Artículo de método

Un sistema de perfusión normotémica de código abierto diseñado para científicos investigadores

DOI:

10.3791/68722

⸱

18 de julio de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Surgical Oncology Program, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Instrumentation Development and Engineering Application Solutions, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, 3Radiology and Imaging Sciences, Department of Interventional Radiology, National Institutes of Health, 4Histopathology and Autopsy Pathology, Laboratory of Pathology, National Institutes of Health, 5Division of Cancer Treatment and Diagnosis, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 6Department of Perioperative Medicine, National Institutes of Health, 7Blood Services Section, Department of Transfusion Medicine, National Institutes of Health, 8Translational Hepatology Section, Liver Disease Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health, 9Center for Immuno-Oncology, National Cancer Institute, National Institutes of Health

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un protocolo para un sistema de perfusión ex vivo normotérmico modificable de código abierto diseñado para superar el alto costo y la flexibilidad limitada de las plataformas existentes, lo que permite un uso más accesible, rentable e iterativo en la investigación biomédica preclínica.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La integración de máquinas de perfusión ex vivo para órganos humanos antes del trasplante ha mejorado los resultados para los receptores y ha aumentado la disponibilidad de órganos, al tiempo que ha revelado nuevas vías de investigación para la medicina traslacional. Sin embargo, estas máquinas tienen una disponibilidad limitada para modificaciones experimentales, al tiempo que presentan una importante inversión inicial y un costo por uso prohibitivo para el científico investigador. Además, existe una necesidad significativa de mejorar los modelos preclínicos en la investigación biomédica que permitan la interrogación auténtica de los procesos celulares en el entorno de órganos multicelulares.

Para proporcionar acceso a una tecnología similar para la comunidad investigadora en general, construimos una máquina de perfusión normotérmica modular rentable completamente a partir de piezas de fácil obtención ejecutadas con código Python modificable por el usuario. Dado que el sistema carece de hardware personalizado, los investigadores pueden construir y aumentar el sistema según sea necesario para aplicaciones de investigación individualizadas.

En este artículo, describimos en detalle la configuración de la máquina y el proceso de perfusión, transmitimos nuestra experiencia con órganos porcinos y humanos, y proporcionamos resultados experimentales de prueba de concepto tempranos. Estos estudios demuestran el potencial para interrogar la fisiopatología y los procesos celulares complejos utilizando tejido humano intacto.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aunque la perfusión normotérmica de corta duración (<12 h) se ha empleado previamente para riñones e hígados antes del trasplante 1,2,3,4,5, la perfusión hepática normotérmica ex vivo prolongada se hizo realidad en 2020 con la máquina Liver4Life 6. La intención de esta tecnología estaba orientada hacia la expansión de órganos de donantes viables, pero las posibles aplicaciones traslacionales eran evidentes para la comunidad investigadora 7,8,9,10,11,12. Para los científicos de laboratorio y los laboratorios de investigación convencionales, estas herramientas clínicas están casi con toda seguridad fuera de su alcance debido a los importantes costos iniciales y recurrentes12,13. Las máquinas de perfusión normotérmica clínica cuestan más de $ 250,000 USD, con desechables de un solo uso que oscilan entre $ 9,500 y $ 60,000 USD por ciclo 13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. Además, los derechos de propiedad y la incapacidad de adaptar la tecnología existente hacen que las aplicaciones científicas sean un desafío.

