Summary
Her tester vi oppløsningen av Rhodiola granulat (RG) in vitro, tegner oppløsningskurver av salidrosid, gallinsyre og etylgallat i ultrarent vann, og tilpasser kurvene til forskjellige matematiske modeller. Denne protokollen gir informasjon og veiledning for in vivo bioekvivalens og in vivo in vitro korrelasjonsstudier av RG.
Abstract
Sammensetningen av den tibetanske medisinen Rhodiola granulat (RG) er kompleks, og den generelle kvaliteten på RG er vanskelig å bestemme. Derfor er etablering av en metode for å bestemme multikomponent in vitro-oppløsning av RG av stor betydning for kvalitetskontrollen. Denne studien bruker den andre padlemetoden i den fjerde generelle regelen 0931 fra den kinesiske farmakopéen (2020-utgaven), i samsvar med apparat 2 fra United States Pharmacopeia (USP). Oppløsningsapparatet ble satt til en rotasjonshastighet på 100 o / min med ultrarent vann som oppløsningsmedium. Et prøvevolum på 1 ml ble samlet inn på hvert tidspunkt. Videre ble den kumulative oppløsningen av gallinsyre, salidrosid og etylgallinsyre i RG ved forskjellige tidspunkter bestemt ved høyytelsesvæskekromatografi (HPLC). Til slutt ble oppløsningskurvene tegnet, og kurvene ble montert på GompertzMod, Gompertz, Logistic og Weibull-ligningene. Resultatene viste at den kumulative oppløsningen av gallinsyre i RG var over 80% etter 1 min, den kumulative oppløsningen av salidrosid og etylgallinsyre var over 65% etter 5 minutter, og den kumulative oppløsningen av hver indekskomponent ble redusert etter 30 minutter. Kurvetilpasningen viste at GompertzMod-ligningen var den best passende modellen for hver indekskomponent i RG. Avslutningsvis er oppløsningstestmetoden beskrevet i denne protokollen enkel, nøyaktig og pålitelig. Det kan karakterisere oppløsningsoppførselen til indekskomponentene i RG in vitro, som gir en metodologisk referanse for kvalitetskontroll av RG og kvalitetsevaluering av andre etniske forbindelser.
Introduction
I Kina fortsetter forekomsten av hjerte- og karsykdommer å stige, og sykeligheten og dødeligheten av hjerte- og karsykdommer rangerer først blant kinesiske innbyggere1. Angina pectoris av koronar hjertesykdom er forårsaket av luminal stenose på grunn av koronar aterosklerose, noe som fører til relativt utilstrekkelig koronar blodtilførsel og myokardiskemi og hypoksi2. I de senere år har den kurative effekten av tradisjonell kinesisk medisin i behandlingen av koronar hjertesykdom blitt anerkjent av mange leger3.
Tradisjonell kinesisk medisin spiller en viktig rolle i å lindre kliniske symptomer og forbedre livskvaliteten til pasienter4. Rhodiola granulat (RG) ekstraheres og raffineres fra det tibetanske platået medisinske planten Rhodiola rosea L. Hovedkomponentene i RG er salidrosid, rhodiosin og flavonoider 5,6. RG har effekten av å supplere Qi7 og aktivere og fremme blodsirkulasjonen for å lindre smerte. Klinisk brukes den til å behandle brystobstruksjoner forårsaket av Qi-mangel og blodstasis, koronar hjertesykdom, angina pectoris8. Innholdsbestemmelse alene gjenspeiler ikke fullt ut legemidlenes iboende kvalitet, da både oppløsning og oppløsning in vitro kan påvirkelegemidlenes biotilgjengelighet og effekt 9,10. Inspeksjonsmetodene for oppløsning av kinesisk medisin inkluderer den roterende kurvmetoden, padlemetoden og småkoppmetoden. Ulempen med den roterende kurvmetoden er at bare den ytre delen av den roterende kurven kommer i kontakt med oppløsningsmediet under rotasjon, noe som ikke gjenspeiler den virkelige oppløsningsoppførselen. Padlemetoden kan overvinne den ovennevnte mangelen, noe som gjør den mer egnet enn kurvmetoden for noen solide kinesiske medisinpreparater11. For tiden er det ingen rapport om in vitro oppløsningsanalyse av RG. For å kontrollere kvaliteten på RG mer omfattende, ble oppløsningsoppførselen til de tre indekskomponentene (gallinsyre, salidrosid og etylgallat) i RG undersøkt. Denne studien gir data for kvalitetskontroll av RG og en metodologisk referanse for kvalitetsevaluering av andre etniske sammensatte preparater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse av løsning
- Klargjør referansestoffstamløsningen: Vei 10,6 mg salidrosid, 5,24 mg gallinsyre og 5,21 mg etylgallinsyre separat på en elektronisk analytisk balanse og tilsett dem individuelt i en 5 ml volumetrisk kolbe. Deretter legger du til metanol av HPLC-kvalitet for å oppløse og fortynne til 5 ml. Rist til slutt godt for å oppnå referansestoffløsningen med massekonsentrasjoner på henholdsvis 2,120 mg/ml, 1,048 mg/ml og 1,042 mg/ml.
