Summary
כאן, אנו בודקים את המסת גרגרי רודיולה (RG) במבחנה, מציירים עקומות המסה של סלידרוסיד, חומצה גאלית ואתיל גלאט במים טהורים במיוחד, ומתאימים את העקומות למודלים מתמטיים שונים. פרוטוקול זה מספק מידע והדרכה עבור מחקרי שקילות ביולוגית in vivo ומחקרי מתאם in vivo-in vitro של RG.
Abstract
הרכב התרופה הטיבטית גרגרי רודיולה (RG) הוא מורכב, וקשה לקבוע את האיכות הכוללת של RG. לכן, קביעת שיטה לקביעת פירוק רב-רכיבי במבחנה של RG היא בעלת משמעות רבה לבקרת איכות. מחקר זה משתמש בשיטת ההנעה השנייה של הכלל הכללי הרביעי 0931 מהפרמקופיאה הסינית (מהדורת 2020), התואמת למנגנון 2 של הפרמקופיאה האמריקאית (USP). מנגנון הפירוק הוגדר למהירות סיבוב של 100 סל"ד עם מים אולטרה-טהורים כאמצעי המסה. נפח דגימה של 1 מ"ל נאסף בכל נקודת זמן. יתר על כן, המסה מצטברת של חומצה גאלית, סלידרוסיד וחומצה גאלית אתילית ב- RG בנקודות זמן שונות נקבעה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC). לבסוף שורטטו עקומות ההתמוססות, והעקומות הותאמו למשוואות גומפרץ, גומפרץ, לוגיסטיקה וויבול. התוצאות הראו כי המסה מצטברת של חומצה גאלית ב- RG הייתה מעל 80% בדקה אחת, המסה מצטברת של חומצה סלידרוזית וחומצה גאלית אתילית הייתה מעל 65% לאחר 5 דקות, וההמסה המצטברת של כל רכיב מדד פחתה לאחר 30 דקות. התאמת העקומה הראתה כי משוואת GompertzMod היא המודל המתאים ביותר עבור כל רכיב אינדקס של RG. לסיכום, שיטת בדיקת הפירוק המתוארת בפרוטוקול זה היא פשוטה, מדויקת ואמינה. זה יכול לאפיין את התנהגות הפירוק של רכיבי המדד ב- RG in vitro, המספק התייחסות מתודולוגית לבקרת איכות של RG והערכת איכות של תרכובות אתניות אחרות.
Introduction
בסין שכיחות מחלות הלב וכלי הדם ממשיכה לעלות, ושיעורי התחלואה והתמותה ממחלות לב וכלי דם מדורגים במקום הראשון בקרב תושבי סין1. אנגינה פקטוריס של מחלת לב כלילית נגרמת על ידי היצרות לומינלית עקב טרשת עורקים כלילית, מה שמוביל אספקת דם כלילית לא מספקת יחסית איסכמיה שריר הלב היפוקסיה2. בשנים האחרונות, ההשפעה המרפאת של הרפואה הסינית המסורתית בטיפול במחלת לב כלילית מוכרת על ידי רופאים רבים3.
לרפואה הסינית המסורתית תפקיד חשוב בהקלת הסימפטומים הקליניים ובשיפור איכות החיים של החולים4. גרגרי רודיולה (RG) מופקים ומזוקקים מצמח המרפא של הרמה הטיבטית Rhodiola rosea L. המרכיבים העיקריים של RG הם סלידרוסיד, רודיוסין ופלבנואידים 5,6. RG יש את ההשפעה של תוספת Qi7 והפעלה וקידום זרימת הדם כדי להקל על הכאב. מבחינה קלינית, הוא משמש לטיפול בחסימות חזה הנגרמות על ידי מחסור בצ'י וקיפאון דם, מחלת לב כלילית, אנגינה פקטוריס8. קביעת התוכן לבדה אינה משקפת במלואה את האיכות הפנימית של התרופות, שכן הן ההתפוררות והן הפירוק במבחנה יכולים להשפיע על הזמינות הביולוגית והיעילות של התרופות 9,10. שיטות הבדיקה לפירוק הרפואה הסינית כוללות את שיטת הסל המסתובב, שיטת המשוט ושיטת הכוס הקטנה. החיסרון של שיטת הסל המסתובב הוא שרק החלק החיצוני של הסל המסתובב בא במגע עם תווך הפירוק במהלך הסיבוב, דבר שאינו משקף את התנהגות הפירוק בעולם האמיתי. שיטת ההנעה יכולה להתגבר על החיסרון הנ"ל, מה שהופך אותה למתאימה יותר משיטת הסל לחלק מתכשירי הרפואה הסינית המוצקה11. נכון לעכשיו, אין דו"ח על ניתוח פירוק חוץ גופי של RG. על מנת לשלוט באיכות RG באופן מקיף יותר, נחקרה התנהגות הפירוק של שלושת מרכיבי האינדקס (חומצה גאלית, סלידרוסיד ואתיל גלאט) ב-RG. מחקר זה מספק נתונים לבקרת האיכות של RG והתייחסות מתודולוגית להערכת איכות של תכשירי תרכובות אתניות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת פתרון
- הכינו את תמיסת מלאי חומרי הייחוס: שקלו 10.6 מ"ג סלידרוסיד, 5.24 מ"ג חומצה גאלית ו-5.21 מ"ג חומצה גאלית בנפרד על איזון אנליטי אלקטרוני והוסיפו אותם בנפרד לצלוחית נפחית של 5 מ"ל. לאחר מכן, הוסף מתנול כיתה HPLC להתמוסס ולדלל ל 5 מ"ל. לבסוף, יש לנער היטב כדי לקבל את תמיסת מלאי חומרי הייחוס עם ריכוזי מסה של 2.120 מ"ג/מ"ל, 1.048 מ"ג/מ"ל ו-1.042 מ"ג/מ"ל, בהתאמה.