La necesidad imperiosa de mejorar los modelos preclínicos 24,25,26 en la investigación biomédica, junto con las limitaciones antes mencionadas, inspiró la creación de un sistema de perfusión modificable de código abierto (Figura 1). El diseño y el desarrollo de circuitos se guiaron por los principios de utilización de costos, requisitos de espacio de laboratorio y movilidad para aplicaciones traslacionales. El sistema se puede construir por $ 48,000 a $ 66,000 USD, y el costo de cada perfusión oscila entre $ 1,000 y $ 2,300 USD, lo que se logró a través de la integración de componentes individuales de fácil obtención ejecutados por código descargable libremente. El sistema se optimizó a través de un proceso iterativo que utilizó sangre porcina de donantes y sangre humana expirada, hígados porcinos y segmentos parciales de hígado humano del quirófano (Tabla Suplementaria 1, Tabla Suplementaria 2 y Tabla Suplementaria 3). Los órganos se alojan en una cuenca cerrada que posiciona de manera óptima la muestra para minimizar la necrosis por presión, permitir una trayectoria de canulación ideal, drenar la escorrentía y garantizar la normotermia. El depósito alberga aproximadamente 2-3 L de perfusión antes de ser dirigido hacia los circuitos de entrada. La hemodiálisis, crítica para la homeostasis electrolítica y la hemoconcentración en las perfusiones hepáticas 6,27,28,29, se integró a través de un circuito lateral con una bomba de rodillo independiente. Las infusiones farmacológicas apoyan las funciones fisiológicas (p. ej., nutrición parenteral total [NPT], sales biliares, etc.30), aumentan el tono vascular (epoprostenol, fenilefrina), previenen la coagulación (enoxaparina) y la infección (piperacilina-tazobactam, anfotericina). Los parámetros fisiológicos de perfusión se garantizan mediante sensores en línea en tiempo real para obtener valores de gases en sangre, presión y flujo. El sistema permite la máxima adaptabilidad del usuario, de modo que la integración de los componentes de hardware puede producirse en cualquier punto del circuito. Además, cada uno de los componentes individuales dentro del circuito se puede intercambiar o modificar para permitir la adaptación a preguntas de investigación específicas y necesidades experimentales. Por ejemplo, el circuito de entrada dual se puede modificar para la perfusión de órganos con un solo flujo de entrada (es decir, riñones o páncreas) simplemente quitando el conector Y antes de los cabezales de la bomba, y las claves para infusión/muestreo se pueden instalar en cualquier punto dentro del circuito. Además, el sistema se ejecuta con código Python que permite la perfusión semiautomática basada en un conjunto específico de parámetros de perfusión dictados por el usuario final (Figura complementaria 1). Por ejemplo, los sensores adquieren lecturas continuas de gases sanguíneos arteriales (ABG), presión y flujo que actúan como entrada para implementar comandos de salida para ajustar automáticamente el flujo de gas del oxigenador, la velocidad de la bomba, etc. La interfaz gráfica de usuario (GUI) permite la anulación manual de esta automatización si se desea. La personalización del circuito es su sello distintivo y amplía la aplicabilidad general de este sistema para una amplia gama de investigaciones experimentales.

El acceso al sistema en su totalidad está disponible de forma gratuita (https://github.com/CCR-SOP/OpenSourcePerfusionSystem.git) para fomentar la colaboración y la innovación en un esfuerzo por forjar nuevas profundidades de conocimiento en múltiples campos de la ciencia traslacional.

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Figura 1: Sistema de perfusión de código abierto. (A) Esquema del sistema de perfusión de código abierto para la configuración de doble flujo de entrada para la perfusión hepática. (B) Representación tridimensional (3D) del sistema durante la perfusión de órganos con integración de software como se muestra en las pantallas. (C) Foto de la máquina de perfusión durante el experimento de perfusión porcina. La configuración expuesta en la figura es solo para fines demostrativos. Durante la perfusión, el paño térmico estéril cubre el órgano para mantener un recinto estéril. Sensor P/F: Sensores de presión y caudal. HA: Arteria hepática. PV: Vena porta. HV: Vena hepática. BD: Vía biliar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo se llevó a cabo de acuerdo con los estándares éticos del Comité de Ética en Investigación en Seres Humanos de nuestra institución y se adhiere a todas las pautas y regulaciones aplicables para la investigación con sujetos y tejidos humanos.

