Summary
murine इंट्रापल्मोनरी ट्रेकिअल ट्रांसप्लांटेशन (IPTT) मॉडल फेफड़ों के प्रत्यारोपण के बाद विस्मरण वायुमार्ग रोग (OAD) का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान है। यह उच्च प्रजनन क्षमता के साथ एलोट्रांसप्लांटेशन के बाद वायुमार्ग विस्मरण में फेफड़े-विशिष्ट प्रतिरक्षाविज्ञानी और एंजियोजेनिक व्यवहार में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। यहां, हम आईपीटीटी प्रक्रिया और इसके अपेक्षित परिणामों का वर्णन करते हैं।
Abstract
मुराइन इंट्रापल्मोनरी ट्रेकिअल ट्रांसप्लांटेशन (आईपीटीटी) का उपयोग फेफड़ों के प्रत्यारोपण के बाद विस्मरण वायुमार्ग रोग (ओएडी) के मॉडल के रूप में किया जाता है। प्रारंभ में हमारी टीम द्वारा रिपोर्ट की गई, इस मॉडल ने प्रतिरक्षाविज्ञानी व्यवहार और चिकित्सीय हस्तक्षेपों की जांच के लिए इसकी उच्च तकनीकी प्रजनन क्षमता और उपयुक्तता के कारण ओएडी के अध्ययन में उपयोग प्राप्त किया है।
आईपीटीटी मॉडल में, एक कृंतक श्वासनली ग्राफ्ट सीधे फुफ्फुस के माध्यम से प्राप्तकर्ता के फेफड़े में डाला जाता है। यह मॉडल हेटेरोटोपिक श्वासनली प्रत्यारोपण (एचटीटी) मॉडल से अलग है, जिसमें ग्राफ्ट को चमड़े के नीचे या ओमेंटल साइटों में प्रत्यारोपित किया जाता है, और ऑर्थोटोपिक श्वासनली प्रत्यारोपण (ओटीटी) मॉडल से जिसमें दाता श्वासनली प्राप्तकर्ता की श्वासनली को बदल देती है।
IPTT मॉडल के सफल कार्यान्वयन के लिए उन्नत संवेदनाहारी और सर्जिकल कौशल की आवश्यकता होती है। संवेदनाहारी कौशल में प्राप्तकर्ता के एंडोट्रैचियल इंटुबैषेण, उपयुक्त वेंटिलेटरी पैरामीटर सेट करना और संज्ञाहरण से वसूली के बाद उचित समय पर एक्सट्यूबेशन शामिल है। सर्जिकल कौशल फेफड़ों के भीतर सटीक ग्राफ्ट प्लेसमेंट के लिए और हवा के रिसाव और रक्तस्राव को रोकने के लिए आंत के फुस्फुस का आवरण की प्रभावी सीलिंग सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं। सामान्य तौर पर, सीखने की प्रक्रिया में लगभग 2 महीने लगते हैं।
एचटीटी और ओटीटी मॉडल के विपरीत, आईपीटीटी मॉडल में, एलोग्राफ्ट वायुमार्ग प्रासंगिक फेफड़ों के माइक्रोएन्वायरमेंट में वायुमार्ग विस्मरण विकसित करता है। यह जांचकर्ताओं को फेफड़े के प्रत्यारोपण के बाद वायुमार्ग विस्मरण में शामिल फेफड़े-विशिष्ट प्रतिरक्षाविज्ञानी और एंजियोजेनिक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, यह मॉडल इस मायने में भी अद्वितीय है कि यह तृतीयक लिम्फोइड अंगों (टीएलओ) को प्रदर्शित करता है, जो मानव फेफड़ों के एलोग्राफ्ट में भी देखे जाते हैं। टीएलओ में टी और बी सेल आबादी शामिल हैं और उच्च एंडोथेलियल शिराओं की उपस्थिति की विशेषता है जो प्रतिरक्षा कोशिका भर्ती को निर्देशित करते हैं; इसलिए, वे भ्रष्टाचार स्वीकृति और अस्वीकृति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने की संभावना रखते हैं। हम निष्कर्ष निकालते हैं कि आईपीटीटी मॉडल फेफड़े के प्रत्यारोपण एलोग्राफ्ट में वायुमार्ग विस्मरण के विकास में शामिल इंट्रापल्मोनरी प्रतिरक्षा और प्रोफाइब्रोटिक मार्गों का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है।
Introduction
अंतिम चरण के श्वसन रोगों वाले रोगियों के लिए फेफड़े के प्रत्यारोपण को एक प्रभावी उपचार के रूप में स्थापित किया गया है। हालांकि, मानव फेफड़े के प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं के लिए औसत जीवित रहने की दर केवल लगभग 6 वर्ष है, जिसमें ओब्लिटरेटिव ब्रोंकियोलाइटिस (ओबी) का विकास होता है, जो एक प्रकार का अवरोधक वायुमार्ग रोग (ओएडी) है, जो प्रत्यारोपण के बाद पहले वर्ष के बाद मृत्यु का एक प्रमुख कारणहै।
