेट्रोऑर्बिटल रूप से 100 μL मीडिया में 20 मिलियन टी कोशिकाओं को इंजेक्ट करें।
    3. विवो में टी सेल अस्तित्व का समर्थन करने के लिए 1,000 यू पुनः संयोजक आईएल -2 को चमड़े के नीचे प्रशासित करें।
    4. द्वि-विशिष्ट एंटीबॉडी को रेट्रोऑर्बिटल रूप से (टी सेल इंजेक्शन के लिए उपयोग नहीं की जाने वाली आंख में) या इंट्रापरिटोनियल रूप से प्रशासित करें। चूहों को संज्ञाहरण से उबरने और अपने पिंजरों में लौटने की अनुमति दें।
      नोट: फिर से, यहां, प्रयोगशाला में उत्पन्न मालिकाना एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था, लेकिन इसके बजाय व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है। यहां प्रयोगों में, प्रति खुराक प्रति माउस एंटीबॉडी के 0.3-10 μg प्रशासित किया गया था। एंटीबॉडी को 3-4 सप्ताह के लिए प्रति सप्ताह दो बार प्रशासित किया गया था।

4. ल्यूसिफेरस-ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाओं के साथ संलग्न चूहों की विवो इमेजिंग में ।

नोट: यह चरण इमेजिंग के दिन किया जाना है, जो जरूरी नहीं कि उसी दिन हो जब टी कोशिकाओं और / या एंटीबॉडी को चूहों को प्रशासित किया जाता है। आमतौर पर, हम ल्यूसिफेरस-ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाओं के प्रशासन के 24 घंटे बाद इमेजिंग करते हैं।

  1. डी-लूसिफेरिन की तैयारी
    1. 33.3 एमएल बाँझ पीबीएस (अंतिम एकाग्रता: 30 मिलीग्राम / एमएल) में डी-लूसिफेरिन के 1 ग्राम को घोलें।
    2. विघटित डी-लूसिफेरिन को 33 x 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में विभाजित करें और ट्यूबों को -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    3. इमेजिंग के दिन, जानवरों की संख्या को चित्रित करने के लिए 30 मिलीग्राम / एमएल डी-लूसिफेरिन के पर्याप्त एलिकोट पिघलाएं। एक ट्यूब 10 जानवरों के लिए पर्याप्त है।
      नोट: उपयोग के बाद शेष डी-लूसिफेरिन को फिर से फ्रीज करें। डी-लूसिफेरिन कम से कम पांच फ्रीज / पिघलने चक्रों के लिए स्थिर है।
  2. चूहों को डी-लूसिफेरिन का प्रशासन।
    नोट: चूहों को डी-लूसिफेरिन देने से पहले, इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें और सिस्टम को शुरू करें। कैमरे को ठंडा होने में कई मिनट लग सकते हैं, और यह चूहों को डी-लूसिफेरिन के साथ इंजेक्ट करने से पहले किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सब्सट्रेट के प्रशासन के 5 मिनट बाद इमेजिंग हो सकती है।
    1. एक कक्ष में पांच चूहों तक एनेस्थेटाइज्ड करें जो 1 एल / मिनट ऑक्सीजन में 3.5% (वी / वी) इनहेल्ड आइसोफ्लुरेन की आपूर्ति करता है। चूहों को पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है जब पिछले अंग पेडल वापसी रिफ्लेक्स गायब हो जाता है।
    2. एक बार जब चूहों को पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड कर दिया जाता है, तो 26 ग्राम सुई के साथ रेट्रोऑर्बिटल इंजेक्शन द्वारा प्रति माउस (3 मिलीग्राम प्रति माउस) के 100 μL 30 मिलीग्राम / एमएल डी-लूसिफेरिन का प्रबंधन करें। अगले समूह को डी-लूसिफेरिन देने से पहले चूहों के इस समूह की छवि बनाएं। चूहों के अगले समूह को आइसोफ्लुरेन कक्ष में एनेस्थेटाइज करने के लिए रखें, जबकि पिछले समूह को चित्रित किया जा रहा है।
  3. ल्यूसिफेरस-ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाओं की इमेजिंग।
    1. एनेस्थेटाइज्ड चूहों को इमेजर के हल्के-तंग कक्ष में ले जाएं और 0.5 एल / मिनट पर 3% आइसोफ्लुरेन का प्रशासन जारी रखें। चूहों को उनके किनारों पर रखें ताकि जेनोग्राफ्ट को धारण करने वाला फ्लैंक कैमरे की ओर हो। फेफड़ों में टी सेल की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए लापरवाह स्थिति में चूहों के साथ छवियों का एक और सेट लें।
    2. अधिग्रहण नियंत्रण कक्ष का उपयोग करके, ल्यूमिनेसेंट, फोटोग्राफ और ओवरले का चयन करें। ऑटो के लिए एक्सपोजर का समय, बिनिंग को मध्यम और एफ/स्टॉप को 1 पर सेट करें। छवियाँ प्राप्त करें. पहली छवि के बाद, एक्सपोज़र समय को उस से मेल खाने के लिए सेट करें जो स्वचालित रूप से पहली छवि के लिए गणना की गई थी ताकि बाद की छवियों की तुलना सीधे की जा सके। पिक्सेल संतृप्ति के बिना सबसे उज्ज्वल संकेत प्राप्त करने के लिए इष्टतम एक्सपोज़र समय निर्धारित करने के लिए कई एक्सपोज़र समय के साथ छवियों को कैप्चर करना उपयोगी हो सकता है।
    3. चूहों को आइसोफ्लुरेन से निकालें, अपने पिंजरों में लौटें, और तब तक निरीक्षण करें जब तक कि वे जाग न जाएं और एम्बुलेटरी हों।
    4. चरण 4.2.1 से चरणों को दोहराएं जब तक कि सभी समूहों को चित्रित नहीं किया गया है।