MERK: Referansestoffstamoppløsningen inneholder 2,120 mg/ml salidrosid, 1,048 mg/ml gallinsyre og 1,042 mg/ml etylgallat som stamløsning for hver oppløsning i den påfølgende standardkurven. - Forbered testprøveløsningen. Trekk ut 2,8 g RG (materialfortegnelse) med 10 ml HPLC-klasse metanol ved hjelp av en ultralydrensemaskin (effekt: 200 W, frekvens: 40 kHz) i 30 minutter, og filtrer den deretter med et 0,22 μm filter for systemets tilpasningsevnetest.
- Tilbered en blandet referanseoppløsning som inneholder 0,590 mg/ml salidrosid, 2,030 mg/ml gallinsyre og 1,930 mg/ml etylgallat.
MERK: Hver standard (2.950 mg salidrosid, 10.150 mg gallinsyre og 9.650 mg etylgallinsyre) oppløses i en 5 ml volumetrisk kolbe i HPLC-grad metanol som oppløsningsmedium. - Oppnå det teoretiske innholdet av hver karakteristiske komponent i RG for ekstraksjon av ultrarent vann.
- Plasser 2,8 g RG i en 500 ml konisk kolbe, tilsett 200 ml ultrarent vann og ultrasonisk ekstrakt (effekt: 200 W, frekvens: 40 kHz) i 60 minutter. Filtrer den deretter med et 0,22 μm filter.
- Bestem innholdet i testløsningen i henhold til den lineære ligningen oppnådd i følgende eksperiment.
2. Kromatografisk tilstand
- Still inn kromatografiske forhold som vist i tabell 1 for væskekromatografi med høy ytelse. For detaljer om instrumentet som brukes, se materialfortegnelsen.
3. Test av systemtilpasningsevne
- Undersøk det lineære forholdet.
- Fortynn referansestamløsningene av gallinsyre og etylgallat med 5, 10, 25, 50 og 125 ganger, og referansestamoppløsningene av salidrosid med 2, 4, 8, 16 og 32 ganger for å oppnå gradientkonsentrasjonsløsningen for å tegne en standardkurve.
MERK: Juster fortynningsforholdet til standardkurven i henhold til det foreløpige eksperimentet av prøvebehandlingen. I det foreløpige eksperimentet ble stamløsningene til de tre standardene først fortynnet 5, 10, 25, 50 og 125 ganger, og deretter ble den første standardkurven plottet. Men da konsentrasjonen av testprøven ble detektert, ble det funnet at konsentrasjonene av salidrosid ikke falt innenfor det lineære området for denne standardkurven, og derfor ble konsentrasjonene justert for å inkludere dem i kurven. Oppsummert ble de ovennevnte foreløpige forsøkene brukt til å bestemme de endelige fortynningskonsentrasjonene av de tre testprøvene for påfølgende eksperimentelle studier.
- Fortynn referansestamløsningene av gallinsyre og etylgallat med 5, 10, 25, 50 og 125 ganger, og referansestamoppløsningene av salidrosid med 2, 4, 8, 16 og 32 ganger for å oppnå gradientkonsentrasjonsløsningen for å tegne en standardkurve.