הערה: תמיסת מלאי חומרי הייחוס מכילה 2.120 מ"ג/מ"ל סלידרוסיד, 1.048 מ"ג/מ"ל חומצה גאלית ו-1.042 מ"ג/מ"ל אתיל גלאט כתמיסת המניות של כל תמיסה בעקומת התקן הבאה. - הכן את הפתרון לדוגמה לבדיקה. חלץ 2.8 גרם RG (רשימת חומרים) עם 10 מ"ל מתנול באיכות HPLC באמצעות מכונת ניקוי קולית (הספק: 200 W, תדר: 40 kHz) למשך 30 דקות, ולאחר מכן סנן אותו עם מסנן 0.22 מיקרומטר לבדיקת הסתגלות המערכת.
- הכינו תמיסת ייחוס מעורבת המכילה 0.590 מ"ג/מ"ל סלידרוסיד, 2.030 מ"ג/מ"ל חומצה גאלית ו-1.930 מ"ג/מ"ל אתיל גלאט.
הערה: כל תקן (2.950 מ"ג סלידרוסיד, 10.150 מ"ג חומצה גאלית ו-9.650 מ"ג חומצה אתילית גאלית) מומס בבקבוק נפחי של 5 מ"ל במתנול ברמת HPLC כמדיום המסה. - קבל את התוכן התיאורטי של כל מרכיב אופייני של RG עבור מיצוי מים טהורים במיוחד.
- מניחים 2.8 גרם RG בצלוחית חרוטית של 500 מ"ל, מוסיפים 200 מ"ל מים טהורים במיוחד, ומוציאים אולטרה-סאונד (הספק: 200 W, תדר: 40 קילוהרץ) למשך 60 דקות. לאחר מכן, סנן אותו עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
- לקבוע את התוכן של פתרון הבדיקה על פי המשוואה הליניארית המתקבלת בניסוי הבא.
2. מצב כרומטוגרפי
- הגדר את התנאים הכרומטוגרפיים כפי שמוצג בטבלה 1 עבור כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים. לפרטים על המכשיר שבו נעשה שימוש, עיין בטבלת החומרים.
3. בדיקת הסתגלות המערכת
- לחקור את הקשר הלינארי.
- דללו את תמיסות מלאי הייחוס של חומצה גאלית ואתיל גלאט פי 5, 10, 25, 50 ו-125, ואת תמיסות מלאי הייחוס של סלידרוסייד פי 2, 4, 8, 16 ו-32 פעמים כדי לקבל את תמיסת ריכוז השיפוע לשרטוט עקומה סטנדרטית.
הערה: התאמת יחס הדילול של העקומה הסטנדרטית בהתאם לניסוי המקדים של הטיפול בדגימה. בניסוי הראשוני, פתרונות המניות של שלושת התקנים דוללו תחילה 5, 10, 25, 50 ו-125 פעמים, ולאחר מכן שורטטה עקומת התקן הראשונה. עם זאת, כאשר זוהה ריכוז דגימת הבדיקה, נמצא כי ריכוזי הסלידרוזיד אינם נמצאים בטווח הליניארי של עקומה סטנדרטית זו, ולכן הותאמו הריכוזים כך שיכללו אותם בעקומה. לסיכום, הניסויים המקדימים לעיל שימשו לקביעת ריכוזי הדילול הסופיים של שלוש דגימות הבדיקה למחקרים הניסיוניים הבאים.