ओएडी अंतर्निहित तंत्र की जांच के लिए कई पशु मॉडल का उपयोग किया गया है। ऐसा ही एक मॉडल हेटेरोटोपिक ट्रेकिअल ट्रांसप्लांटेशन (HTT) मॉडल2 है। इस मॉडल में, श्वासनली ग्राफ्ट को प्राप्तकर्ता के चमड़े के नीचे के ऊतक या ओमेंटम में प्रत्यारोपित किया जाता है। श्वासनली ग्राफ्ट उपकला कोशिकाओं के इस्केमिया-प्रेरित नुकसान होता है, इसके बाद एलोरिएक्टिव लिम्फोसाइट घुसपैठ और दाता उपकला कोशिकाओं के एपोप्टोसिस होता है। फाइब्रोब्लास्ट और मायोफिब्रोब्लास्ट्स श्वासनली के चारों ओर पलायन करते हैं, एक बाह्य मैट्रिक्स का उत्पादन करते हैं। अंत में, वायुमार्ग लुमेन का पूर्ण रेशेदार विस्मरण होता है। HTT मॉडल तकनीकी रूप से सरल है, विवो वातावरण में प्रदान करता है, और उच्च प्रजनन क्षमता प्रदान करता है।
ओएडी का अध्ययन करने के लिए एक अन्य मॉडल चूहा ऑर्थोटोपिक श्वासनली प्रत्यारोपण (ओटीटी) मॉडल है, जहां श्वासनली ग्राफ्ट को शारीरिक वेंटिलेशन बनाए रखने के लिए प्राप्तकर्ता की श्वासनली में इंटरपोज़ किया जाता है3. इस मॉडल में, दाता उपकला कोशिकाओं के इस्किमिया-प्रेरित कमी के परिणामस्वरूप श्वासनली के भीतर प्राप्तकर्ता उपकला कोशिकाओं द्वारा उनके प्रतिस्थापन का परिणाम होता है, जिससे मध्यम फाइब्रोसिस के साथ एक अबाधित वायुमार्ग बनता है। यद्यपि इन मॉडलों ने फेफड़ों के प्रत्यारोपण के बाद वायुमार्ग विस्मरण की समझ में योगदान दिया है, लेकिन फेफड़े के पैरेन्काइमल माइक्रोएन्वायरमेंट के पुनरावृत्ति के संदर्भ में उनकी सीमाएं हैं।
हमारे शोध समूह ने चूहे इंट्रापल्मोनरी श्वासनली प्रत्यारोपण (आईपीटीटी) मॉडल की शुरुआत की, जहां श्वासनली ग्राफ्ट प्राप्तकर्ता फेफड़े4 (चित्रा 1) में प्रत्यारोपित किए जाते हैं। आईपीटीटी मॉडल फेफड़ों के माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर होने वाले वायुमार्ग लुमेन के रेशेदार विस्मरण को प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, यह चूहों पर सफलतापूर्वक लागू किया गया है जो चूहे आईपीटीटी 5,6,7,8,9,10 की तुलना में तकनीकी रूप से अधिक चुनौतीपूर्ण हैं। murine IPTT मॉडल के इस अनुकूलन ने हमें ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके फेफड़े के प्रत्यारोपण के बाद OAD के फेफड़ों के प्रतिरक्षाविज्ञानी वातावरण के जटिल विवरणों में गहराई से जाने में सक्षम बनाया।
IPTT मॉडल में कुछ अनूठी विशेषताएं हैं। एक नियोएंजियोजेनेसिस है, जो फुफ्फुसीय परिसंचरण द्वारा सुगम है और वायुमार्ग विस्मरण 4,10 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसके अतिरिक्त, आईपीटीटी मॉडल लिम्फोइड समुच्चय प्रदर्शित करता है, जिनमें से कुछ में परिधीय नोड एड्रेसिन को व्यक्त करने वाले उच्च एंडोथेलियल वेन्यूल्स होते हैं, यह दर्शाता है कि वे तृतीयक लिम्फोइड अंग (टीएलओ)7,8हैं। टीएलओ लिम्फ नोड्स जैसा दिखता है और टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, और अक्सर, कूपिक वृक्ष के समान कोशिकाओं11,12 के साथ एक रोगाणु केंद्र से मिलकर बनता है. वायुमार्ग विस्मरण सहित विभिन्न पुरानी सूजन संबंधी बीमारियों में टीएलओ की सूचना मिली है, जिससे आईपीटीटी मॉडल वायुमार्ग विस्मरण 7,8,11,12,13 में टीएलओ की भूमिका की जांच के लिए उपयुक्त है। यह पत्र इस मॉडल के साथ शोधकर्ताओं को परिचित करने के लक्ष्य के साथ murine IPTT मॉडल की पद्धति प्रस्तुत करता है और फेफड़ों के प्रत्यारोपण के बाद वायुमार्ग विस्मरण में आगे की जांच की सुविधा प्रदान करता है।
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Protocol
सभी जानवरों को प्रायोगिक जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में पशु देखभाल पर कनाडाई परिषद द्वारा निर्धारित दिशानिर्देशों के अनुसार इलाज किया गया था। प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल टोरंटो जनरल अस्पताल अनुसंधान संस्थान, विश्वविद्यालय स्वास्थ्य नेटवर्क की पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था.