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Representative Results

जैसा कि चरण 4.3 में वर्णित है, चूहों को विभिन्न ऊतकों में टी कोशिकाओं की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए इमेजिंग के दौरान विभिन्न स्थितियों में उन्मुख किया जा सकता है। सुपाइन पोजिशनिंग फेफड़ों में टी कोशिकाओं के मूल्यांकन की अनुमति देता है, जो इंजेक्शन के बाद शुरुआती समय बिंदुओं पर आम है। चमड़े के नीचे के जेनोग्राफ्ट के साथ पार्श्व स्थिति का उपयोग ट्यूमर में टी सेल तस्करी का सबसे अच्छा आकलन करने के लिए किया जाता है। इस पांडुलिपि में वर्णित सभी प्रयोगों के लिए मादा C.Cg-Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Sug / JicTac चूहों का उपयोग किया गया था। चित्र 1 एक प्रयोग से छवियों को दिखाता है जिसमें जीडी 2-पॉजिटिव जेनोग्राफ्ट्स वाले चूहों को या तो लूसिफेरस-ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाओं के साथ इलाज किया गया था, जो जीडी 2 बीएसएबी या ल्यूसिफेरस-ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाओं के साथ पूर्व विवो से लैस थे और जीडी 2 बीएसएबी को अलग से इंजेक्शन दिया गयाथा। चित्रा 1 ए से पता चलता है कि सशस्त्र टी कोशिकाएं निहत्थे टी कोशिकाओं (चित्रा 1 बी) की तुलना में ट्यूमर में तेजी से तस्करी करती हैं, जिससे फेफड़े 2 दिन पहले ही निकल जाते हैं। चित्र 1C इस घटना की मात्रा को दर्शाता है। चित्रा 1 ई-जी से पता चलता है कि ल्यूसिफेरस-ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद कम से कम 28 दिनों के लिए टी सेल तस्करी की निगरानी करना संभव है, जिससे शोधकर्ताओं को उपचार के दौरान टी सेल होमिंग और दृढ़ता को ट्रैक करने की अनुमति मिलती है, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) जैसी अन्य तकनीकों के विपरीत जो टी सेल घुसपैठ के केवल एक स्नैपशॉट की अनुमति देते हैं।