- דללו את תמיסות מלאי הייחוס של חומצה גאלית ואתיל גלאט פי 5, 10, 25, 50 ו-125, ואת תמיסות מלאי הייחוס של סלידרוסייד פי 2, 4, 8, 16 ו-32 פעמים כדי לקבל את תמיסת ריכוז השיפוע לשרטוט עקומה סטנדרטית.
- בדיקות מדויקות: הזריקו 10 μL של תמיסת הייחוס המעורבת למערכת HPLC שש פעמים ביום והריצו את הדגימות עם אותם תנאי HPLC המתוארים בשלב 2.1. הקלט את אזור השיא של כל רכיב תכונה.
- ניסויי בדיקת יציבות: הזריקו 10 מיקרוליטר של תמיסת הדגימה שהוכנה וקבעו את אזורי השיא של HPLC בהתאם לתנאים הכרומטוגרפיים לאחר 0 שעות, 6 שעות, 10 שעות, 12 שעות, 14 שעות, 16 שעות, 18 שעות, 20 שעות ו-24 שעות, בהתאמה.
הערה: אזורי השיא נרשמים באופן אוטומטי על-ידי מערכת HPLC. - בדיקת שחזור: קח שש דגימות של אותה אצווה של RG כדי להכין את פתרון דגימת הבדיקה בהתאם לשיטה בשלב 1.2. יש להזריק 10 μL מכל דגימה למערכת HPLC. הפעל את הדגימות כמתואר בשלב 2.1 וקבע את יכולת השחזור.
הערה: יכולת החזרה הוערכה על ידי השוואת הבדלי הריכוז בין שש הדגימות. - ניסוי שחזור
- הכינו שש מנות של אותה אצווה של RG לפתרון הבדיקה. לאחר מכן, הוסף כ -50% מחומר הייחוס של כל רכיב מדד בתמיסת הבדיקה כדי לחשב את שיעור ההתאוששות. הפעל דגימות אלה במערכת HPLC עם אותם תנאים המתוארים בשלב 2.1.
- חשב את קצב ההתאוששות.
הערה: קצב התאוששות = (C - A) / B x 100, כאשר A הוא כמות הרכיב שיש למדוד בתמיסת הבדיקה, B הוא כמות חומר הייחוס שנוספה ו- C הוא הערך הנמדד של התמיסה המכילה את חומר הייחוס ואת דגימת RG. עיין בשלב 2.1 לקבלת התנאים הכרומטוגרפיים לביצוע השלבים לעיל (כלומר, שלבים 3.1-3.5).
4. בדיקת המסה חוץ גופית
- בצע את בדיקת הפירוק בשיטת ההנעה של השיטה השנייה של כלל כללי 0931 מהפרמקופיאה הסינית (מהדורת 2020)12.
הערה: טכניקת הדגימה והציוד: למנגנון המסת התרופות (טבלה של חומרים) יש המסה, משוט, מערכת בקרת טמפרטורה ומערכת התאמת מהירות. לפני תחילת ניסוי ההתמוססות, המים מחוממים מראש לטמפרטורה מוגדרת, ולאחר מכן נקבעת המהירות המתאימה. התחל להקליט את השעה מיד לאחר הוספת RG. - הוסף 100 מ"ל של מים טהורים במיוחד לתוך המסה של מנגנון המסת התרופה ולשמור על הטמפרטורה ב 37 °C ± 0.5 °C (75 °F). הגדר את מהירות הסיבוב ל- 100 סל"ד.
הערה: למנגנון הפירוק יש מכשיר חימום המאפשר להגדיר את הטמפרטורה בתוך המערכת. לא היה הבדל משמעותי בקצב המסת הסלידרוזיד במים, מיץ קיבה מלאכותי (16.4 מ"ל חומצה הידרוכלורית מדוללת [234 מ"ל חומצה הידרוכלורית מרוכזת מדוללת ל-1000 מ"ל עם מים] עם כ-800 מ"ל מים ו-10 גרם פפסין, מזועזע היטב ומדולל במים עד 1,000 מ"ל), ומיץ מעיים מלאכותי (חיץ פוספט [pH 6.8] המכיל טריפסין)13. המים הזמינים ביותר (אולטרה טהורים) נבחרו כמדיום המסה. - הוסיפו 2.8 גרם RG לכוס המסה והתחילו להקליט את משך ההמסה באופן מיידי. אספו סך של 1 מ"ל של הדגימה עם מזרק (ראו טבלת חומרים) בדקה, 5 דקות, 10 דקות, 20 דקות, 30 דקות ו-60 דקות, והשלימו את הנפח בכוס ההמסה עם מדיום המסה באותה טמפרטורה באופן מיידי.