1. Configuración de la máquina

  1. Preparación de la mesa
    1. Esterilice la mesa y el carro móvil con alcohol en aerosol al 70% y limpie bien. Coloque el carro móvil perpendicular al lado izquierdo de la mesa. Antes de la conexión de todos los tubos y herrajes a lo largo del protocolo, rocíe con alcohol al 70% o autoclave, si corresponde, para esterilizar.
      NOTA: Antes de cualquier manipulación o intervención de órganos, use guantes estériles y alcohol en aerosol para facilitar la esterilidad antes y durante la perfusión.
    2. Cubra la estación de trabajo con cortinas azules estériles y luego con almohadillas absorbentes.
    3. Fije el soporte del depósito a la pata del carro más cercana al banco con el anillo proyectándose hacia afuera, aproximadamente 12" por debajo de la parte inferior de la parte superior de la estación de trabajo.
    4. Coloque el embudo de tambor en el lado derecho de la estación de trabajo con una boquilla que sobresalga del borde frontal de la mesa. Corte espuma viscoelástica circular para llenar la base del tambor, dejando un espacio de 4" para el flujo de salida cerca de la boquilla. Coloque el diafragma debajo de la espuma conectada a un respirador.
    5. Obtenga 2 mantas calentadoras de agua y colóquelas encima del inserto de espuma con el tubo conector orientado hacia la parte superior izquierda de la manta. Corte las abrazaderas blancas del tubo e inserte una lengüeta Luer macho de 3/16" en cada tubo. Asegure 1 línea de entrada y 1 línea de salida de las líneas del tanque de calentamiento de agua Y a cada manta.
    6. Obtenga un paño cálido estéril e identifique el cuadrado azul central. Dobla por la mitad dos veces y corta 2 mm de la esquina del pliegue para crear un orificio de salida. Coloque una cortina estéril en la parte superior del tambor de modo que el orificio cortado esté alineado con la boquilla de salida.
    7. Obtenga el conector de salida impreso en 3D y coloque el imán en la ranura. Coloque debajo de la cortina a través de la boquilla de salida y alinee el orificio cortado con el orificio en el conector y el imán. Coloque un segundo imán alineado con el flujo de salida para asegurar la cortina.
    8. Levante el exceso de cortina para cubrir todo el embudo del tambor y asegúrelo con una banda elástica / lazos elásticos. Dobla el exceso de cortina sobre la parte superior para crear una barrera estéril. Vuelva a colocar la segunda camisa de agua en la parte superior de la cortina doblada.
    9. Corte una pieza de ~30" de tubo de 1/4" y fije el aspecto proximal a la pieza de salida desde la parte inferior de la boquilla del embudo del tambor y el aspecto distal a una lengüeta de entrada del depósito.
  2. Preparación de la bomba y el oxigenador
    1. Coloque las bombas en el carro móvil más cercano al borde de la estación de trabajo con soporte y dos abrazaderas inmediatamente detrás de las bombas de modo que las abrazaderas estén 6" por encima de las bombas.
    2. Obtenga 2 cabezales de bomba y asegúrelos en las bombas.
    3. Obtenga 2 oxigenadores y colóquelos dentro de abrazaderas unidas a soportes en una configuración horizontal. Oriente los oxigenadores con la púa hacia afuera y la púa lateral apuntando hacia la derecha.
      NOTA: Los oxigenadores con conectores Luer requieren una configuración alternativa con la etiqueta hacia afuera y las puntas internas hacia arriba.
  3. Preparación del mezclador de gas
    1. Corte dos (2) piezas de 4' de tubo de 1/8" e inserte un Luer macho de 1/8" en los extremos de cada tubo. Conecte un tubo a cada entrada de gas arterial y venoso.