विवो में टी सेल तस्करी का आकलन करने की क्षमता के बिना, टी-बीएसएबी का परीक्षण करने वाले शोधकर्ता यह निर्धारित करने में असमर्थ हैं कि टी कोशिकाएं उपचार के दौरान ट्यूमर में घुसपैठ कर रही हैं या नहीं। यदि जानवरों की बलि देने और आईएचसी करने के बिना कोई उपचार विफल हो जाता है, तो यह जानना मुश्किल या असंभव हो सकता है कि क्या विफलता टी सेल तस्करी, दृढ़ता, टी सेल थकावट या किसी अन्य कारण की कमी के कारण थी। चित्रा 2 ए-सी एक प्रयोग दिखाता है जिसमें स्तन कैंसर रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स वाले चूहों को ल्यूसिफेरस-ट्रांसड्यूस्ड मानव टी कोशिकाओं और एचईआर 2-लक्षित बीएसएबी के साथ इलाज किया गया था, जिसमेंएफसी कार्यों को शांत करने के लिए विभिन्न उत्परिवर्तन थे। चित्रा 2 सी से पता चलता है कि एचईआर 2 बीएसएबी के साथ एक अनियंत्रित एफसी के साथ उपचार का नियंत्रण बीएसएबी की तुलना में ट्यूमर के विकास पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा, जबकि एचईआर 2 बीएसएबी के साथ उपचार जिसमें अकेले एन 2 9 7 ए उत्परिवर्तन या के 322 ए उत्परिवर्तन के साथ संयोजन में ट्यूमर के विकास को पूरी तरह से रोकने में सक्षम थे। चित्रा 2 ए और चित्रा 1 बी से पता चलता है कि साइलेंसिंग म्यूटेशन वाले समूहों में, टी कोशिकाओं का ल्यूमिनेसेंस सिग्नल इंजेक्शन के बाद दिन 3 पर एक उच्च शिखर पर पहुंच गया और नियंत्रित बीएसएबी और अनियंत्रित एचईआर 2 बीएसएबी की तुलना में उच्च स्तर पर बना रहा। अनुवर्ती प्रयोगों से पता चला है कि टी कोशिकाओं के साथ इलाज किए गए चूहों में और बीएसएबी के साथ अनियंत्रित एफसीएस के साथ, फेफड़ों के पेरिवस्कुलर क्षेत्रों में टी कोशिकाएं मुराइन न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज से घिरी हुई थीं, जो बीएसएबी-बाध्य टी कोशिकाओं के एफसी-निर्भर अनुक्रम का सुझाव देती हैं जो ट्यूमर में प्रवास को रोकती हैं। ट्यूमर-निवासी एम 2-ध्रुवीकृत मैक्रोफेज के प्रो-ट्यूमरोजेनिक प्रभाव को अच्छी तरह से वर्णित किया गया है। चित्रा 3 ए, बी से पता चलता है कि न्यूरोब्लास्टोमा रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स (पीडीएक्स) वाले चूहों में, एलवाई 6 सी-पॉजिटिव मैक्रोफेज की कमी से ट्यूमर में टी सेल होमिंग में काफी वृद्धि होती है, जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर के विकास में कमी आती है और लंबे समय तक जीवित रहता है (चित्रा 3 सी)18। ओस्टियोसारकोमा पीडीएक्स (चित्रा 3 डी) में यह प्रभाव और भी स्पष्ट है।