הערה: צינור הדגימה בכוס ההמסה אינו יכול לאסוף נפחי דגימה קטנים, ולכן המזרק משמש לאיסוף הדגימה. יש לאסוף דגימות במהירות כדי למנוע החמצת נקודות זמן איסוף שצוינו. - מיד לסנן את הדגימות שנאספו דרך קרום microporous 0.22 מיקרומטר ולקחת את הסינון הבא. קבע את התוכן של כל רכיב בכל נקודת זמן לפי HPLC (לפי שלב 2.1) וחשב את הפירוק המצטבר.
- כדי לחשב את הפירוק המצטבר, חשב את הפירוק של כל נקודת זמן (Xn):
Xn = A / B x 100, כאשר A היא כמות הרכיבים הנמדדת בכל נקודת זמן ו- B הוא התוכן התיאורטי של כל רכיב. - לאחר מכן, חשב את הפירוק המצטבר (Y):
Y = X n + (X 1 + ... + Xn-1) x V 2 / V 1, כאשר V 1 הוא הנפח הכולל של מדיום הפירוק ו- V 2 הוא נפח המומס שנוסף לאחר כל דגימה.
הערה: בשל ערכי התגובה הנמוכים של סלידרוסיד וחומצה גאלית בכרומטוגרמה, ההמסה המצטברת של סלידרוסיד ואתיל גלאט בנקודת הזמן של דקה אחת לא שורטטה בעקומת ההתמוססות.
- כדי לחשב את הפירוק המצטבר, חשב את הפירוק של כל נקודת זמן (Xn):
5. התאמת מודל הפירוק
- יבא את נתוני הפירוק המצטברים בכל נקודת זמן לתוכנת ניתוח הנתונים.
- השתמש בתוסף ניתוח פירוק תרופות בתוכנת ניתוח הנתונים כדי להתאים למשוואת GompertzMod, משוואת Gompertz, המשוואה הלוגיסטית ומשוואת Weibull14. ככל שהערך של R2 גדול יותר, כך אפקט התאמת העקומה טוב יותר.
- הפעל את התוכנה, בחר בחלון Book1 כדי להיכנס לחלון עריכת נתוני מקור .
- בעמודה הראשונה A(X)-Long Name input Time, הגדר Time כזמן והזן כל זמן לקביעת פירוק. הזן נתונים בעמודה השניה B(Y)-Long Name, הגדר נתונים כפירוק המצטבר, הזן את אחוז הפירוק המצטבר של כל זמן קביעת פירוק.
- לאחר הזנת הנתונים, בחר את העמודה A(X ) ו - B(Y), ובחר את התוסף Drug Dissolution Analysis בשורת התפריטים של התוכנה ולחץ על Fit Dissolution Data > Concatenate Fit > OK. התוכנה מייצרת את התוצאות המתאימות של כל דגם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר זה, הדיוק, היציבות, החזרתיות ושחזור הדגימה של RG היו כולם בטווח המתודולוגי שצוין בפרמקופיאה הסינית (Volume 4, 2020)12, מה שמצביע על כך שהשיטה אפשרית. לאחר ניפוי באגים חוזר, נקבע כי שיפוע האלוציה ששימש במחקר זה היה ברזולוציה טובה (איור 1) עבור שלושת רכיבי האינדקס ב-RG. לשלושת רכיבי המדד ב-RG היה קשר ליניארי טוב בטווח ריכוז מסוים (טבלה 2). תוצאות בדיקת הדיוק (טבלה 3) הראו כי סטיית התקן היחסית (RSD) של אזורי השיא של סלידרוזיד, חומצה גאלית ואתיל גלאט הייתה 1.95%, 2.83% ו-1.42%, בהתאמה, מה שמצביע על כך שהדיוק של המכשיר היה טוב. תוצאות בדיקת היציבות (טבלה 4) הראו כי ה-RSD של אזורי השיא של סלידרוסיד, חומצה גאלית ואתיל גלאט היו 2.37%, 2.47% ו-2.82%, בהתאמה, מה שמצביע על כך שתמיסת הדגימה הייתה יציבה תוך 24 שעות. תוצאות בדיקת החזרתיות (טבלה 5) הראו כי ה-RSD של אזורי השיא של סלידרוסיד, חומצה גאלית ואתיל גלאט היו 2.79%, 2.67% ו-1.55%, בהתאמה, מה שמראה שהחזרתיות של שיטה זו הייתה טובה. תוצאות ניסוי השחזור הצביעו על כך שההתאוששות הממוצעת של סלידרוסיד, חומצה גאלית ואתיל גלאט הייתה 99.91%, 100.40% ו-102.80%, בהתאמה (טבלה 6).