    2. Corte dos (2) piezas de 2" de tubo de 1/4" y conecte un Luer hembra de 1/4" en un extremo. Coloque cada una de estas piezas de tubo en las púas superiores derechas de cada oxigenador.
    3. Conecte el tubo de entrada de gas arterial y venoso de 1/8" al conector Luer superior derecho de sus respectivos oxigenadores.
  4. Preparación del circuito de hemodiálisis
    1. Retire todos los tubos del kit de hemodiálisis, excepto los que conducen directamente al filtro (líneas azul, roja, verde y amarilla). Asegure el filtro en el tablero perforado en la parte posterior de la estación de trabajo, ~ 12 "a la derecha de las bombas, o en línea con el depósito.
    2. Coloque 1 bomba de rodillo grande inmediatamente a la derecha del filtro para la entrada de sangre. Coloque 2 bombas peristálticas más pequeñas a la derecha de la bomba del rodillo de sangre.
      1. Obtenga dos (2) tubos peristálticos de 1/8y colóquelos dentro de la abrazadera blanca de la bomba. Coloque dos (2) lengüetasLuer hembra de 1/8 en cada extremo de cada tubo.
    3. Cuelgue una bolsa de 5 L de líquido de diálisis en el lado derecho del puesto de trabajo.
      1. Conecte la bolsa de dializado a la entrada del filtro de hemodiálisis conectandoun tubo de 1/8 al conector Luer de la bolsa. Conecte el Luer macho de 1/8 al extremo de este tubo y conéctelo al tubo de la bomba peristáltica de entrada.
    4. Flujo de entrada/salida de dializado: Obtenga un tubo de 3 1/8con cada extremo equipado conun Luer macho de 1/8.
      1. Flujo de entrada: Conecte el extremo proximal al aspecto distal del tubo de la bomba y el extremo distal al tubo de entrada amarillo (con Luer hembra 1/8) al filtro de hemodiálisis.
      2. Flujo de salida: Conecte el extremo proximal al tubo de salida verde (con Luer hembra de 1/8) y el extremo distal al tubo de la bomba peristáltica de salida. Conecte el tubo de 1/8 a la cara distal de la bomba peristáltica y drene en la bolsa de residuos a través de conectores Luer.
  5. Creación de circuitos proximales
    1. Coloque el depósito dentro del soporte del depósito con números exteriores y conector con tapa amarilla orientado hacia afuera.
    2. Corte ~36" de tubería de 5/16" y conecte el extremo proximal a la piqueta de salida en el fondo del depósito. Conecte el conector Y de 5/16" al extremo distal de este tubo.
    3. Corte dos (2) tramos de 4" del tubo de 5/16" y conéctelos al extremo del conector Y. Fije cada uno de los extremos de estos tubos de 4" en la punta horizontal de cada uno de los cabezales de la bomba.
    4. Corte dos (2) tramos de 4" de tubo de 1/4" y conecte 1 a cada una de las lengüetas verticales de los cabezales de la bomba. Conecte el aspecto distal a la clavija inferior izquierda de cada oxigenador.
    5. Corte dos (2) tramos de 2" de tubo de 1/4" y conecte un Luer hembra a un extremo. Agregue una tapa Luer macho y colóquela en la punta inferior derecha de cada oxigenador.
  6. Creación de circuitos venosos
    1. Corte un (1) tubo de 5/16" de largo y conecte el extremo proximal a la lengüeta de salida (derecha) del oxigenador venoso. Corte por la mitad y coloque un conector Y de 5/16" sobre el extremo de corte distal. Vuelva a conectar la otra mitad a la lengüeta superior del conector Y.
    2. Circuito de muestreo lateral: Corte una (1) pieza de 2" de tubo de 1/4" y estire el extremo proximal con un destornillador de aguja. Conéctelo a la otra lengüeta del conector Y de 5/16".
      1. Consigue un sensor de cubeta. Conecte el lado de púas al tubo de 2" conectado al conector Y. Corte 1-2" de tubo de cubeta distal y conéctelo al Luer macho de 1/4". Conéctelo al extremo proximal del sensor de derivación una vez calibrado y, en el aspecto distal, conecte el Luer macho de 1/8" al tubo de 1/8".