विवो में। टी सेल ट्रैकिंग शोधकर्ताओं को यह निगरानी करने की भी अनुमति देती है कि टी सेल ट्रैफिकिंग कैनेटीक्स संरचनात्मक विन्यास सहित एंटीबॉडी इंजीनियरिंग में अन्य चर से कैसे प्रभावित होते हैं। जैसा कि इस लेख की शुरूआत में वर्णित है, हमारी प्रयोगशाला में पिछले काम ने बीएसएबीएस की विवो प्रभावकारिता के लिए ट्यूमर- और टी सेल-बाइंडिंग आर्म्स के द्विसंयोजकता और सीआईएस अभिविन्यास के महत्व को रेखांकित किया। चित्रा 4 से पता चलता है कि ट्यूमर एंटीजन एसटीईएपी 1 (चित्रा 4 ए) को लक्षित करने वाले बीएसएबी के एक पैनल के बीच, आईजीजी-[एल]-एससीएफवी प्रारूप के परिणामस्वरूप टी कोशिकाओं की पहली खुराक के बाद दिन 6 पर काफी अधिक टी सेल घुसपैठ हुई, जो उपचार की अवधि (चित्रा 4 सी) 10 तक बनी रही। इस घटना की भविष्यवाणी इन विट्रो साइटोटॉक्सिसिटी परख (चित्रा 4 बी) द्वारा नहीं की गई थी, जो विवो मॉडल में इन विट्रो परिणामों की पुष्टि करने के महत्व पर जोर देती है।