ניסוי המסת המבחנה במחקר זה היה לקבוע את התוכן של שלושה מרכיבים אופייניים (סלידרוסיד, חומצה גאלית ואתיל גלאט) בדגימות RG בכל נקודת זמן על ידי HPLC, ולאחר מכן לחשב את ההמסה המצטברת. עקומות ההתמוססות של כל רכיב מוצגות באיור 2. לאחר הכנסת הדגימה לכוס ההמסה, ההמסה המצטברת של חומצה גאלית ב-RG הייתה מעל 80% לאחר דקה. הפירוק המצטבר של סלידרוסיד וחומצה גאלית אתילית היה מעל 65% לאחר 5 דקות, אשר בא לידי ביטוי בנתונים כי כל רכיב מדד יכול להתמוסס מעל 60% לאחר 5 דקות. עם זאת, הפירוק המצטבר של כל רכיב מדד פחת לאחר 30 דקות. יתר על כן, עקומות הפירוק הותאמו למשוואת GompertzMod, משוואת Gompertz, המשוואה הלוגיסטית ומשוואת Weibull. התוצאות הראו כי משוואת GompertzMod הייתה המודל המתאים ביותר לשלושת מרכיבי האינדקס (סלידרוסיד, חומצה גאלית ואתיל גלאט) ב-RG. תוצאות מודל הפירוק של שלושה רכיבי מדד ב-RG מוצגות בטבלה 7.
איור 1: כרומטוגרמות מייצגות של שלושת המרכיבים האופייניים לאחר קביעת התנאים הכרומטוגרפיים שהוזכרו בשלב 2.1 (n = 1). (A) הכרומטוגרמה של תמיסת הדגימה. שיא 1 הוא חומצה גאלית, שיא 2 הוא סלידרוסיד, ושיא 3 הוא אתיל גלאט. (B) הכרומטוגרמה של תמיסת הייחוס. שיא 1 הוא חומצה גאלית, שיא 2 הוא סלידרוסיד, ושיא 3 הוא אתיל גלאט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: עקומת המסה של רכיבים אופייניים (n = 4). (A) המסה מצטברת של חומצה גאלית בדקה, 5 דקות, 10 דקות, 20 דקות, 30 דקות ו-60 דקות לאחר מתן התרופה. (B) המסה מצטברת של סלידרוסיד ב-5 דקות, 10 דקות, 20 דקות, 30 דקות ו-60 דקות לאחר מתן התרופה. (C) פירוק מצטבר של אתיל גלאט ב-5 דקות, 10 דקות, 20 דקות, 30 דקות ו-60 דקות לאחר מתן התרופה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| תנאי | פרמטר |
| עמודה כרומטוגרפית | C18 (4.6 מ"מ x 250 מ"מ, 5 מיקרומטר) |
| שלב המובייל | אצטוניטריל (A)-0.2% חומצה אצטית (B) |
| אלוציה הדרגתית | 0–5 דקות, 0%–4%A; 5–15 דקות, 4%–5%A; 15–20 דקות, 5%–7%A; 20–30 דקות, 7%–14%A; 30–40 דקות, 14%–13%A; 40–45 דקות, 13%–4%A |
| קצב זרימה | 1.0 מ"ל/דקה |
| טמפרטורת עמודה | 30°C |
| זיהוי אורך גל | 275 נאנומטר |
| נפח לדוגמה | 10 מיקרוליטר |
טבלה 1: התנאים הכרומטוגרפיים שנקבעו בניסוי זה. הטבלה מפרטת את פרטי העמודה הכרומטוגרפית, הפאזה הניידת, השיפוע, קצב הזרימה, טמפרטורת העמודה, אורך גל הגילוי ונפח הדגימה.
| רכיבי אינדקס | משוואה ליניארית | R2 | טווח ליניאריות (מ"ג/מ"ל) |
| סלידרוסייד | Y = 2221X - 19.742 | 0.9996 | 0.06625–2.12 |
| חומצה גאלית | Y = 29497X - 224 | 0.9997 | 0.008384–1.048 |
| אתיל גלאט | Y = 28902X - 86.171 | 0.9999 | 0.008336–1.042 |
טבלה 2: הקשר הליניארי בין רכיבי המדד ב-RG. לשלושת מרכיבי המדד ב-RG היה קשר ליניארי טוב בטווח ריכוז מסוים.
| שטח שיא של רכיבי המדד | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD % |
| סלידרוסייד | 900.6 | 917.4 | 899.8 | 917.4 | 940.1 | 890.5 | 1.95 |
| חומצה גאלית | 6430.2 | 6544.2 | 6281.2 | 6327.7 | 6142.5 | 6636.9 | 2.83 |
| אתיל גלאט | 12748.9 | 12833.1 | 13190.4 | 13152.3 | 13128.3 | 13090.5 | 1.42 |
טבלה 3: תוצאות המדידה המדויקת. ה-RSD של אזורי השיא של סלידרוסיד, חומצה גאלית ואתיל גלאט היו 1.95%, 2.83% ו-1.42% (n = 6).