      2. Conecte el aspecto horizontal del conector T hembra a un tubo de 1/8" y Luer macho. Al aspecto perpendicular, conecte una clave de muestreo. Conecte un Luer macho de 1/8" al aspecto horizontal restante del conector T.
      3. Corte 12" de tubo de 1/8", conecte el extremo proximal a la clave de muestreo y conecte un Luer macho de 1/8" al extremo distal. Conéctelo a otro conector T hembra. A un lado del conector T hembra, conecte un Luer macho de 1/4" y conéctelo a un canal de entrada usando un tubo de 2" de 1/4".
    3. Regrese al extremo distal del tubo de 5/16" y conecte otro conector Y de 5/16". Obtenga ~55" de tubo de 1/4" y conéctelo al extremo superior del conector Y de 5/16".
    4. Creación del circuito sanguíneo de hemodiálisis: Conecte un Luer macho de 1/4" al extremo distal del tubo de 1/4". Coloque el tubo a través de la bomba de rodillo grande. Conéctelo al flujo de entrada de sangre en la parte superior del filtro de hemodiálisis (tubo con revestimiento azul).
      1. Corte un (1) trozo de tubo de 1/4" de 24" y conecte un Luer macho de 1/4" al aspecto proximal. Conecte este tubo al filtro de hemodiálisis de salida de sangre (tubo con revestimiento rojo). Conecte el aspecto distal a una lengüeta de entrada del depósito.
    5. Regrese para completar el circuito de entrada venosa que conduce a la muestra. Corte un (1) trozo de tubo de 1/4" de 36" y estírelo para que quepa en la lengüeta del conector Y de 5/16".
    6. Sitio de infusión de fármacos: Obtenga 3 llaves de paso de cuatro vías y conéctelas linealmente. Conecte esta pieza al brazo perpendicular de un conector T hembra. A los brazos en línea del conector T hembra, conecte dos Luers macho de 1/4". Inserte la pieza a 12" del lado izquierdo del tubo.
    7. Conecte los sensores de flujo externos al tubo de 1/4" después del sitio de infusión del medicamento. Obtenga un soporte de 1 9" y asegúrelo al nivel del embudo del tambor. Haga un corte de 2" distal al final de los sensores de flujo e inserte los sensores de presión con lengüetas en el tubo de 1/4". Coloque la cara distal del tubo en el centro del embudo del tambor. Reserve un (1) Luer macho de 1/4" para la canulación venosa en la muestra.
  7. Creación de circuitos arteriales
    1. Corte otro trozo de tubo de ~30" de 5/16" y conecte el extremo proximal de la lengüeta de salida derecha del oxigenador arterial. Corte este tubo aproximadamente a la mitad y conecte un conector Y de 1 5/16".
    2. Circuito de muestreo lateral: Cree un circuito de muestreo lateral duplicado como se describe en el paso 1.6.2 y conéctelo al aspecto inferior del conector Y, omitiendo la cubeta. Cuando haya terminado, conecte el Luer de salida de 1/8" al conector T.
    3. Corte un (1) trozo de tubo de 1/4" de 36" y colóquelo en la lengüeta del conector Y de 5/16".
    4. Repita el paso 1.6.7. Reserve un (1) Luer macho de 1/4" para la canulación arterial en la muestra.
  8. Creación de flujo venoso
    1. Corte ~30" de tubo de 1/4" y conecte 1 Luer macho de 1/4" al extremo proximal para conectarlo a la salida de la vena cava inferior (IVC) de la muestra. Fije el extremo distal a una de las lengüetas de entrada del depósito.
    2. Corte este tubo ~ 6 "del depósito y conecte Luers macho de 2 1/4" a cada extremo. Inserte una T hembra con una clave unida a la cara perpendicular para el muestreo.
  9. Introduzca el perfusado en el circuito como se describe en el paso 4. Vuelva a calentar y conecte la muestra como se describe en el paso 6.1.4. o el paso 6.2.4. y comenzar la perfusión.