1. डोनर सर्जरी
नोट: BALB/c चूहों प्रयोग के लिए दाताओं का एक उदाहरण के रूप में उपयोग किया जाता है. सभी प्रक्रियाओं को एक बाँझ तकनीक का उपयोग करके किया जाना चाहिए।
- प्रक्रिया से पहले, प्रत्येक माउस का वजन रिकॉर्ड करें।
- एक सीओ2 कक्ष का उपयोग माउस euthanize.
- एक बार मौत की पुष्टि हो जाने के बाद, माउस को लापरवाह स्थिति में रखें और टेप के साथ अंगों को सुरक्षित करें।
- सर्जिकल क्षेत्र को 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल के साथ स्टरलाइज़ करके तैयार करें।
नोट: यदि आवश्यक हो और स्थानीय पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुशंसित के रूप में, चीरा साइट से फर क्लिप. - त्वचा पर एक midline चीरा बनाओ, मध्य पेट से शुरू और पूर्वकाल ग्रीवा क्षेत्र के लिए फैलने.
- ध्यान से वसा पैड वापस लेने के द्वारा श्वासनली का उपयोग, पार्श्व पट्टा मांसपेशियों चलती है, और श्वासनली आसपास संयोजी ऊतक से अलग. श्वासनली और घेघा के बीच अंतरिक्ष बनाने के लिए संदंश का प्रयोग करें.
- xiphoid उठाओ और डायाफ्राम कटौती.
- उरोस्थि को उठाएं, एक हेमोस्टैट डालकर उरोस्थि से गर्दन क्षेत्र तक एक स्पष्ट पथ सुनिश्चित करें। दोनों तरफ रिब पिंजरे दबाना और उरोस्थि के माध्यम से कटौती, गर्दन की मांसपेशियों के माध्यम से विस्तार.
- थाइमस और श्वासनली द्विभाजन का पर्दाफाश करने के लिए श्वासनली में बाधा डालने वाली किसी भी वसा या मांसपेशियों को हटा दें।
- दोनों मुख्य ब्रांकाई को काटें और ध्यान से घुटकी से वायुमार्ग को अलग करें।
- स्वरयंत्र को काटें और इसे हटा दें।
- बाँझ खारा समाधान या बाँझ खारा या संरक्षण समाधान में लथपथ बाँझ धुंध के साथ संरक्षण समाधान के साथ विच्छेदित श्वासनली स्प्रे करें और इसकी व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए इसे बर्फ पर रखें।
2. प्राप्तकर्ता सर्जरी
नोट: C57BL/6 चूहों प्रयोग के लिए प्राप्तकर्ताओं का एक उदाहरण के रूप में उपयोग किया जाता है.
- सर्जरी के दिन की सुबह 1 मिलीग्राम/किग्रा की खुराक पर निरंतर-रिलीज ब्यूप्रेनोर्फिन को चमड़े के नीचे प्रशासित करें।
- 5% isoflurane का उपयोग कर एक प्रेरण कक्ष में संज्ञाहरण प्रेरित.
- एक बार जब माउस हल्के ढंग से संवेदनाहारी हो जाता है, तो इंट्रापेरिटोनली (0.1 मिलीग्राम / जी) xylazine और (0.01 मिलीग्राम / जी) केटामाइन से मिलकर एक कॉकटेल इंजेक्ट करें।
- 2-3% isoflurane बनाए रखा के साथ प्रेरण कक्ष के लिए माउस लौटें.
- शल्य साइट पर फर दाढ़ी. इसके अलावा, 7 मिलीग्राम / किग्रा की खुराक पर नियोजित स्थापना स्थल के साथ चमड़े के नीचे एक लाइन ब्लॉक के रूप में बुपीवाकेन का प्रशासन करें।
- ओरोट्रैचियल इंटुबैषेण से पहले एक पैर की अंगुली चुटकी के लिए पलटा प्रतिक्रिया की अनुपस्थिति की पुष्टि करें। 20 जी अंतःशिरा कैथेटर का उपयोग करके माउस ओरोट्रैचियल को इंटुबैट करें और इसे 500 माइक्रोन की ज्वारीय मात्रा, 120 बीपीएम की श्वसन दर, 100% ऑक्सीजन और 2% आइसोफ्लुरेन के साथ वेंटिलेटर से कनेक्ट करें। जीभ पर लागू एक दबाना के साथ एक स्टैंड का प्रयोग करें, गर्दन बढ़ाया के साथ एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में जानवर पकड़े, इस प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए.