- Presisjonstesting: Injiser 10 mikrol av den blandede referanseløsningen i HPLC-systemet seks ganger daglig og kjør prøvene med de samme HPLC-forholdene som beskrevet i trinn 2.1. Registrer toppområdet for hver funksjonskomponent.
- Stabilitetstesteksperimenter: Injiser 10 μL av den fremstilte prøveløsningen og bestem toppområdene av HPLC i henhold til kromatografiske forhold etter henholdsvis 0 timer, 6 timer, 10 timer, 12 timer, 14 timer, 16 timer, 18 timer, 20 timer og 24 timer.
MERK: Toppområdene registreres automatisk av HPLC-systemet. - Reproduserbarhetstest: Ta seks prøver av samme batch RG for å forberede testprøveløsningen i henhold til metoden i trinn 1.2. Injiser 10 μL av hver prøve inn i HPLC-systemet. Kjør eksemplene som beskrevet i trinn 2.1, og bestem reproduserbarhet.
MERK: Repeterbarheten ble evaluert ved å sammenligne konsentrasjonsforskjellene mellom de seks prøvene. - Gjenopprettingseksperiment
- Forbered seks porsjoner av samme batch RG for testløsningen. Deretter legger du til omtrent 50 % av referansesubstansen for hver indekskomponent i testløsningen for å beregne gjenvinningsgraden. Kjør disse prøvene i HPLC-systemet med de samme betingelsene som er beskrevet i trinn 2.1.
- Beregn utvinningsgraden.
MERK: Gjenvinningsgrad = (C - A) / B x 100, hvor A er mengden komponent som skal måles i testløsningen, B er mengden referansestoff tilsatt, og C er den målte verdien av løsningen som inneholder referansestoffet og RG-prøven. Se trinn 2.1 for kromatografiske forhold for å utføre trinnene ovenfor (dvs. trinn 3.1-3.5).
4. Test av in vitro oppløsning
- Utfør oppløsningstesten ved hjelp av padlemetoden til den andre metoden for generell regel 0931 fra kinesisk farmakopé (2020-utgaven)12.
MERK: Prøvetakingsteknikk og utstyr: Legemiddeloppløsningsapparatet (materialfortegnelse) har en oppløsningskopp, en padle, et temperaturkontrollsystem og et hastighetsjusteringssystem. Før oppløsningseksperimentet starter, forvarmes vannet til en innstilt temperatur, og deretter stilles den tilsvarende hastigheten. Start opptak av tiden umiddelbart etter at du har lagt til RG. - Tilsett 100 ml ultrarent vann i oppløsningskoppen på oppløsningsapparatet og hold temperaturen ved 37 °C ± 0,5 °C. Sett rotasjonshastigheten til 100 o / min.
MERK: Oppløsningsapparatet har en varmeenhet som gjør at temperaturen kan stilles inn i systemet. Det var ingen signifikant forskjell i oppløsningshastigheten av salidrosid i vann, kunstig magesaft (16,4 ml fortynnet saltsyre [234 ml konsentrert saltsyre fortynnet til 1000 ml med vann] med ca. 800 ml vann og 10 g pepsin, godt rystet og fortynnet med vann til 1000 ml) og kunstig tarmjuice (fosfatbuffer [pH 6,8] inneholdende trypsin)13. Det lettest tilgjengelige vannet (ultrarent) ble valgt som oppløsningsmedium. - Tilsett 2,8 g RG i en oppløsningskopp og begynn å registrere varigheten av oppløsningen umiddelbart. Samle totalt 1 ml av prøven med en injektor (se materialfortegnelse) ved 1 min, 5 min, 10 min, 20 min, 30 min og 60 min, og øk volumet i oppløsningskoppen med oppløsningsmediet ved samme temperatur umiddelbart.
MERK: Prøvetakingsrøret i oppløsningskoppen kan ikke samle små prøvevolumer, så injektoren brukes til å samle prøven. Prøver må samles inn raskt for å unngå å gå glipp av spesifiserte innsamlingstidspunkter. - Filtrer umiddelbart de innsamlede prøvene gjennom en 0,22 μm mikroporøs membran og ta det påfølgende filtratet. Bestem innholdet i hver komponent ved hvert tidspunkt ved HPLC (i henhold til trinn 2.1) og beregne den kumulative oppløsningen.