2. Calibración del sensor CDI

  1. Asegúrese de que las botellas de gas del calibrador estén llenas e instaladas según el manual de instrucciones del usuario y que el monitor esté configurado en modo de calibración. Calibre según las instrucciones del fabricante.
  2. Una vez completada la calibración, desconecte el aparato sensor-cable-cabezal del monitor e intégrelo inmediatamente en los respectivos circuitos venosos y arteriales. Las conexiones Luer se crean en los pasos 1.6.2 y 1.7.2.

3. Iniciación del código

  1. Descargue, instale y abra el código Python que se encuentra en el repositorio de GitHub. Asegure la instalación adecuada del software Python y PyCharm.
  2. Cree una rama única para cada ciclo de perfusión para un registro de datos preciso. Una vez iniciado, se mostrará una GUI con dos ventanas. Oriente una ventana por pantalla para facilitar el control del hardware y la visualización de los parámetros de perfusión.
  3. Ajuste los parámetros de perfusión manualmente o automatice la perfusión a través de los botones respectivos que se muestran en la GUI (Figura complementaria 1).

4. Creación de perfusión y cebado del sistema

  1. Cebre el circuito aproximadamente 2 horas antes de la perfusión del órgano para permitir la corrección de los trastornos metabólicos/electrolíticos, el calentamiento a normotermia y la administración de anticoagulación, antibióticos y otros productos farmacéuticos.
  2. Perfusión porcina
    1. Obtener 2 L de sangre porcina entera tipo OO e introducirla en el depósito drenándola a través de una jeringa abierta de 50-100 mL. Tome aproximadamente 1 ml de sangre entera y mida el pH basal, los electrolitos y el hematocrito en una máquina de punto de atención.
    2. Administre alícuotas de bicarbonato de sodio al 8,4% según sea necesario para contrarrestar la acidez debida a los conservantes de sangre fría. Iniciar la hemodiálisis para normalizar la hiperpotasemia y la acidemia láctica según sea necesario y ajustar la dosis de hematocrito deseada. Ajuste el flujo de gas para ajustar los niveles fisiológicos de pO2 y pCO2.
    3. Administrar los productos farmacéuticos como se describe a continuación (sección 5).
    4. Conserve 1-2 L de sangre entera tipo OO para bolos intermitentes según sea necesario para mantener el hematocrito en ~ 30-40% durante todo el experimento de perfusión.
  3. Perfusión humana
    1. Obtener productos sanguíneos del tipo correspondiente de un banco de sangre (casi caducados o donados con fines de investigación).
      NOTA: Se requieren aproximadamente 4 unidades de glóbulos rojos empaquetados (RBC) y plasma para cada experimento de perfusión.
    2. Lave los glóbulos rojos para eliminar los conservantes y normalizar los alteraciones de electrolitos de la pelletización de glóbulos rojos antes de cebar. Lave los glóbulos rojos dos veces.
      1. Lavado de glóbulos rojos: Coloque pRBC y NaCl al 0,9% en una proporción de 1:1 en un tubo de centrífuga. Centrifugar a 1300 × g durante 15 min. Retire el sobrenadante con una pipeta y vuelva a administrar NaCl fresco al 0,9% en una proporción de 1:1 en el gránulo de RBC. Centrifugar de nuevo como se indicó anteriormente y eliminar el 2º sobrenadante para el pellet RBC lavado final.
    3. Introduzca los gránulos de glóbulos rojos lavados en el depósito utilizando una jeringa abierta de 50-100 ml. Coloque 4 unidades de plasma en el depósito y comience la circulación.
    4. Inicie la diálisis, las mantas térmicas y la entrada de gas una vez que la perfusión esté circulando.
    5. Perfusar muestras y aplicar intervenciones farmacológicas según sea necesario para asegurar niveles de perfusión casi fisiológicos como sea posible antes de la perfusión de órganos.
    6. Lave e introduzca gránulos de pRBC lavados adicionales y valore el estado del volumen a través de la hemodiálisis según sea necesario para mantener los niveles de hematocrito del 30-40%.