- एक हीटिंग पैड को सक्रिय करें और माउस को पैड के शीर्ष पर एक सही पार्श्व स्थिति में रखें, सिर को सर्जन से दूर रखें और सर्जन(चित्रा 2)का सामना करने वाली पूंछ। टेप के साथ अंगों को सुरक्षित करें। संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सा मरहम लगाएं।
- सर्जिकल क्षेत्र को 7.5% पोविडोन आयोडीन से स्क्रब करें, 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल से स्टरलाइज़ करें और 10% पोविडोन आयोडीन से फिर से स्क्रब करें। शल्य चिकित्सा क्षेत्र को कवर करने के लिए बाँझ शल्य चिकित्सा पर्दे लागू करें.
- इस समय के दौरान दाता श्वासनली को 16 जी अंतःशिरा कैथेटर में लोड करें (चित्र 3सी, डी)।
- प्राप्तकर्ता की त्वचा में चीरा लगाने और मांसपेशियों और संयोजी ऊतक को दागने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें।
- पांचवें या छठे इंटरकोस्टल स्पेस खोलें और दो रिट्रैक्टर का उपयोग करके रिब पिंजरे को खुला रखें।
- कपास झाड़ू और कैंची का उपयोग कर अवर फुफ्फुसीय लिगामेंट काटना.
- दाता श्वासनली (चित्रा 3 जी, एच) के लिए मार्ग के निर्माण अनुकरण.
- बाएं फेफड़े की मुद्रास्फीति को सुविधाजनक बनाने के लिए आंशिक रूप से इसे तीन-तरफा स्टॉपकॉक के साथ रोककर वेंटिलेटर बहिर्वाह ट्यूब को सुरक्षित करें।
- एक 20 जी सुई के साथ बाएं फेफड़े पंचर द्वारा एक मार्ग बनाएँ. यह सुनिश्चित करना कि पंचर गहराई लगभग श्वासनली एलोग्राफ्ट की लंबाई के बराबर है। फेफड़े के किनारे पर पंचर साइट का चयन करें (जैसा कि चित्र 3I में दर्शाया गया है), यह सुनिश्चित करना कि मार्ग टेबलटॉप के समानांतर चलता है (जैसा कि चित्र 3J में नीले वृत्त द्वारा चिह्नित किया गया है)।
नोट: एक ऊपर की ओर सम्मिलन कोण फुफ्फुस परत के प्रवेश में परिणाम होगा, जबकि एक गहरे कोण से प्रमुख जहाजों से रक्तस्राव हो सकता है (जैसा कि चित्र 3J में लाल क्रॉस द्वारा चिह्नित किया गया है)। - बाएं फेफड़े में 16 जी अंतःशिरा कैथेटर डालें और दाता श्वासनली को बाएं फेफड़े में बाहर निकालें। श्वासनली allograft के सम्मिलन के बाद, बहिर्वाह ट्यूब के माध्यम से unobstructed साँस लेने की अनुमति देने के लिए पानी निकलने की टोंटी जारी करें.
- एक क्लिप (चित्रा 3 के, एल) के साथ फुफ्फुस इंजेक्शन साइट बंद करें। क्लिप को पंचर साइट पर ठीक से रखें, इसके किनारे को फेफड़े के किनारे के समोच्च से मेल खाने के लिए संरेखित किया गया है ( चित्र 3L में नीले वृत्त द्वारा दर्शाया गया है)।
नोट: क्लिपिंग साइट के लिए एक गलत स्थान अप्रभावी सीलिंग और वायु रिसाव का परिणाम हो सकता है, जबकि अपर्याप्त क्लिप गहराई सर्जरी के बाद क्लिप को अलग कर सकती है (जैसा कि चित्र 3L में लाल क्रॉस द्वारा दिखाया गया है)। - वक्ष गुहा को खारा समाधान से भरें और एक धुंध के साथ खारा को अवशोषित करें।
- बाएं फेफड़े को फिर से फुलाएं और एक चल रही सिवनी तकनीक का उपयोग करके पसलियों को बंद करें।
- बाधित टांके के साथ मांसपेशियों और त्वचा को बंद करें।
- सर्जरी के अंत में 5 मिलीग्राम/किग्रा की खुराक पर चमड़े के नीचे मेलॉक्सिकैम एनाल्जेसिक का प्रशासन करें।
- प्राप्तकर्ता माउस को तब तक देखें जब तक वह जाग न जाए। फिर, श्वासनली ट्यूब को हटा दें और प्राप्तकर्ता माउस को पिंजरे में रखें।
नोट: प्राप्तकर्ता चूहों को व्यक्तिगत रूप से रखा जाना चाहिए। - मेलॉक्सिकैम (5 मिलीग्राम/किग्रा) को चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से प्रतिदिन एक बार प्रशासित करें, सर्जरी के 24 घंटे बाद शुरू करें और 3 दिनों के बाद जारी रखें।
3. प्राप्तकर्ता चूहों से नमूने का संग्रह
- 5% isoflurane का उपयोग कर एक प्रेरण कक्ष में संज्ञाहरण प्रेरित.