- For å beregne den kumulative oppløsningen, beregn oppløsningen av hvert tidspunkt (Xn):
Xn = A / B x 100, hvor A er mengden komponenter målt ved hvert tidspunkt og B er det teoretiske innholdet i hver komponent. - Beregn deretter den kumulative oppløsningen (Y):
Y = X n + (X 1 + ... + X n-1) x V 2 / V 1, hvor V1 er det totale volumet av oppløsningsmediet og V 2 er volumet av løsemiddel tilsatt etter hver prøvetaking.
MERK: På grunn av de lave responsverdiene for salidrosid og gallinsyre i kromatogrammet, ble den kumulative oppløsningen av salidrosid og etylgallat ved 1 minutt ikke plottet inn i oppløsningskurven.
- For å beregne den kumulative oppløsningen, beregn oppløsningen av hvert tidspunkt (Xn):
5. Montering av oppløsningsmodellen
- Importer de kumulative oppløsningsdataene på hvert tidspunkt til dataanalyseprogramvaren.
- Bruk plugin-modulen for legemiddeloppløsningsanalyse i dataanalyseprogramvaren slik at den passer til GompertzMod-ligningen, Gompertz-ligningen, den logistiske ligningen og Weibull-ligningen14. Jo større verdien av R2 er, desto bedre er kurvetilpasningseffekten.
- Start programvaren, velg Book1-vinduet for å gå inn i Origin-dataredigeringsvinduet .
- I den første kolonnen A(X)-Long Name input Time definerer du Tid som tid og angir hvert løsningsbestemmelsestidspunkt. I den andre kolonnen B(Y)-Langt navn definerer du Data som den kumulative oppløsningen, og angir den kumulative oppløsningsprosenten for hver løsningsbestemmelsestid.
- Etter datainngang, velg kolonnen A (X) og B (Y), og velg plugin-modulen Drug Dissolution Analysis i programvaremenylinjen og klikk på Fit Dissolution Data > Concatenate Fit > OK. Programvaren genererer passende resultater for hver modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien var presisjonen, stabiliteten, repeterbarheten og prøvegjenvinningen av RG alle innenfor metodologisk område spesifisert i kinesisk farmakopé (volum 4, 2020)12, noe som indikerer at metoden var gjennomførbar. Etter gjentatt feilsøking ble det fastslått at elueringsgradienten som ble brukt i denne studien, hadde god oppløsning (figur 1) for de tre indekskomponentene i RG. De tre indekskomponentene i RG hadde et godt lineært forhold innenfor et spesifikt konsentrasjonsområde (tabell 2). Presisjonstestresultatene (tabell 3) viste at det relative standardavviket (RSD) for toppområdene av salidrosid, gallinsyre og etylgallat var henholdsvis 1,95 %, 2,83 % og 1,42 %, noe som indikerer at instrumentets presisjon var god. Resultatene fra stabilitetstesten (tabell 4) viste at RSD for toppområdene av salidrosid, gallinsyre og etylgallat var henholdsvis 2,37 %, 2,47 % og 2,82 %, noe som tyder på at prøveløsningen var stabil innen 24 timer. Repeterbarhetstestresultatene (tabell 5) viste at RSD for toppområdene av salidrosid, gallinsyre og etylgallat var henholdsvis 2,79%, 2,67% og 1,55%, noe som viser at repeterbarheten av denne metoden var god. Resultatene fra gjenopprettingseksperimentet indikerte at gjennomsnittlig gjenvinning av salidrosid, gallinsyre og etylgallat var henholdsvis 99,91 %, 100,40 % og 102,80 % (tabell 6).
In vitro oppløsningseksperimentet i denne studien var å bestemme innholdet av tre karakteristiske komponenter (salidrosid, gallinsyre og etylgallat) i RG-prøver ved hvert tidspunkt ved HPLC, og deretter beregne den kumulative oppløsningen. Oppløsningskurvene for hver komponent er vist i figur 2. Etter at prøven ble satt inn i oppløsningskoppen, var den kumulative oppløsningen av gallinsyre i RG over 80% etter 1 min. Den kumulative oppløsningen av salidrosid og etylgallinsyre var over 65 % etter 5 minutter, noe som gjenspeiles i dataene om at hver indekskomponent kunne oppløses over 60 % etter 5 minutter. Den kumulative oppløsningen av hver indekskomponent ble imidlertid redusert etter 30 minutter. Videre ble oppløsningskurvene tilpasset GompertzMod-ligningen, Gompertz-ligningen, den logistiske ligningen og Weibull-ligningen. Resultatene viste at GompertzMod-ligningen var den best passende modellen for de tre indekskomponentene (salidrosid, gallinsyre og etylgallat) i RG. Resultatene fra oppløsningsmodellen for tre indekskomponenter i RG er vist i tabell 7.