5. Intervención farmacológica y preparación de la infusión

  1. Administración de antibióticos y antifúngicos
    1. Combine dos viales de 2,5 g de piperacilina/tazobactam en un recipiente de muestra estéril con 40 ml de solución salina estéril. Agregue 10 mL al depósito como un "antibiótico principal".
      1. Diluir la mezcla restante con 60 mL de solución salina estéril y dividir en dos jeringas de 50 mL. Conecte una jeringa a una bomba de jeringa y prográmelo para que suministre continuamente 41 μL/min al sitio de infusión del fármaco de la vena porta (paso 1.6.6).
      2. Conserve el antibiótico restante en un refrigerador a 4 °C.
    2. Reconstituya un vial de 50 mg de anfotericina con 10 mL de agua estéril.
      1. Extraiga 1 mL de anfotericina concentrada y combínelo con 9 mL de solución salina estéril. Administre la mezcla de 10 mL al depósito para que sirva como un "cebador antifúngico" al comienzo de la perfusión.
      2. Administrar 1 mL de anfotericina concentrada cada 12 h en el depósito.
  2. Anticoagulación
    1. Combine 1 mL (100 mg) de enoxaparina con 49 mL de solución salina estéril. Administre una mezcla de 5 mL por litro de perfusión al comienzo de la perfusión para un "cebado de anticoagulación".
      1. Conserve la solución de enoxaparina restante en un refrigerador a 4 °C.
      2. Administrar la solución de enoxaparina (5 mL/1 L de perfusión) cada 12 h en el depósito.
  3. Esteroides
    1. Reconstituya 1 g de metilprednisolona con 20 mL de agua estéril.
    2. Prepare el sistema de acuerdo con las especificaciones de dosificación antes del inicio de la perfusión: Los hígados porcinos reciben 10 ml (500 mg) de metilprednisolona. Los hígados humanos parciales reciben 2 mL (100 mg) de solumedrol.
    3. Diluir la mezcla restante con 40 mL de solución salina en una jeringa de 50 mL y colocarla en una bomba de jeringa para suministrar continuamente 33 μL/min al sitio de infusión del fármaco de la vena porta (paso 1.6.6).
  4. Nutrición parenteral y sales biliares
    1. Reconstituya 1,7 g de ácido taurocólico con 50 mL de 10% de aminoácido + electrolito, componente de nutrición parenteral concentrado de TPN (sin mezclar con dextrosa) en un recipiente de muestra estéril. Extraer en una jeringa de 50 ml y colocarla en una bomba de jeringa para suministrar continuamente 83 μl/min al sitio de infusión del fármaco de la vena porta (paso 1.6.6).
  5. Control del tono vascular
    1. Vasodilatación: Reconstituya 0,5 mg de epoprostenol con 50 mL de solución salina estéril en un vaso estéril y colóquelo en una jeringa de 50 mL. Colóquelo en una bomba de jeringa y conéctelo a la clave proximal al sensor de flujo de la arteria hepática.
      1. Bolo o infusión continua (10 μL/min) según sea necesario para alcanzar la presión arterial media deseada y/o para contrarrestar el vasoespasmo.
    2. Vasoconstricción: Diluya 5 mL (50 mg) de fenilefrina con 45 mL de solución salina estéril en un vaso estéril y colóquelo en una jeringa de 50 mL. Almacene la mezcla en un refrigerador a 4 °C y un bolo según sea necesario para mantener la presión arterial media deseada.
      NOTA: Esto rara vez es necesario, y la reconstitución puede omitirse e implementarse solo según sea necesario.
  6. Calibración de sensores de presión y caudal
    1. Calibración de presión: Calibrar sensores de presión sin perfusar el flujo. Sensores de regeneración a cero si la lectura de presión no es cero se muestra según las instrucciones del fabricante mientras el extremo del tubo está abierto al aire para una presión de 0 mmHg. Asegúrese de que las mediciones de presión sean adecuadas obstruyendo suavemente los extremos proximal y distal del tubo para producir presiones elevadas.
    2. Calibración de flujo: Calibrar una vez que el circuito esté circulando perfusión antes de la perfusión del órgano para garantizar una medición precisa. Sujete el tubo distal a los sensores de flujo para cortar el flujo. Sensores de flujo de re-cero si el caudal es distinto de cero se muestran según las instrucciones del fabricante. Desenganche la tubería para permitir el flujo y la medición precisa del flujo.