| שטח שיא של רכיבי המדד | 0 שעות | 6 שעות | 12 שעות | 18 שעות | 21 שעות | 24 שעות | RSD % |
| סלידרוסייד | 486.6 | 509 | 479 | 505.1 | 502.8 | 492 | 2.37 |
| חומצה גאלית | 3236.5 | 3359.8 | 3152.2 | 3347.6 | 3337 | 3319.9 | 2.47 |
| אתיל גלאט | 442 | 413 | 421 | 429 | 443.8 | 436 | 2.82 |
טבלה 4: תוצאות בדיקת היציבות. ה-RSD של אזורי השיא של סלידרוסיד, חומצה גאלית ואתיל גלאט היו 2.37%, 2.47% ו-2.82% (n = 6).
| שטח שיא של רכיבי המדד | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD % |
| סלידרוסייד | 1337.3 | 1276.5 | 1283.7 | 1286.8 | 1242.6 | 1237.2 | 2.83 |
| חומצה גאלית | 8432.1 | 8976.1 | 8792 | 9083.1 | 9040.2 | 8751.4 | 2.74 |
| אתיל גלאט | 422.8 | 415.3 | 421.9 | 416.3 | 428.9 | 406.1 | 1.87 |
טבלה 5: תוצאות מבחן השחזור. ה-RSD של אזורי השיא של סלידרוזיד, חומצה גאלית ואתיל גלאט היו 2.83%, 2.74% ו-1.87% (n = 6).
| תוכן ידוע (מ"ג) | הוספת כמות (מ"ג) | מדידת כמות (מ"ג) | מחלימים (%) | ממוצע ההחלמה (%) | RSD (%) |
| 0.5838 | 0.406 | 0.9783 | 97.18 | 99.91 | 2.70 |
| 0.5743 | 0.406 | 0.9984 | 104.47 | ||
| 0.5751 | 0.406 | 0.9755 | 98.63 | ||
| 0.5764 | 0.406 | 0.9776 | 98.81 | ||
| 0.5906 | 0.406 | 0.991 | 98.6 | ||
| 0.5802 | 0.406 | 0.9934 | 101.77 | ||
| 0.1234 | 0.118 | 0.2424 | 100.87 | 100.4 | 1.67 |
| 0.1214 | 0.118 | 0.2428 | 102.85 | ||
| 0.1216 | 0.118 | 0.2396 | 100 | ||
| 0.1218 | 0.118 | 0.2389 | 99.19 | ||
| 0.1249 | 0.118 | 0.2406 | 98.09 | ||
| 0.1226 | 0.118 | 0.2423 | 101.4 | ||
| 0.0221 | 0.386 | 0.4232 | 103.91 | 103.8 | 2.02 |
| 0.0218 | 0.386 | 0.4115 | 100.97 | ||
| 0.0218 | 0.386 | 0.4176 | 102.55 | ||
| 0.0218 | 0.386 | 0.4337 | 106.7 | ||
| 0.0224 | 0.386 | 0.4302 | 105.65 | ||
| 0.022 | 0.386 | 0.4198 | 103.05 |
טבלה 6: תוצאות מדידת קצב התאוששות הדגימה. ה-RSD של שיעור ההחלמה של סלידרוסיד, חומצה גאלית ואתיל גלאט היו 2.70%, 1.67% ו-2.02%, בהתאמה.
| רכיבי אינדקס | משוואת פירוק | ₪2 |
| חומצה גאלית | GompertzMod | 0.4978 |
| גומפרץ | 0.3740 | |
| לוגיסטיים | 0.3739 | |
| וויבול | 0.3739 | |
| סלידרוסייד | GompertzMod | 0.9894 |
| גומפרץ | 0.9783 | |
| לוגיסטיים | 0.9781 | |
| וויבול | 0.9781 | |
| אתיל גלאט | GompertzMod | 0.9895 |
| גומפרץ | 0.9852 | |
| לוגיסטיים | 0.9853 | |
| וויבול | 0.9853 |
טבלה 7: תוצאות התאמת עקומה של מודל המסה של שלושה רכיבי אינדקס במים אולטרה-טהורים. התוצאות המתאימות של כל רכיב אינדקס של RG היו הטובות ביותר עם משוואת GompertzMod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדיקת ההמסה היא שיטה אידיאלית במבחנה המדמה התפוררות ופירוק של תכשירים אוראליים מוצקים במערכת העיכול15. זהו מדד חשוב להערכה ובקרה של איכות של תכשירים אוראליים מוצקים. לכן, מבחן הפירוק ממלא תפקיד חיוני בפיתוח תכשירים אוראליים מוצקים16. בפרט, עם התפתחות טכנולוגיית בקרת האיכות של הרפואה הסינית המסורתית (TCM), קביעת הפירוק יושמה בהדרגה במחקרי הסינון של תכשירי תרכובת הרפואה הסינית והאתנית17,18.
