El desarrollo de polvos secos farmacéuticos requiere pruebas in vivo fiables, a menudo utilizando un modelo murino. La tecnología de dispositivos para administrar aerosoles de polvo seco a ratones de forma precisa y reproducible está restringida. Este estudio presenta dosificadores desechables para la administración de fármacos pulmonares en dosis relevantes para ratones, lo que ayuda a la investigación inicial de prueba de concepto.
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Dosificadores desechables destinados a la entrega de polvo seco a ratones
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Resumen
Resumen
Los inhaladores de polvo seco ofrecen numerosas ventajas para la administración de fármacos a los pulmones, incluidas formulaciones estables de fármacos de estado sólido, portabilidad del dispositivo, medición y dosificación en bolo y un mecanismo de dispersión sin propulsor. Para desarrollar productos farmacéuticos en aerosol de polvo seco, es esencial realizar pruebas sólidas in vivo . Por lo general, los estudios iniciales implican el uso de un modelo murino para la evaluación preliminar antes de realizar estudios formales en especies animales más grandes. Sin embargo, una limitación importante en este enfoque es la falta de tecnología de dispositivos adecuada para administrar polvos secos de manera precisa y reproducible a animales pequeños, lo que dificulta la utilidad de dichos modelos. Para hacer frente a estos desafíos, se desarrollaron dosificadores de jeringas desechables específicamente para la administración intrapulmonar de polvos secos en dosis apropiadas para ratones. Estos dosificadores cargan y entregan una cantidad predeterminada de polvo obtenido a partir de un lecho de polvo de densidad aparente uniforme. Este control discreto se logra insertando una aguja roma a una profundidad fija (apisonamiento) en el lecho de polvo, eliminando una cantidad fija cada vez. En particular, este patrón de dosificación ha demostrado ser eficaz para una gama de polvos secados por pulverización. En experimentos con cuatro modelos diferentes de polvos secados por pulverización, los dosificadores demostraron la capacidad de alcanzar dosis dentro del rango de 30 a 1100 μg. La dosis alcanzada estuvo influenciada por factores como el número de apisonamientos, el tamaño de la aguja dosificadora y la formulación específica utilizada. Una de las principales ventajas de estos dosificadores es su facilidad de fabricación, lo que los hace accesibles y rentables para la administración de polvos secos a ratones durante los estudios iniciales de prueba de concepto. La naturaleza desechable de los dosificadores facilita su uso en salas de tratamiento con animales, donde la limpieza y el rellenado de sistemas reutilizables y materiales de pesaje son inconvenientes. Por lo tanto, el desarrollo de dosificadores de jeringas desechables ha abordado un obstáculo importante en la administración de polvo seco murino para estudios de prueba de concepto, lo que permite a los investigadores realizar estudios preliminares más precisos y reproducibles en modelos de animales pequeños para la administración pulmonar de fármacos.
Introducción
El uso de inhaladores de polvo seco (DPI) para la administración pulmonar de fármacos ha despertado un gran interés en las últimas tres décadas debido a la eliminación global de los propulsores de clorofluorocarbonos 1,2. Los DPI ofrecen numerosas ventajas sobre otros sistemas de administración pulmonar, como los inhaladores y nebulizadores de dosis medida, como la estabilidad de la formulación, la portabilidad, la facilidad de uso y los mecanismos de dispersión sin propelente2. Sin embargo, antes de que los productos DPI avancen hacia la traslación clínica, se deben realizar varios estudios preclínicos, muchos de los cuales se completan inicialmente utilizando un modelo murino. Sin embargo, las tecnologías disponibles para administrar polvos secos de forma precisa y reproducible a animales pequeños son limitadas.