Figure 1
चित्रा 1: सशस्त्र टी कोशिकाएं बीएसएबी-निर्देशित निहत्थे टी कोशिकाओं की तुलना में तेजी से ट्यूमर होमिंग कैनेटीक्स का प्रदर्शन करती हैं, तेजी से फेफड़ों के अनुक्रम को दरकिनार करती हैं। लुसिफेरस-ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाओं का विस्तार किया गया और बीएसएबी (ल्यूक (+) जीडी 2-ईएटी) से लैस किया गया। ल्यूक (+) जीडी 2-ईएटी (जीडी 2-बीएसएबी / 2×10 7 टी कोशिकाओं के 10 μg) या ल्यूक (+) निहत्थे टी कोशिकाओं (2 x 107 कोशिकाओं) को जीडी 2-बीएसएबी (10 μg) के साथ या बिना जीडी 2-पॉजिटिव न्यूरोब्लास्टोमा पीडीएक्स-असर चूहों में अंतःशिरा रूप से प्रशासित किया गया था जब औसत ट्यूमर की मात्रा 100 मिमी3 तक पहुंच गई थी। (ए) ट्यूमर में जीडी 2-ईईटी तस्करी की बायोल्यूमिनेसेंस छवियां। (बी) जीडी 2 बीएसएबी-निर्देशित निहत्थे टी सेल तस्करी की बायोल्यूमिनेसेंस छवियां दिनों में ट्यूमर में होती हैं। (ग) समय के साथ ट्यूमर में टी सेल घुसपैठ की मात्रा बायोल्यूमिनेसेंस (एन = 5 चूहे/समूह) द्वारा मापी जाती है, जिसे ट्यूमर कंटूर (आरओआई) पर एकीकृत प्रति पिक्सेल कुल प्रवाह या चमक (फोटॉन/एस) के रूप में व्यक्त किया जाता है। (डी) जीडी 2-ईएटी, जीडी 2-बीएसएबी प्लस निहत्थे टी कोशिकाओं, या निहत्थे टी कोशिकाओं के साथ इलाज किए गए व्यक्तिगत चूहों के ट्यूमर विकास वक्र। लक्ष्य एंटीजन-विशिष्ट ईएटी की विवो दृढ़ता का परीक्षण करने के लिए, ल्यूक (+) जीडी 2-ईएटी (जीडी 2-बीएसएबी / 2×10 7 टी कोशिकाओं के 10 μg से लैस) या ल्यूक (+) एचईआर 2-ईएटी (एचईआर 2-बीएसएबी / 2 × 107 टी कोशिकाओं के10 μg) को ओस्टियोसारकोमा टीईओएस 1 सी पीडीएक्स-असर चूहों में अंतःशिरा रूप से प्रशासित किया गया था। गैर-ल्यूसिफेरस ट्रांसड्यूस्ड जीडी 2-ईईटी या एचईआर 2-ईएटी की दो अतिरिक्त खुराक 7 वें और 14 वें दिन दी गईं। (ई) उपचार के बाद ट्यूमर में ल्यूक (+) ईएटी के बायोल्यूमिनेसेंस की मात्रा। (एफ) जीडी 2-ईएटी, एचईआर 2-ईएटी, या निहत्थे टी कोशिकाओं के साथ इलाज किए गए व्यक्तिगत चूहों के ट्यूमर विकास वक्र, या कोई उपचार नहीं। (जी) समय के साथ ट्यूमर में ल्यूक (+) जीडी 2-ईईटी (ऊपरी) या ल्यूक (+) एचईआर 2-ईईटी (निचला) की बायोल्यूमिनेसेंस छवियां। इंजेक्शन के बाद 28 दिनों में ल्यूक (+) ईएटी के बायोल्यूमिनेसेंस का पता लगाया गया था। संक्षेप: ईएटी = एक्स विवो सशस्त्र टी कोशिकाएं; ROI = रुचि का क्षेत्र। त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि को इंगित करती हैं. इस आंकड़े को पार्क एट अल.17 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: डीकेओ चूहों में एचईआर 2-पॉजिटिव मानव स्तन कैंसर पीडीएक्स में टी सेल तस्करी। (ए) टी सेल तस्करी की प्रतिनिधि बायोल्यूमिनेसेंस छवियां। (बी) पूरे ट्यूमर कंटूर (आरओआई) पर एकीकृत प्रत्येक पिक्सेल में कुल प्रवाह या चमक (फोटॉन / एस) के रूप में व्यक्त बायोल्यूमिनेसेंस (एन = 5 चूहों / समूह) द्वारा समय के साथ ट्यूमर में टी सेल तस्करी की मात्रा। (सी) सीटीआरएल बीएसएबी, एचईआर 2 बीएसएबी और इसके एफसी उत्परिवर्ती के साथ उपचार के बाद एचईआर 2-पॉजिटिव स्तन कैंसर पीडीएक्स (एम 37) वृद्धि (एन = 5 चूहे / समूह)। दिखाए गए परिणाम कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि परिणाम हैं। वक्र (एयूसी) के तहत क्षेत्र के आधार पर महत्वपूर्ण अंतर की गणना की गई थी। त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि को इंगित करती हैं. इस आंकड़े को वांग एट अल.7 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: बीएसएबी निर्देशित टी सेल तस्करी और विवो एंटी-ट्यूमर प्रतिक्रिया पर मोनोसाइट की कमी का प्रभाव। (ए) लूसिफेरस ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाओं (ल्यूक (+) टी कोशिकाओं) या ल्यूसिफेरस ट्रांसड्यूस ्ड जीडी 2-बीएसएबी सशस्त्र टी कोशिकाओं (ल्यूक (+) जीडी 2-ईएटी) को न्यूरोब्लास्टोमा रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट (पीडीएक्स) वाले चूहों को एंटी-एलवाई 6 सी एंटीबॉडी के साथ प्रशासित किया गया था। (बी) ट्यूमर के घावों में बायोल्यूमिनेसेंस की निगरानी की गई थी। दिन 7 पर बायोल्यूमिनेसेंस छवियां और ट्यूमर के घावों में बायोल्यूमिनेसेंस की मात्रा का ठहराव। (C) एंटी-Ly6C एंटीबॉडी के साथ GD2-EATs द्वारा विवो एंटी-ट्यूमर प्रतिक्रिया में न्यूरोब्लास्टोमा PDX के खिलाफ परीक्षण किया गया था। (D) एंटी-Ly6C एंटीबॉडी के साथ GD2-EATs के विवो एंटी-ट्यूमर प्रभाव में ओस्टियोसारकोमा PDX के खिलाफ परीक्षण किया गया था, और दीर्घकालिक अस्तित्व का विश्लेषण किया गया था। त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि को इंगित करती हैं. विवो एंटी-ट्यूमर प्रभाव की तुलना एयूसी और उत्तरजीविता वक्र विश्लेषण द्वारा की गई थी। ट्यूमर-घुसपैठ लिम्फोसाइटों को बायोल्यूमिनेसेंस के एयूसी का उपयोग करके परिमाणित किया गया था। आंकड़े में इंगित किए गए नमूनों के बीच अंतर को सांख्यिकीय महत्व के लिए डेटा के दो सेटों के लिए दो-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट और डेटा के तीन या अधिक सेटों के लिए टुकी के पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ एक-तरफा एनोवा का उपयोग करके परीक्षण किया गया था। * पी < 0.05; ** पी < 0.01; पी < 0.001; पी < 0.0001. इस आंकड़े को पार्क एट अल.18 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एंटी-एसटीईएपी 1 टी सेल-एंगेजिंग बाइस्पेसिफिक एंटीबॉडी की एंटी-ट्यूमर गतिविधियां। (ए) एसटीईएपी 1 बीएसएबी के छह संरचनात्मक प्रारूपों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (बी) एसटीईएपी 1 बीएसएबी के विभिन्न प्रारूपों का उपयोग करके ईएफटी सेल लाइनों (टीसी 32 एडी टीसी 71) के खिलाफ एंटीबॉडी-निर्भर टी सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिसिटी (एडीटीसी) परख। प्रभावक से लक्ष्य (ईटी) सेल अनुपात 10: 1 था। (सी) ल्यूक (+) टी कोशिकाओं की बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग (बीएलआई) जो एसटीईएपी 1 बीएसएबी के छह अलग-अलग प्रारूपों से लैस है (ए) दिन 6 और (बी) दिन 18 उपचार के बाद और ट्यूमर के घावों में बायोल्यूमिनेसेंस तीव्रता की मात्रा। लूसिफेरस ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाओं (ल्यूक (+) टी कोशिकाओं) को एसटीईएपी 1 बीएसएबी (एसटीईएपी 1 बीएसएबी / 2 x 107 टी कोशिकाओं के 10 μg) के विभिन्न प्रारूपों से लैस किया गया था और ईएफटी पीडीएक्स (ईएस 15 ए) वाले चूहों को पूरक आईएल -2 (1,000 आईयू / खुराक) के साथ प्रशासित किया गया था। संक्षेप: ईएफटी = ट्यूमर का इविंग सारकोमा परिवार; पीडीएक्स = रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर जेनोग्राफ्ट्स; एसटीईएपी = प्रोस्टेट के छह-ट्रांसमेम्ब्रेन उपकला एंटीजन। त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि को इंगित करती हैं. ट्यूमर-घुसपैठ लिम्फोसाइटों को बायोल्यूमिनेसेंस के वक्र के तहत क्षेत्र की गणना करके निर्धारित किया गया था। आंकड़े में इंगित नमूनों के बीच अंतर को टुकी के पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके सांख्यिकीय महत्व के लिए परीक्षण किया गया था। पी < 0.0001. यह आंकड़ा लिन एट अल.10 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