נכון לעכשיו, קביעת הפירוק של TCM ורפואה אתנית במבחנה מבוססת בעיקר על איתור מרכיב מדד יחיד. עם זאת, ההכנה המוצקה של הרפואה הסינית המסורתית והרפואה האתנית היא מורכבת, ופירוקן מושפע מגורמים רבים (למשל, טמפרטורה, מדיום המסה וכו ') והרכבם הכימי המורכב19,20. לכן, זיהוי של רכיבים מרובי מדדים יכול לשקף טוב יותר את ההשפעה ההדדית ואת ההבדל פירוק של רכיבים שונים. במאמר זה נמדד מבחן המסת המבחנה של שלושת מרכיבי האינדקס (חומצה גאלית, סלידרוסיד ואתיל גלאט) ב-RG, ושורטטו עקומות הפירוק של שלושת המרכיבים האופייניים הללו, שסיפקו התייחסות לבקרת האיכות של RG.
במהלך הניסוי יש לציין במיוחד את שתי הנקודות הבאות. ראשית, בעת הדגימה לבדיקת ההמסה על פי הפרמקופיאה הסינית מהדורת 202012, יש לחדש נפח שווה של מדיום המסה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ± 0.5 מעלות צלזיוס מיד לאחר איסוף הדגימה, שהוא שלב המפתח בתהליך הניסוי. שנית, יש לאסוף את הדגימות מאזור באמצע הדרך בין החלק העליון של הלהב לבין פני השטח של תווך ההמסה, ~ 10 מ"מ מהקיר הפנימי של ההמסה. הסיבה לכך היא כי יש שיפוע ריכוז מתחילת הפירוק של התרופה לזמן פירוק מוחלט. שיפוע הריכוז עומד ביחס הפוך למהירות הערבוב, ולכן ריכוז התרופה המומסת הוא הגבוה ביותר ליד התרופה הלא מומסת והנמוך ביותר היכן שהערבוב חלש. לכן, יש להימנע מדיגום בשני הקצוות הללו21.
למרות שהזיהוי של רכיבים רב-אינדקסיים יכול לשקף טוב יותר את השונות בפירוק של רכיבים שונים של פורמולציות מורכבות של TCM/רפואה אתנית בהשוואה לזיהוי של רכיבים בעלי אינדקס יחיד, יש לו מגבלות מסוימות. קיים פוטנציאל לטעויות אנוש בעת שימוש במזרק לאיסוף הדגימות. ניתן לשפר את הדיוק והדיוק של המדידה אם ניתן ליישם מדידות אוטומטיות של פירוק תרופות22.
לסיכום, ביססנו שיטת פירוק חוץ גופית לקביעת רכיבים רב-אינדקסיים ב-RG, המספקת בסיס למחקרים נוספים על RG. ניסוי זה יכול לספק מידע והדרכה למחקרי שקילות ביולוגית in vivo ולמחקרי מתאם in vivo-in vitro של תרופות אתניות אחרות23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2017YFC1703904), האוניברסיטה (אוניברסיטת צ'נגדו של TCM) - מיזם (טיבט Rhodiola פרמצבטיקה אחזקות ושות 'בע"מ) פרויקט שיתוף פעולה (1052022040101); פרויקט החדשנות ושיתוף הפעולה האזורי של מחלקת המדע והטכנולוגיה של מחוז סצ'ואן (2020YFQ0032); ותוכנית המו"פ והטרנספורמציה המרכזית של מחלקת המדע והטכנולוגיה של מחוז צ'ינגהאי (2020-SF-C33).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chromatographic column | ZORBAX Eclipse | XDB-C18 | 4.6 mm x 250 mm, 5 µm |
| Drug dissolution tester | Shanghai Huanghai Pharmaceutical Inspection Instrument Co., Ltd. | RCZ-6B3 | |
| Electronic analytical balance | Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd. | FA1004 | |
| Ethyl gallate (HPLC, ≥98%) | Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. | DSTDM006301 | |
| Function drawing software | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2022 | |
| Gallic acid (HPLC, ≥98%) | Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. | DSTDM000802 | |
| High performance liquid chromatography | Agilent Technologies Singapore (International) Pte. Ltd. | Agilent 1260 Infinity  |
|
| HPLC grade methanol | Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd. | 216565 | |
| Injector | Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instrument Co., Ltd. | 0.7 (22 G) | |
| Millipore filter | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd | φ13 0.22 Nylon66 | |
| Rhodiola granules | Tibet Nodikang Pharmaceutical Co., Ltd. | 210501 | |
| Salidroside (HPLC, ≥98%) | Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. | DST200425-037 | |
| Ultra pure water systemic | Merck Millipore Ltd. | Milli-Q | |
| Ultrasonic cleansing machine | Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd | SB-8200 DTS |
References
- Smith, S. C., Zheng, Z. J. The impending cardiovascular pandemic in China. Circulation Cardiovascular Quality and Outcomes. 3 (3), 226-227 (2010).