Los métodos comunes para administrar polvos secos a animales pequeños, como ratones, incluyen la inhalación pasiva 3,4,5,6,7 y la administración directa 8,9,10,11,12,13. La inhalación pasiva generalmente requiere una cámara personalizada que utiliza grandes dosis de polvo secado por aspersión para preparar una nube de aerosol suficiente. Como los ratones son respiradores nasales obligados14, la administración por inhalación pasiva requiere que el polvo viaje a través de la nariz y la garganta para llegar a los pulmones, lo que requiere el mantenimiento de una nube de aerosol con suficientes propiedades aerodinámicas de partículas 7,8. Si bien es una técnica útil que es fisiológicamente más relevante que la administración directa debido a la inhalación como resultado de la respiración normal14, puede no ser adecuada para estudios iniciales en los que la masa de polvo es limitada.
Alternativamente, se han reportado varios dispositivos de administración intratraqueal para la administración directa de polvo seco 8,9,10,11,12,13. Los dispositivos intratraqueales evitan la nariz y la garganta, administrando el polvo directamente a los pulmones y permitiendo un control más preciso sobre la dosis administrada14. Además, algunos dispositivos, especialmente los preparados mediante un procedimiento de carga de bateo9, pueden prepararse con cantidades más pequeñas, lo que es una consideración importante para los estudios iniciales de prueba de concepto. La falta de dispositivos de administración intratraqueal universalmente disponibles ha obstaculizado su potencial de uso, limitando la disponibilidad y dando lugar a diferencias entre laboratorios14. En este estudio, proponemos un dosificador simple, económico y desechable para la administración intratraqueal que se puede utilizar para estudios murinos de prueba de concepto en el desarrollo de aerosoles de polvo seco.
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Protocolo
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Ley de Bienestar Animal y la Política del Servicio de Salud Pública sobre el Cuidado Humanitario y el Uso de Animales de Laboratorio. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Tennessee. A ratones hembra sanos BALB/c, ~6-8 semanas de edad, se les administró el contenido de polvo seco de un dosificador mediante administración intrapulmonar de aerosoles para un estudio farmacocinético utilizando polvos secos de espectronamida 15999. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).
1. Preparación del dosificador y de los componentes de llenado
- Recorte la parte de luer de plástico de una aguja de acero inoxidable roma de 2,54 cm (1 pulgada) (21-25 G) con una sierra seccionadora de precisión (consulte la Tabla de materiales) o una lijadora de banda hasta que queden 2-3 mm del luer de plástico (Figura 1A y Figura 2A).
NOTA: Si se utiliza una lijadora de banda, es posible que sea necesario limpiar la aguja de acero inoxidable con una aguja o alambre más pequeño para eliminar las posibles obstrucciones creadas. - Corte la punta (1-1,5 cm) de un tubo de centrífuga cónico de 0,6 ml. Llene la punta del tubo con 30-35 mg de polvo.
NOTA: Consulte los resultados representativos para obtener los detalles de los polvos de ejemplo utilizados para el presente estudio. El rendimiento del aerosol en polvo debe evaluarse antes de su uso en esta aplicación siguiendo la metodología estándar descrita en el Capítulo General <601> de la USP (consulte la Tabla de materiales). - Si almacena y/o transporta el polvo, utilice la tapa del tubo (cortada) para cerrar el vial. Selle con una película de parafina para minimizar la exposición del polvo a la humedad ambiental si lo almacena y/o transporta.
2. Carga y montaje de dosificadores
- Apisonar la aguja de acero inoxidable recortada en el lecho de polvo en la punta del tubo de centrífuga cónico de 0,6 ml tantas veces como sea necesario para lograr la dosis deseada (Figura 2B). Limpie suavemente los lados de la aguja de acero inoxidable con un limpiador de poca pelusa para eliminar el exceso de polvo (Figura 3).
- Inserte suavemente la aguja de acero inoxidable cargada en una aguja de polipropileno de 3,81 cm (1,5 pulgadas) o de politetrafluoroetileno (PTFE) de 5,08 cm (2 pulgadas) (16-20 G) (consulte la Tabla de materiales) para evitar que se desprenda el polvo (Figura 1B, C y Figura 2C).