जबकि टी-बीएसएबी ब्लिनाटुमोमैब को सीडी 19-पॉजिटिव हेमेटोलॉजिकल विकृतियों के लिए अनुमोदित किया गया है, ठोस ट्यूमर में टी-बीएसएबीएस का सफल कार्यान्वयन बहुत अधिक कठिन साबित हुआ है। कैटुमैक्सोमैब, उपकला कोशिका आसंजन अणु (ईपीसीएएम) के खिलाफ निर्देशित एक टी-बीएसएबी, डिम्बग्रंथि के कैंसर के रोगियों में घातक जलोदर के उपचार के लिए अनुमोदित किया गया था, लेकिन बाद मेंवाणिज्यिक कारणों से दवा का उत्पादन रोक दिया गया था। ठोस ट्यूमर के लिए किसी अन्य टी-बीएसएबी को मंजूरी नहीं दी गई है, जो इस प्रकार की चिकित्सा से जुड़ी चुनौतियों को रेखांकित करता है। साइटोकिन रिलीज सिंड्रोम (सीआरएस) के कारण विषाक्तता एक आम मुद्दा है, हालांकि इसे स्टेरॉयड और साइटोकिन इनहिबिटर के साथ प्रबंधित किया जा सकता है। विषाक्तता के अलावा, ठोस ट्यूमर के लिए टी-बीएसएबीएस के परीक्षणों में प्रभावकारिता की कमी आम है। ट्यूमर में टी सेल तस्करी और दृढ़ता को प्रेरित करना मुश्किल साबित हुआ है, संभवतः टीएमई14 में विभिन्न इम्यूनोसप्रेसिव कारकों के कारण। हालांकि, प्रीक्लिनिकल रूप से भी, यह अक्सर स्पष्ट नहीं होता है कि एक टी-बीएसएबी जो विट्रो में अच्छा प्रदर्शन करता है, विवो में ट्यूमर का प्रभावी ढंग से इलाज करने में विफल रहता है।