- Wang, D., Wang, P., Zhang, R., Xi, X. Efficacy and safety of Xuefu Zhuyu decoction combined with Western medicine for angina pectoris in coronary heart disease: A protocol for systematic review and meta-analysis. Medicine. 99 (50), 23195 (2020).
- Yang, X., et al. The role of traditional Chinese medicine in the regulation of stress in treating coronary heart disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 3231424 (2019).
- Yang, J., Tian, S., Zhao, J., Zhang, W. Exploring the mechanism of TCM formulae in the treatment of different types of coronary heart disease by network pharmacology and machining learning. Pharmacological Research. 159, 105034 (2020).
- Pu, W. L., et al. Anti-inflammatory effects of Rhodiola rosea L.: A review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 121, 109552 (2020).
- Tao, H., et al. Rhodiola species: A comprehensive review of traditional use, phytochemistry, pharmacology, toxicity, and clinical study. Medicinal Research Reviews. 39 (5), 1779-1850 (2019).
- Li, M., et al. Exploring the biochemical basis of the meridian tropism theory for the qi-invigorating traditional Chinese medicine herb Panax ginseng. Journal of Evidence-Based Integrative Medicine. 26, 2515690 (2021).
- Pang, Y., Liang, J. Q. Effect of Nordicam on hemodynamics in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury. Journal of Chinese Medicinal Materials. 36 (2), 276-279 (2013).
- Nickerson, B., Kong, A., Gerst, P., Kao, S. Correlation of dissolution and disintegration results for an immediate-release tablet. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 150, 333-340 (2018).
- Kambayashi, A., Yomota, C. Exploring clinically relevant dissolution specifications for oral solid dosage forms of weak acid drugs using an in silico modeling and simulation approach. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 159, 105728 (2021).
- Meng, S., Jiang, T. Y., Bu, C. J., Liu, J. Q. Research progress on the dissolution of traditional Chinese medicine preparations. Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 8 (32), 180-181 (2015).
- Chinese Pharmacopoeia Committee. Pharmacopoeia of the People's Republic of China. 4, Chinese Medical Science and Technology Press. (2020).
- Lin, J. Z. Evaluation on Pre-Preparation of Rhodiola Extract. , Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. (2013).
- Zhou, Y. B., et al. Calculation of drug solubility Weibull distribution parameters by Origin software. Herald of Medicine. 30 (06), 721-723 (2011).
- Hu, C. Q., Pan, R. X. Progress in evaluation/prediction of bioequivalence of solid oral preparations by dissolution test. Chinese Journal of New Drugs. 23 (01), 44-51 (2014).
- Zhang, H., Yu, L. X. Dissolution testing for solid oral drug products: Theoretical considerations. American Pharmaceutical Review. 7 (5), 26-30 (2004).
- Ren, J. L., et al. Analytical strategies for the discovery and validation of quality-markers of traditional Chinese medicine. Phytomedicine. 67, 153165 (2020).
- Li, H., et al. Establishment of modified biopharmaceutics classification system absorption model for oral Traditional Chinese Medicine (Sanye Tablet). Journal of Ethnopharmacology. 244, 112148 (2019).
- Song, X. Y., Li, Y. D., Shi, Y. P., Jin, L., Chen, J. Quality control of traditional Chinese medicines: a review. Chinese Journal of Natural Medicines. 11 (6), 596-607 (2013).
- Wu, X., et al. Quality markers based on biological activity: A new strategy for the quality control of traditional Chinese medicine. Phytomedicine. 44, 103-108 (2018).
- Wei, N. -N., Wang, X., Su, M.
- Chi, Z., Azhar, I., Khan, H., Yang, L., Feng, Y. Automatic dissolution testing with high-temporal resolution for both immediate-release and fixed-combination drug tablets. Scientific Reports. 9 (1), 17114 (2019).
- Haidar, S. H., et al. Bioequivalence approaches for highly variable drugs and drug products. Pharmaceutical Research. 25 (1), 237-241 (2008).