3. Accionamiento de los dosificadores
- Retire una jeringa desechable hasta el volumen deseado, que puede variar según la aplicación.
NOTA: Para la administración intrapulmonar en ratones, 0,15-0,6 mL suele ser apropiado 8,9. - Coloque la jeringa en el cierre luer de la aguja de polipropileno o PTFE (Figura 2D).
- Inserte el extremo de la aguja del dosificador en el objetivo deseado. Para analizar el contenido de polvo y la reproducibilidad, inserte la aguja a través de un tabique de goma perforado o una película de parafina en un vial que contenga una pequeña cantidad (por ejemplo, 1-5 ml) de agua y/o disolvente orgánico (por ejemplo, etanol), con la identidad y el volumen del disolvente dependiendo de las características físicas del ingrediente farmacéutico activo (API) y del método de cuantificación.
- Para la administración a ratones, insertar la aguja hasta la primera bifurcación bronquial de la tráquea de ratones anestesiados siguiendo los protocolos establecidos 9,15.
- Presione la jeringa con fuerza, expulsando el polvo del dispositivo hacia el vial de recolección (Figura 2E).
NOTA: Se debe seguir la misma técnica para administrar el polvo a los pulmones murinos. - Para analizar el contenido y la reproducibilidad del vial de recolección, utilice un método analítico adecuado para el API específico, como la espectrofotometría UV-Visible (UV-Vis) o la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
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Resultados
El rendimiento en aerosol de varios polvos secados por pulverización se estableció antes de su uso en este estudio. La distribución aerodinámica del tamaño de partícula (APSD) se describió mediante la mediana de la masa del diámetro aerodinámico (MMAD), que representa el tamaño que divide la distribución en dos enel percentil 50 (d50), y la desviación estándar geométrica (GSD), que refleja la amplitud de la distribución. La GSD se define por la raíz cuadrada del diámetro aerodinámico en el percentil...
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Discusión
Dado que los ratones son respiradores nasales obligatorios, la administración a través de la inhalación pasiva para los estudios iniciales de prueba de concepto dificulta la eficiencia y la estimación de la dosis, ya que el polvo debe pasar por la nariz y la garganta de una manera que depende de las propiedades de las partículas y la eficiencia de dispersión del polvo 7,8,14. El uso de los dosificadores desarrollados en...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer la financiación de los Institutos Nacionales de Salud (R01AI155922). La microscopía se realizó en el Laboratorio Analítico y de Nanofabricación de Chapel Hill (CHANL), miembro de la Red de Nanotecnología del Triángulo de Investigación de Carolina del Norte, RTNN, que cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias, Grant ECCS-1542015, como parte de la Infraestructura Nacional Coordinada de Nanotecnología, NNCI.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de microcentrífuga de 0,6 mL | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Balanza analítica | Mettler Toledo | AR1140 | Se puede utilizar cualquier balanza analítica con un alcance suficiente |
| Aguja roma de acero inoxidable, 1 pulgada, 21 G | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Aguja roma de acero inoxidable, 1 pulgada, 22 G | McMaster-Carr | 75165A683 | |
| Aguja roma de acero inoxidable, 1 pulgada, 25 G | McMaster-Carr | 75165A687 | |
| Jeringa desechable con cierre luer (1 mL) | se pueden usar jeringas de 3 mL | Fisher Scientific | 14-823-30 |
| Ratones hembra BALB/c | Charles River, Wilmington, MA, EE. UU | ||
| . Impactador en cascada de alto rendimiento | Aparato de impacto de próxima generación | 5 | |
| Película de laboratorio (p. ej., Parafilm) | Fisher Scientific | S37440 | |
| Limpiador con poca pelusa (p. ej., Kimwipes) | Kimberly-Clark Professional | 34133 | |
| Inhalador de polvo seco de baja resistencia | RS01 mod 7 | ||
| Aguja de polipropileno, 1,5 pulgadas, 16 G | McMaster-Carr | 6934A111 | |
| Aguja de polipropileno, 1,5 pulgadas, 18 G | McMaster-Carr | 6934A53 | |
| Aguja de polipropileno, 1,5 pulgadas, 20 G | McMaster-Carr | 6934A55 | |
| Sierra de corte de precisión | TedPella | 812-300 | Se puede utilizar la lijadora de banda como alternativa |
| Aguja de PTFE, 2 pulgadas, 20 G | McMaster-Carr | 75175A694 | |
| USP Capítulo General < 601> | http://www.uspbpep.com/usp31/v31261/usp31nf26s1_c601.asp |
Referencias
- Wu, X., Li, X., Mansour, H. M. Surface analytical techniques in solid-state particle characterization for predicting performance in dry powder inhalers. KONA Powder and Particle Journal. 28, 3-18 (2010).