- ओरोट्रैचियल इंटुबैषेण से पहले पैर की अंगुली चुटकी के लिए पलटा प्रतिक्रिया की अनुपस्थिति की पुष्टि करें। इंटुबैषेण विधि और श्वासयंत्र सेटिंग प्राप्तकर्ता सर्जरी के समान हैं।
- माउस को लापरवाह स्थिति में रखें और अंगों को सुरक्षित करें।
- सर्जिकल क्षेत्र को 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल के साथ स्टरलाइज़ करके तैयार करें।
- त्वचा पर एक midline चीरा बनाओ, मध्य पेट से शुरू और पूर्वकाल ग्रीवा क्षेत्र के लिए फैलने.
- एक 25 जी सुई से जुड़े 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके अवर वेना कावा के माध्यम से माउस को बाहर निकालें, जिसके परिणामस्वरूप इच्छामृत्यु हुई।
- छाती खोलें और श्वासनली को उसी तरह से एक्सेस करें जैसे दाता माउस। 7-0 रेशम के साथ इंटुबैटिंग ट्यूब के चारों ओर श्वासनली बांधें।
- दिल को बेनकाब करने के लिए थाइमस, वसा और मांसपेशियों को हटा दें।
- बाएं आलिंद, दाएं आलिंद और अवर वेना कावा को काटें। सही वेंट्रिकल के माध्यम से बाँझ खारा के 3 एमएल के साथ फेफड़ों छिड़कना।
- हिस्टोलॉजिक विश्लेषण के लिए, एक इंटुबैटिंग ट्यूब के माध्यम से फेफड़ों को 10% फॉर्मेलिन के साथ फुलाएं।
- वेंटिलेशन ट्यूब को बाहर निकालें और श्वासनली को 7-0 रेशम से बांध दें।
- स्वरयंत्र और अन्नप्रणाली को विभाजित करें। उन्हें एक अवर दिशा में खींचें, और फिर दिल और फेफड़ों के ब्लॉक को निकालें, इसे 10% फॉर्मेलिन में रखें।
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Representative Results
हमारे अनुभव के आधार पर, इस मॉडल में प्रवीणता के लिए आमतौर पर लगभग 2 महीने के प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। एक बार प्रवीणता हासिल की है, दाता प्रक्रियाओं आम तौर पर 15 मिनट की आवश्यकता होती है, जबकि प्राप्तकर्ता प्रक्रियाओं लगभग 30 मिनट की आवश्यकता होती है. एक प्रशिक्षित ऑपरेटर के लिए अपेक्षित मृत्यु दर 0% है।
चित्रा 4 ए में, एक श्वासनली एलोग्राफ्ट फाइब्रोब्लास्टिक ऊतक के साथ पूर्ण रुकावट प्रदर्शित करता है, और उपकला कोशिकाएं स्पष्ट रूप से नष्ट हो जाती हैं। इसके विपरीत, चित्रा 4 बी में, एक श्वासनली आइसोग्राफ्ट पेटेंट रहता है, और उपकला कोशिकाओं को संरक्षित किया जाता है।
चित्रा 5 एक फेफड़े को दिखाता है जिसमें श्वासनली एलोग्राफ्ट को प्रत्यारोपित किया गया है, जो लिम्फोइड समुच्चय की उपस्थिति दिखा रहा है।
चित्रा 1: murine इंट्रापल्मोनरी श्वासनली प्रत्यारोपण मॉडल का आरेख। एक श्वासनली एलोग्राफ्ट एक दाता माउस से निकाला जाता है। श्वासनली एलोग्राफ्ट को कैथेटर में लोड किया जाता है। श्वासनली एलोग्राफ्ट को प्राप्तकर्ता के फेफड़े में प्रत्यारोपित किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: सर्जरी के दौरान प्राप्तकर्ता की स्थिति। माउस एक सही पार्श्व decubitus स्थिति में रखा गया है. प्राप्तकर्ता माउस का सिर सर्जन से दूर उन्मुख होता है और पूंछ सर्जन का सामना करती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: श्वासनली सम्मिलन और श्वासनली ग्राफ्ट के सम्मिलन की दिशा के चित्रण के लिए कैथेटर। (ए) श्वासनली प्रविष्टि के लिए कैथेटर. बाहरी कैथेटर में एक तेज टिप (बाएं) होती है, जबकि आंतरिक कैथेटर में एक कुंद टिप (दाएं) होती है। (बी) बाहरी और आंतरिक कैथेटर का संयोजन। आंतरिक कैथेटर बाहरी कैथेटर से थोड़ा बाहर निकलता है। (सी, डी) कैथेटर में दाता श्वासनली लोड हो रहा है. लाल ब्रैकेट श्वासनली ग्राफ्ट को इंगित करता है। (ई) कैथेटर के अंदर श्वासनली ग्राफ्ट. लाल ब्रैकेट श्वासनली ग्राफ्ट को इंगित करता है। (एफ) आंतरिक कैथेटर को "पुशर" के रूप में उपयोग करके आंतरिक श्वासनली ग्राफ्ट को बाहर निकालना। लाल ब्रैकेट श्वासनली ग्राफ्ट को इंगित करता है। (जी, एच) श्वासनली भ्रष्टाचार की नियुक्ति के लिए दिशा का अनुकरण। (मैं, जे) 22 जी सुई का उपयोग करके मार्ग बनाना। गहराई एक श्वासनली एलोग्राफ्ट की लंबाई से निकटता से मेल खाना चाहिए। सुई की