Figur 1: Representative kromatogrammer av de tre karakteristiske komponentene etter innstilling av kromatografiske forhold nevnt i trinn 2.1 (n = 1). (A) Kromatogrammet til prøveløsningen. Topp 1 er gallinsyre, topp 2 er salidrosid, og topp 3 er etylgallat. (B) Referanseløsningens kromatogramme. Topp 1 er gallinsyre, topp 2 er salidrosid, og topp 3 er etylgallat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oppløsningskurve for karakteristiske komponenter (n = 4). (A) Kumulativ oppløsning av gallinsyre ved 1 min, 5 min, 10 min, 20 min, 30 min og 60 minutter etter administrering. (B) Kumulativ oppløsning av salidrosid 5 min, 10 min, 20 min, 30 minutter og 60 minutter etter administrering. (C) Kumulativ oppløsning av etylgallat ved 5 min, 10 min, 20 min, 30 minutter og 60 minutter etter administrering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Betingelse | Parameter |
| Kromatografisk kolonne | C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 μm) |
| Mobil fase | Acetonitril (A)-0,2% eddiksyre (B) |
| Gradert eluering | 0–5 min, 0–4 %A; 5–15 minutter, 4 %–5 %A; 15–20 minutter, 5 %–7 %A; 20–30 minutter, 7 %–14 %A; 30–40 minutter, 14 %–13 %A; 40–45 minutter, 13 %–4 % A |
| Strømningshastighet | 1,0 ml/min |
| Kolonne temperatur | 30 °C |
| Oppdage bølgelengde | 275 nm |
| Prøvevolum | 10 μL |
Tabell 1: De kromatografiske forholdene som ble satt i dette eksperimentet. Tabellen viser detaljene for kromatografisk kolonne, mobilfase, gradienteluering, strømningshastighet, kolonnetemperatur, deteksjonsbølgelengde og prøvevolum.
| Indeks komponenter | Lineær ligning | R2 | Linearitetsområde (mg/ml) |
| Salidroside | Y = 2221X - 19.742 | 0.9996 | 0.06625–2.12 |
| Gallinsyre | Y = 29497X - 224 | 0.9997 | 0.008384–1.048 |
| Etylgallat | Y = 28902X - 86,171 | 0.9999 | 0.008336–1.042 |
Tabell 2: Det lineære forholdet mellom indekskomponentene i RG. De tre indekskomponentene i RG hadde et godt lineært forhold i et spesifikt konsentrasjonsområde.
| Toppområde for indekskomponenter | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD % |
| Salidroside | 900.6 | 917.4 | 899.8 | 917.4 | 940.1 | 890.5 | 1.95 |
| Gallinsyre | 6430.2 | 6544.2 | 6281.2 | 6327.7 | 6142.5 | 6636.9 | 2.83 |
| Etylgallat | 12748.9 | 12833.1 | 13190.4 | 13152.3 | 13128.3 | 13090.5 | 1.42 |
Tabell 3: Resultatene av presisjonsmålingen. RSD for toppområdene av salidrosid, gallinsyre og etylgallat var 1,95 %, 2,83 % og 1,42 % (n = 6).
| Toppområde for indekskomponenter | 0 timer | 6 timer | 12 timer | 18 timer | 21 timer | 24 timer | RSD % |
| Salidroside | 486.6 | 509 | 479 | 505.1 | 502.8 | 492 | 2.37 |
| Gallinsyre | 3236.5 | 3359.8 | 3152.2 | 3347.6 | 3337 | 3319.9 | 2.47 |
| Etylgallat | 442 | 413 | 421 | 429 | 443.8 | 436 | 2.82 |
Tabell 4: Resultatene av stabilitetstesten. RSD for toppområdene av salidrosid, gallinsyre og etylgallat var 2,37 %, 2,47 % og 2,82 % (n = 6).