इस लेख में वर्णित वास्तविक समय में विवो में टी कोशिकाओं को ट्रैक करने की विधि कई कारणों से शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी है। टी सेल होमिंग की निगरानी इस बात की यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान करती है कि क्यों कुछ टी-बीएसएबी सफल या विफल होते हैं, जिससे शोधकर्ताओं को यह निर्धारित करने की अनुमति मिलती है कि टी सेल तस्करी कब शुरू हुई है और टी कोशिकाएं चिकित्सा के दौरान ट्यूमर में कितने समय तक बनी रही हैं। विधि को कई समय बिंदुओं पर दोहराया जा सकता है, जिससे शोधकर्ताओं को कई हफ्तों के दौरान टी सेल होमिंग के कैनेटीक्स को प्लॉट करने की अनुमति मिलती है। ( चित्रा 1 में प्रतिनिधि परिणाम बताते हैं कि टी कोशिकाएं ट्यूमर में कम से कम 28 दिनों तक बनी रहती हैं। ल्यूसिफेरस-ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाओं की विवो इमेजिंग में टी सेल घुसपैठ के हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए उपचार के दौरान जानवरों की बलि देने की आवश्यकता भी समाप्त हो जाती है, जिससे समग्र लागत और प्रति प्रयोग आवश्यक जानवरों की संख्या कम हो जाती है। क्योंकि इमेजिंग को जितनी बार आवश्यक हो दोहराया जा सकता है, यह हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण की तुलना में टी सेल होमिंग कैनेटीक्स के बहुत आसान और अधिक गहन मूल्यांकन की अनुमति देता है, जो अनिवार्य रूप से एक ही समय बिंदु का स्नैपशॉट है जब तक कि कई जानवरों को अलग-अलग समय बिंदुओं पर बलिदान नहीं किया जाता है।

इस विधि का सबसे महत्वपूर्ण कदम ल्यूसिफेरस निर्माण के साथ टी कोशिकाओं का सफल पारगमन है। असफल पारगमन से टी सेल की मृत्यु हो सकती है या विवो में ल्यूसिफेरस सिग्नल की कमी हो सकती है। यदि पारगमन के बाद टी कोशिकाओं का अपेक्षित विस्तार नहीं हो रहा है, तो ट्रांसडक्शन प्रक्रिया से संभावित विषाक्तता को कम करने के लिए वायरल टिटर को कम करना संभव हो सकता है जिसके साथ उन्हें ट्रांसड्यूस किया जाता है। एक अन्य दृष्टिकोण टी सेल विस्तार चरणों के बीच एक और दिन इंतजार करना होगा ताकि टी कोशिकाओं को एक बड़े सेल कल्चर पोत में विस्तारित करने से पहले अधिक सुसंगत बनने की अनुमति मिल सके। चूहों में टी कोशिकाओं को इंजेक्ट करने से पहले, फ्लो साइटोमेट्री (टीडी टमाटर रिपोर्टर की अभिव्यक्ति की जांच के लिए) या बायोल्यूमिनेसेंट प्लेट रीडर का उपयोग करके पारगमन सफलता की पुष्टि करना एक अच्छा विचार है। यदि ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाएं अभी भी बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग के साथ दिखाई नहीं दे रही हैं, तो यह संभव हो सकता है कि इस तकनीक का उपयोग करके पता लगाने के लिए टी कोशिकाओं की संख्या बहुत कम हो। राबिनोविच एट अल 10 मुराइन टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए बढ़े हुए जुगनू ल्यूसिफेरस का उपयोग करके एक समान विधि का वर्णन करते हैं, जिसे संवेदनशीलता के इस स्तर की आवश्यकता वाली स्थितियों में लागू किया जा सकताहै।