दिशा सर्जन से विपरीत और टेबलटॉप के समानांतर होनी चाहिए। सही पंचर साइट को लाल बिंदु द्वारा दर्शाया जाता है। उपयुक्त सम्मिलन कोण नीले वृत्त द्वारा इंगित किया जाता है। गलत कोण लाल क्रॉस द्वारा इंगित किए जाते हैं। (के, एल) एक क्लिप के साथ फुफ्फुस इंजेक्शन साइट को बंद करना। काली रेखाएँ क्लिप का प्रतिनिधित्व करती हैं। लाल बिंदु पंचर साइट का प्रतिनिधित्व करता है। नीला वृत्त सही क्लिपिंग बिंदु को इंगित करता है। लाल क्रॉस गलत क्लिपिंग बिंदुओं का संकेत देते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: फेफड़े के प्रत्यारोपण के बाद 28 दिनों में हिस्टोपैथोलॉजी। (ए) एच एंड ई (बाएं) और मेसन के ट्राइक्रोम (दाएं) एक श्वासनली एलोग्राफ्ट की दाग वाली छवियां (दाता: बीएएलबी / एलोग्राफ्ट के लुमेन को कोलेजन और रेशेदार ऊतक के साथ रोड़ा जाता है जो मेसन के ट्राइक्रोम (काले तीर) द्वारा नीले रंग से सना होता है। इसके अतिरिक्त, उपकला कोशिकाएं खो गई हैं (नीले तीरहेड)। (बी) एच एंड ई (बाएं) और मेसन के ट्राइक्रोम (दाएं) एक श्वासनली आइसोग्राफ्ट की दाग वाली छवियां। एलोग्राफ्ट के विपरीत, आइसोग्राफ्ट का लुमेन (दाता, प्राप्तकर्ता: C57BL/6) खुला रहता है, और उपकला कोशिकाएं संरक्षित रहती हैं। सना हुआ ऊतक बलगम है। स्केल बार = 500 माइक्रोन। संक्षिप्त: H&E = hematoxylin और eosin. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: प्रत्यारोपित श्वासनली एलोग्राफ्ट के साथ फेफड़े में लिम्फोइड समुच्चय। (ए) एच एंड ई सीटू में एक प्रत्यारोपित श्वासनली एलोग्राफ्ट के साथ एक फेफड़े की दाग छवि। लिम्फोइड समुच्चय (काले तीर) फेफड़े के ऊतकों के भीतर मनाया जाता है। स्केल बार = 500 माइक्रोन। (बी) एक लिम्फोइड समुच्चय की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवि, बी सेल (बी 220, लाल), टी सेल (सीडी 3, हरा), और नाभिक (डीएपीआई, नीला) की उपस्थिति को उजागर करती है। स्केल बार = 100 माइक्रोन। संक्षिप्ताक्षर: एच एंड ई = हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
murine IPTT प्रक्रिया में महत्वपूर्ण चरण शामिल हैं। संज्ञाहरण के बारे में, पहला महत्वपूर्ण कदम एंडोट्रैचियल इंटुबैषेण है। मुखर डोरियों की कल्पना करने और तत्काल इंटुबैषेण की सुविधा के लिए मेज पर अपने पैरों के साथ माउस को उचित ऊंचाई पर पकड़ना आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, सावधानीपूर्वक श्वसन मात्रा और सकारात्मक अंत-श्वसन दबाव (पीईईपी) समायोजन आवश्यक है। आमतौर पर, 500 माइक्रोन की श्वसन मात्रा और 2 सेमीएच2ओ का एक पीईईपी 25-30 ग्राम वजन वाले चूहों के लिए पर्याप्त होता है। हालांकि, बड़े प्राप्तकर्ता चूहों को "हिचकी" एपिसोड का अनुभव हो सकता है, जो ऑक्सीजन की कमी का संकेत देता है। ऐसे मामलों में, फेफड़ों की भर्ती के लिए श्वसन की मात्रा, पीईईपी को बढ़ाना और अस्थायी रूप से श्वसन ट्यूब को जकड़ना आवश्यक हो सकता है। यदि हिचकी बनी रहती है, तो श्वासनली ट्यूब की गहराई को समायोजित किया जाना चाहिए। अंत में, श्वासनली ट्यूब एक्सट्यूबेशन का समय महत्वपूर्ण है, और पर्याप्त वसूली सुनिश्चित करने के लिए प्राप्तकर्ता की श्वसन दर की पुष्टि आवश्यक है। ऐसा करने में विफलता के परिणामस्वरूप पोस्टएक्सट्यूबेशन मृत्यु दर हो सकती है।
सर्जिकल प्रक्रिया के संबंध में, प्रत्यारोपित श्वासनली का उचित स्थान महत्वपूर्ण है। श्वासनली ग्राफ्ट(चित्रा 3जी)को सही ढंग से रखने के लिए उपयुक्त सुई दिशा का अनुकरण करना आवश्यक है। यदि पथ बहुत उथला है, तो श्वासनली का ग्राफ्ट फुफ्फुस का आवरण में प्रवेश कर सकता है, जबकि इसे बहुत गहरा डालने से फेफड़े के पोत वेध और गंभीर रक्तस्राव हो सकता है। एक और महत्वपूर्ण कदम फुफ्फुस चीरा को सुरक्षित रूप से ठीक करके सम्मिलन बिंदु की सटीक सीलिंग सुनिश्चित कर रहा है जिसमें श्वासनली एलोग्राफ्ट को स्टेनलेस स्टील क्लिप(चित्रा 3एच)के साथ डाला गया था। अपर्याप्त सीलिंग से हवा का रिसाव हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप छाती बंद होने के बाद प्राप्तकर्ता की मृत्यु हो सकती है।