| Toppområde for indekskomponenter | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD % |
| Salidroside | 1337.3 | 1276.5 | 1283.7 | 1286.8 | 1242.6 | 1237.2 | 2.83 |
| Gallinsyre | 8432.1 | 8976.1 | 8792 | 9083.1 | 9040.2 | 8751.4 | 2.74 |
| Etylgallat | 422.8 | 415.3 | 421.9 | 416.3 | 428.9 | 406.1 | 1.87 |
Tabell 5: Resultatene av reproduserbarhetstesten. RSD for toppområdene av salidrosid, gallinsyre og etylgallat var 2,83 %, 2,74 % og 1,87 % (n = 6).
| Kjent innhold (mg) | Legge til mengde (mg) | Målemengde (mg) | Frisk (%) | Gjennomsnittlig restitusjon (%) | RSD (%) |
| 0.5838 | 0.406 | 0.9783 | 97.18 | 99.91 | 2.70 |
| 0.5743 | 0.406 | 0.9984 | 104.47 | ||
| 0.5751 | 0.406 | 0.9755 | 98.63 | ||
| 0.5764 | 0.406 | 0.9776 | 98.81 | ||
| 0.5906 | 0.406 | 0.991 | 98.6 | ||
| 0.5802 | 0.406 | 0.9934 | 101.77 | ||
| 0.1234 | 0.118 | 0.2424 | 100.87 | 100.4 | 1.67 |
| 0.1214 | 0.118 | 0.2428 | 102.85 | ||
| 0.1216 | 0.118 | 0.2396 | 100 | ||
| 0.1218 | 0.118 | 0.2389 | 99.19 | ||
| 0.1249 | 0.118 | 0.2406 | 98.09 | ||
| 0.1226 | 0.118 | 0.2423 | 101.4 | ||
| 0.0221 | 0.386 | 0.4232 | 103.91 | 103.8 | 2.02 |
| 0.0218 | 0.386 | 0.4115 | 100.97 | ||
| 0.0218 | 0.386 | 0.4176 | 102.55 | ||
| 0.0218 | 0.386 | 0.4337 | 106.7 | ||
| 0.0224 | 0.386 | 0.4302 | 105.65 | ||
| 0.022 | 0.386 | 0.4198 | 103.05 |
Tabell 6: Resultatene av måling av gjenvinningsgraden i utvalget. RSD for utvinningsgraden av salidrosid, gallinsyre og etylgallat var henholdsvis 2,70 %, 1,67 % og 2,02 %.
| Indeks komponenter | Oppløsning ligning | R2 |
| Gallinsyre | GompertzMod | 0.4978 |
| Gompertz | 0.3740 | |
| Logistikk | 0.3739 | |
| Weibull | 0.3739 | |
| Salidroside | GompertzMod | 0.9894 |
| Gompertz | 0.9783 | |
| Logistikk | 0.9781 | |
| Weibull | 0.9781 | |
| Etylgallat | GompertzMod | 0.9895 |
| Gompertz | 0.9852 | |
| Logistikk | 0.9853 | |
| Weibull | 0.9853 |
Tabell 7: Kurvetilpasningsresultater fra oppløsningsmodellen av tre indekskomponenter i ultrarent vann. De passende resultatene for hver indekskomponent i RG var de beste med GompertzMod-ligningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oppløsningstesten er en ideell in vitro-metode for å simulere oppløsning og oppløsning av faste orale preparater i mage-tarmkanalen15. Det er en viktig indeks for evaluering og kontroll av kvaliteten på faste orale preparater. Derfor spiller oppløsningstesten en viktig rolle i utviklingen av faste legemiddelpreparater16. Spesielt med utviklingen av tradisjonell kinesisk medisin (TCM) kvalitetskontrollteknologi, har bestemmelsen av oppløsning gradvis blitt brukt på screeningstudiene av kinesisk og etnisk medisin sammensatte preparater17,18.