- Maloney, S. E., Mecham, J. B., Hickey, A. J. Performance testing for dry powder inhaler products: towards clinical relevance. KONA Powder and Particle Journal. 40, 172-185 (2023).
- Maloney, S. E., et al. Spray dried tigecycline dry powder aerosols for the treatment of nontuberculous mycobacterial pulmonary infections. Tuberculosis. 139, 102306(2023).
- Kaur, J., et al. A hand-held apparatus for "nose-only" exposure of mice to inhalable microparticles as a dry powder inhalation targeting lung and airway macrophages. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 34 (1), 56-65 (2008).
- Yi, J., et al. Whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposures. Journal of Visualized Experiments. (75), e50263(2013).
- Chung, Y. H., Han, J. H., Lee, Y. -H. A study on subchronic inhalation toxicology of 1-chloropropane. Toxicological Research. 31 (4), 393-402 (2015).
- Kuehl, P. J., et al. Regional particle size dependent deposition of inhaled aerosols in rats and mice. Inhalation Toxicology. 24 (1), 27-35 (2012).
- Manser, M., et al. Design considerations for intratracheal delivery devices to achieve proof-of-concept dry powder biopharmaceutical delivery in mice. Pharmaceutical Research. 40, 1165-1176 (2023).
- Stewart, I. E., et al. Development and characterization of a dry powder formulation for anti-tuberculosis drug spectinamide 1599. Pharmaceutical Research. 36 (9), 136(2019).
- Durham, P. G., et al. Disposable dosators for pulmonary insufflation of therapeutic agents to small animals. Journal of Visualized Experiments. (121), e55356(2017).
- Miwata, K., et al. Intratracheal administration of siRNA dry powder targeting vascular endothelial growth factor inhibits lung tumor growth in mice. Molecular Therapy: Nucleic Acids. 12, 698-706 (2018).
- Duret, C., et al. Pharmacokinetic evaulation in mice of amorphous itraconazole-based dry powder formulations for inhalation with high bioavailability and extended lung retention. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (1), 46-54 (2014).
- Maloney, S. E., et al. Preparation strategies of the anti-mycobacterial drug bedaquiline for intrapulmonary routes of administration. Pharmaceuticals. 16 (5), 729(2023).
- Price, D. N., Kunda, N. K., Muttil, P. Challenges associated with the pulmonary delivery of therapeutic dry powders for preclinical testing. KONA Powder and Particle Journal. 36, 129-144 (2019).
- Qiu, Y., Liao, Q., Chow, M. Y. T., Lam, J. K. W. Intratracheal administration of dry powder formulation in mice. Journal of Visualized Experiments. (161), e61469(2020).
- Fiegel, J., et al. Preparation and in vivo evaluation of a dry powder for inhalation of capreomycin. Pharmaceutical Research. 25 (4), 805-811 (2008).
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Reimpresiones y permisos