जबकि आईपीटीटी मॉडल कुछ फायदे प्रदान करता है, जैसे कि सापेक्ष सादगी, उच्च प्रजनन क्षमता, और फेफड़ों के प्रत्यारोपण में देखे जाने वाले समान एक प्रतिरक्षाविज्ञानी वातावरण, इसकी कुछ सीमाएं हैं। आईपीटीटी मॉडल में ट्रेकिअल एलोग्राफ्ट नैदानिक स्थिति से भिन्न होते हैं, जहां ओबी छोटे वायुमार्ग में होता है। इसके अलावा, इस प्रमुख हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) बेमेल आईपीटीटी मॉडल में, श्वासनली एलोग्राफ्ट पूरी तरह से फाइब्रोब्लास्टिक ऊतक के साथ बंद हो जाता है, जो नैदानिक ओएडी के विपरीत होता है जहां फाइब्रोब्लास्टिक ऊतक रोड़ा आमतौर पर आंशिक होता है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, IPTT (इच्छित अध्ययन के आधार पर) के लिए एक और तनाव संयोजन (मामूली या अलग प्रमुख बेमेल) का उपयोग किया जा सकता है, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप BALB/c-to-C57BL/6 संयोजन की तुलना में एक मामूली एलोइम्यून प्रतिक्रिया और हल्के फाइब्रोब्लास्टिक ऊतक रोड़ा हो सकता है। हम विभिन्न तनाव संयोजनों की जांच करने वाले किसी भी प्रकाशित अध्ययन से अनजान हैं, इसलिए इस संभावना को अनुभवजन्य रूप से परीक्षण करने की आवश्यकता होगी।
अंत में, यह एचटीटी और ओटीटी मॉडल के समान एक गैर-संवहनी ग्राफ्ट है। इस सीमा को संबोधित करने के लिए, orthotopic फेफड़े प्रत्यारोपण (ओएलटी)14 इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, ओएडी जैसी विकृति का विकास माउस ओएलटी मॉडल 15,16,17 में परिवर्तनशील रहा है। ओएलटी की तुलना में आईपीटीटी मॉडल की सापेक्ष सादगी और प्रजनन क्षमता को देखते हुए, यह प्रत्यारोपण से संबंधित ओएडी के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक उचित मॉडल बना हुआ है। अंत में, आईपीटीटी मॉडल फेफड़ों के प्रत्यारोपण के बाद वायुमार्ग विस्मरण के विकास में शामिल इंट्रापल्मोनरी प्रतिरक्षा और प्रोफाइब्रोटिक मार्गों का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी शोध मॉडल के रूप में कार्य करता है।
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Disclosures
इस पांडुलिपि के लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
लेखक इस पांडुलिपि को संपादित करने के लिए जेरोम वलेरो को धन्यवाद देना चाहते हैं। चित्रा 1 और चित्रा 3I, जे, एल BioRender.com के साथ बनाए गए थे।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/cJ | The Jackson Laboratory | 8-10 weeks 25-30 g | Male, Donor |
| BD 1 mL Syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| BD PrecisionGlide Needle Aiguile BD PrecisionGlide |
Becton Dickinson | 305122 | |
| Bovie Change-A-Tip Deluxe High-Temperture | Bovie | DEL1 | |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 8-10 weeks 25-30 g | Male, Recipient |
| Dumont #5/45 Forceps | F·S·T | 11251-35 | |
| Ethicon Ligaclip Multiple -Clip Appliers- | Ethicon | LX107 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | F·S·T | 11150-10 | |
| Glover Bulldog Clamp | Integra | 320-127 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | F·S·T | 13009-12 | |
| Horizon Titanium Ligating Clips | Teleflex | 001201 | |
| Leica M651 Manual surgical microscope for microsurgical procedures | Leica | ||
| Magnetix Fixator with spring lock | CD+ LABS | ACD-001 | |
| Microsurgical Scissor | Jarit | 277-051 | |
| Mouse and Perinatal Rat Ventilator Model 687 | Harvard | 55-0001 | |
| Perfadex Plus | XVIVO | 19850 | |
| Retractor Tip Blunt - 2.5 mm | CD+ LABS | ACD-011 | |
| small animal table | CD+ LABS | ACD-003 | |
| Surgipro Blue 24" CV-1 Taper, Double Armed | Covidien | VP702X | |