For tiden er bestemmelsen av oppløsningen av TCM og etnisk medisin in vitro hovedsakelig basert på å oppdage en enkelt indekskomponent. Imidlertid er den solide forberedelsen av tradisjonell kinesisk medisin og etnisk medisin et komplekst, og deres oppløsning påvirkes av mange faktorer (f.eks. Temperatur, oppløsningsmedium, etc.) og deres komplekse kjemiske sammensetning19,20. Derfor kan deteksjon av komponenter med flere indekser bedre gjenspeile den gjensidige innflytelsen og oppløsningsforskjellen mellom forskjellige komponenter. I dette papiret ble in vitro oppløsningstesten av de tre indekskomponentene (gallinsyre, salidrosid og etylgallat) i RG målt, og oppløsningskurvene for disse tre karakteristiske komponentene ble plottet, noe som ga en referanse for kvalitetskontrollen av RG.
Under forsøket bør følgende to punkter spesielt noteres. For det første, når prøvetaking for oppløsningstesten i henhold til den kinesiske farmakopéen 2020 utgave12, bør et likt volum oppløsningsmedium ved en temperatur på 37 ° C ± 0,5 ° C etterfylles umiddelbart etter prøveinnsamling, som er nøkkeltrinnet i eksperimentell prosess. For det andre skal prøvene samles fra et område midtveis mellom toppen av bladet og overflaten av oppløsningsmediet, ~ 10 mm fra oppløsningskoppens indre vegg. Dette skyldes at det er en konsentrasjonsgradient fra starten av oppløsningen av legemidlet til tidspunktet for fullstendig oppløsning. Konsentrasjonsgradienten er omvendt proporsjonal med omrøringshastigheten, slik at konsentrasjonen av oppløst legemiddel er høyest nær det uoppløste stoffet og det laveste der omrøringen er svak. Derfor bør prøvetaking på disse to ytterpunktene unngås21.
Selv om påvisning av multiindekskomponenter bedre kan gjenspeile oppløsningsvariasjonen av forskjellige komponenter i TCM / etnisk medisin sammensatte formuleringer sammenlignet med påvisning av enkeltindekskomponenter, har den visse begrensninger. Det er potensialet for menneskelig feil når du bruker en sprøyte til å samle prøvene. Presisjonen og nøyaktigheten av målingen kan forbedres hvis automatiske legemiddeloppløsningsmålinger kan implementeres22.
Oppsummert har vi etablert en in vitro oppløsningsmetode for bestemmelse av flerindekskomponenter i RG, som gir grunnlag for videre studier av RG. Dette eksperimentet kan gi informasjon og veiledning for in vivo bioekvivalensstudier og in vivo-in vitro korrelasjonsstudier av andre etniske legemidler23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av National Key Research and Development Program of China (2017YFC1703904), Universitetet (Chengdu University of TCM) - enterprise (Tibet Rhodiola Pharmaceutical Holding Co. LTD) samarbeidsprosjekt (1052022040101); det regionale innovasjons- og samarbeidsprosjektet til vitenskaps- og teknologiavdelingen i Sichuan-provinsen (2020YFQ0032); og det viktigste FoU- og transformasjonsprogrammet til vitenskaps- og teknologiavdelingen i Qinghai-provinsen (2020-SF-C33).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chromatographic column | ZORBAX Eclipse | XDB-C18 | 4.6 mm x 250 mm, 5 µm |
| Drug dissolution tester | Shanghai Huanghai Pharmaceutical Inspection Instrument Co., Ltd. | RCZ-6B3 | |
| Electronic analytical balance | Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd. | FA1004 | |
| Ethyl gallate (HPLC, ≥98%) | Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. | DSTDM006301 | |
| Function drawing software | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2022 | |
| Gallic acid (HPLC, ≥98%) | Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. | DSTDM000802 | |
| High performance liquid chromatography | Agilent Technologies Singapore (International) Pte. Ltd. | Agilent 1260 Infinity  |
|
| HPLC grade methanol | Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd. | 216565 | |
| Injector | Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instrument Co., Ltd. | 0.7 (22 G) | |
| Millipore filter | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd | φ13 0.22 Nylon66 | |
| Rhodiola granules | Tibet Nodikang Pharmaceutical Co., Ltd. | 210501 | |
| Salidroside (HPLC, ≥98%) | Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. | DST200425-037 | |
| Ultra pure water systemic | Merck Millipore Ltd. | Milli-Q | |
| Ultrasonic cleansing machine | Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd | SB-8200 DTS |
References
- Smith, S. C., Zheng, Z. J. The impending cardiovascular pandemic in China. Circulation Cardiovascular Quality and Outcomes. 3 (3), 226-227 (2010).