सारांश में, ल्यूसिफेरस-ट्रांसड्यूस्ड टी कोशिकाओं की विवो ट्रैकिंग में कैंसर के इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड माउस मॉडल में टी-बीएसएबीएस का अध्ययन करने वाले शोधकर्ताओं के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है। ऊपर चर्चा किए गए अनुप्रयोगों के अलावा, टी सेल ट्रैकिंग की इस विधि को चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) टी कोशिकाओं पर लागू किया गया है और इसे दत्तक रूप से स्थानांतरित टी कोशिकाओं का उपयोग करके सिंजेनिक माउस मॉडलपर लागू किया जा सकता है। हमें उम्मीद है कि यह रणनीति ट्रांसलेशनल टी-बीएसएबी विकसित करने वाले शोधकर्ताओं के लिए सहायक होगी और ठोस ट्यूमर वाले रोगियों में इन उपचारों की बढ़ती सफलता का नेतृत्व करेगी।

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Disclosures

एनकेसी वाई-एमएबीएस थेरेप्यूटिक्स से वाणिज्यिक अनुसंधान अनुदान प्राप्त करने की रिपोर्ट करता है। एनकेसी एमएसके द्वारा वाई-एमएबीएस थेरेप्यूटिक्स, बायोटेक फार्माकॉन / लाललेमंड और एबीप्रो-लैब्स को लाइसेंस प्राप्त पेटेंट का आविष्कारक और मालिक है। एमएसके और एनकेसी के वाई-एमएबीएस में वित्तीय हित हैं। एनकेसी यूरेका थेरेप्यूटिक्स से स्टॉक विकल्प प्राप्त करने की रिपोर्ट करता है। एचएफजी और एमईसी के पास कोई प्रासंगिक खुलासा नहीं है।

Acknowledgments

व्लादिमीर पोनोमारेव इस लेख के प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में वर्णित प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले ल्यूसिफेरस संरचनाओं को साझा करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
293T cells ATCC CRL-11268
BSA Sigma Aldrich A7030-10G
CD3/CD28 beads Gibco (ThermoFisher) 11161D
D-Luciferin, Potassium Salt Goldbio LUCK-1G
DMEM Gibco (ThermoFisher) 11965092
DNA in vitro transfection reagent (polyjet) SignaGen Laboratories SL100688
EDTA Sigma Aldrich E9884-100G
FBS Gibco (ThermoFisher) 10437028
Gag/pol plasmid Addgene 14887
GFP plasmid Addgene 11150-DNA.cg
Penicilin-Streptomycin Gibco (ThermoFisher) 15140122
Recombinant human IL-2 R&D Systems 202-IL-010/CF
Retronectin Takara T100B
Trypsin Gibco (ThermoFisher) 25-300-120
VSV-G plasmid Addgene 8454

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 195 द्विविशिष्ट एंटीबॉडी टी सेल एंगेजर्स ल्यूसिफेरस टी कोशिकाएं जेनोग्राफ्ट्स।
ल्यूसिफेरस-ट्रांसड्यूस्ड मानव टी कोशिकाओं का उपयोग करके द्वि-विशिष्ट एंटीबॉडी-प्रेरित टी सेल तस्करी पर नज़र रखना
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Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F.,… More

Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. K. V. Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells. J. Vis. Exp. (195), e64390, doi:10.3791/64390 (2023).

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