| Systane ointment | Alconn | 1444062 | |
| System Elastomer | CD+ LABS | ACD-007 | |
| Terumo Surflo IV Catheter, 20 G x 1 in | Terumo Medical Corporation | SR-OX2025CA | |
| VMT table Top | benson | 91803300 |
References
- Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-fifth adult lung and heart-lung transplant report-2018; Focus theme: Multiorgan Transplantation. J Heart Lung Transplant. 37 (10), 1169-1183 (2018).
- Hertz, M. I., Jessurun, J., King, M. B., Savik, S. K., Murray, J. J. Reproduction of the obliterative bronchiolitis lesion after heterotopic transplantation of mouse airways. American J Pathol. 142 (6), 1945-1951 (1993).
- Ikonen, T. S., Brazelton, T. R., Berry, G. J., Shorthouse, R. S., Morris, R. E. Epithelial re-growth is associated with inhibition of obliterative airway disease in orthotopic tracheal allografts in non-immunosuppressed rats. Transplantation. 70 (6), 857 (2000).
- Dutly, A. E., et al. A novel model for post-transplant obliterative airway disease reveals angiogenesis from the pulmonary circulation. Am J Transplant. 5 (2), 248-254 (2005).
- Wagnetz, D., et al. Rejection of tracheal allograft by intrapulmonary lymphoid neogenesis in the absence of secondary lymphoid organs. Transplantation. 93 (12), 1212-1220 (2012).
- Hirayama, S., et al. Local long-term expression of lentivirally delivered IL-10 in the lung attenuates obliteration of intrapulmonary allograft airways. Hum Gene Ther. 22 (11), 1453-1460 (2011).
- Watanabe, T., et al. Recipient bone marrow-derived IL-17 receptor A-positive cells drive allograft fibrosis in a mouse intrapulmonary tracheal transplantation model. Transpl Immunol. 69, 101467 (2021).
- Matsuda, Y., et al. Spleen tyrosine kinase modulates fibrous airway obliteration and associated lymphoid neogenesis after transplantation. Am J Transplant. 16 (1), 342-352 (2016).
- Suzuki, Y., et al. Effect of CTLA4-Ig on Obliterative bronchiolitis in a mouse intrapulmonary tracheal transplantation model. Ann Thorac Cardiovasc Surg. 27 (6), 355-365 (2021).
- Watanabe, T., et al. A potent anti-angiogenic factor, vasohibin-1, ameliorates experimental bronchiolitis obliterans. Transplant Proc. 44 (4), 1155-1157 (2012).
- Aloisi, F., Pujol-Borrell, R. Lymphoid neogenesis in chronic inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 6 (3), 205-217 (2006).
- Cupedo, T., Jansen, W., Kraal, G., Mebius, R. E. Induction of secondary and tertiary lymphoid structures in the skin. Immunity. 21 (5), 655-667 (2004).
- Sato, M., et al. The role of intrapulmonary de novo lymphoid tissue in obliterative bronchiolitis after lung transplantation. J Immunol. 182 (11), 7307-7316 (2009).
- Okazaki, M., et al. Maintenance of airway epithelium in acutely rejection orthotopic vascularized mouse lung transplants. A J Resp Cell Mol Biol. 37 (6), 625-630 (2007).
- Yamada, Y., et al. Chronic airway fibrosis in orthotopic mouse lung transplantation models-an experimental reappraisal. Transplantation. 102 (2), e49-e58 (2018).
- Watanabe, T., et al. A B cell-dependent pathway drives chronic lung allograft rejection after ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Transplant. 19 (12), 3377-3389 (2019).
- Guo, Y., et al. Vendor-specific microbiome controls both acute and chronic murine lung allograft rejection by altering CD4+Foxp3+ regulatory T cell levels. Am J Transplant. 19 (10), 2705-2718 (2019).