- Wang, D., Wang, P., Zhang, R., Xi, X. Efficacy and safety of Xuefu Zhuyu decoction combined with Western medicine for angina pectoris in coronary heart disease: A protocol for systematic review and meta-analysis. Medicine. 99 (50), 23195 (2020).
- Yang, X., et al. The role of traditional Chinese medicine in the regulation of stress in treating coronary heart disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 3231424 (2019).
- Yang, J., Tian, S., Zhao, J., Zhang, W. Exploring the mechanism of TCM formulae in the treatment of different types of coronary heart disease by network pharmacology and machining learning. Pharmacological Research. 159, 105034 (2020).
- Pu, W. L., et al. Anti-inflammatory effects of Rhodiola rosea L.: A review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 121, 109552 (2020).
- Tao, H., et al. Rhodiola species: A comprehensive review of traditional use, phytochemistry, pharmacology, toxicity, and clinical study. Medicinal Research Reviews. 39 (5), 1779-1850 (2019).
- Li, M., et al. Exploring the biochemical basis of the meridian tropism theory for the qi-invigorating traditional Chinese medicine herb Panax ginseng. Journal of Evidence-Based Integrative Medicine. 26, 2515690 (2021).
- Pang, Y., Liang, J. Q. Effect of Nordicam on hemodynamics in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury. Journal of Chinese Medicinal Materials. 36 (2), 276-279 (2013).
- Nickerson, B., Kong, A., Gerst, P., Kao, S. Correlation of dissolution and disintegration results for an immediate-release tablet. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 150, 333-340 (2018).
- Kambayashi, A., Yomota, C. Exploring clinically relevant dissolution specifications for oral solid dosage forms of weak acid drugs using an in silico modeling and simulation approach. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 159, 105728 (2021).
- Meng, S., Jiang, T. Y., Bu, C. J., Liu, J. Q. Research progress on the dissolution of traditional Chinese medicine preparations. Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 8 (32), 180-181 (2015).
- Chinese Pharmacopoeia Committee. Pharmacopoeia of the People's Republic of China. 4, Chinese Medical Science and Technology Press. (2020).
- Lin, J. Z. Evaluation on Pre-Preparation of Rhodiola Extract. , Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. (2013).
- Zhou, Y. B., et al. Calculation of drug solubility Weibull distribution parameters by Origin software. Herald of Medicine. 30 (06), 721-723 (2011).
- Hu, C. Q., Pan, R. X. Progress in evaluation/prediction of bioequivalence of solid oral preparations by dissolution test. Chinese Journal of New Drugs. 23 (01), 44-51 (2014).
- Zhang, H., Yu, L. X. Dissolution testing for solid oral drug products: Theoretical considerations. American Pharmaceutical Review. 7 (5), 26-30 (2004).
- Ren, J. L., et al. Analytical strategies for the discovery and validation of quality-markers of traditional Chinese medicine. Phytomedicine. 67, 153165 (2020).
- Li, H., et al. Establishment of modified biopharmaceutics classification system absorption model for oral Traditional Chinese Medicine (Sanye Tablet). Journal of Ethnopharmacology. 244, 112148 (2019).
- Song, X. Y., Li, Y. D., Shi, Y. P., Jin, L., Chen, J. Quality control of traditional Chinese medicines: a review. Chinese Journal of Natural Medicines. 11 (6), 596-607 (2013).
- Wu, X., et al. Quality markers based on biological activity: A new strategy for the quality control of traditional Chinese medicine. Phytomedicine. 44, 103-108 (2018).
- Wei, N. -N., Wang, X., Su, M.
- Chi, Z., Azhar, I., Khan, H., Yang, L., Feng, Y. Automatic dissolution testing with high-temporal resolution for both immediate-release and fixed-combination drug tablets. Scientific Reports. 9 (1), 17114 (2019).
- Haidar, S. H., et al. Bioequivalence approaches for highly variable drugs and drug products. Pharmaceutical Research. 25 (1), 237-241 (2008).