6. Procuración hepática

  1. Adquisición de porcino
    NOTA: Los hígados de cerdo se adquieren de una carnicería local de acuerdo con los protocolos de manejo humanitario de ganado del USDA. El equipo de investigación guía la disección para incluir la vena cava infrahepática y suprahepática y el conducto biliar.
    1. Esterilice el hígado con yodo diluido en solución salina estéril y colóquelo en un recipiente estéril con hielo. Identificar la vena porta, la arteria hepática, la vena cava superior y el colédoco, canular y asegurar con lazos de seda 4-0.
      NOTA: El conducto biliar a menudo se canula con un angiocatéter fenestrado debido a su pequeño diámetro y para prevenir la obstrucción biliar de los sistemas biliares porcinos variantes.
    2. Enjuague la vena porta y la arteria hepática canuladas con 3 L de solución salina estéril fría (2 L PV: 1 L HA) seguida de 1 L de solución fría para la preservación de órganos (750 mL PV: 250 mL HA). Sumerja el hígado en la solución fría de conservación de órganos con hielo para su transporte.
    3. Prepare el sistema como se describe anteriormente (paso 4.1) hasta que se cumplan los parámetros fisiológicos.
    4. Sumerja el hígado canulado en solución salina estéril calentada para recalentar rápidamente y eliminar cualquier émbolo aéreo. Conecte el tubo de entrada adecuado a las cánulas de la vena porta y la arteria hepática. Valoración de la velocidad de la bomba para los valores fisiológicos de caudal y presión.
    5. Conecte la cánula de vena cava a la tubería de salida para facilitar la salida al depósito y completar el circuito.
    6. Drene la vesícula biliar de la bilis residual antes de conectar el tubo de la jeringa a la cánula del conducto biliar y un frasco cónico para la recolección.
  2. Adquisición humana
    1. Cebe el sistema como se describe anteriormente (paso 4.1).
    2. Obtener muestras humanas después de las resecciones oncológicas estándar indicadas. Mida los caudales in vivo mediante ultrasonidos intraoperatorios para su calibración en el sistema ex vivo . Identificar la vena porta segmentaria, la arteria hepática y el conducto biliar durante la disección quirúrgica. Transecte la tríada según la técnica quirúrgica estándar y entregue la muestra del campo quirúrgico a la mesa trasera estéril.
    3. Identificar y canular la vena porta segmentaria, la arteria hepática, la vena hepática y el conducto biliar, asegurándolos con lazos de seda 4-0 o sutura de prolene.
      NOTA: Omita la canulación de salida si el segmento no tiene una vena de salida dominante para evitar la hepatopatía congestiva. El flujo de salida de la cuenca funciona entonces como el tubo de salida de la vena hepática/IVC.
    4. Regrese al laboratorio ex vivo y pese la muestra. Sumerja la muestra en solución salina estéril calentada y conecte el tubo de entrada/salida correspondiente. Conecte la cánula del conducto biliar al tubo de la jeringa para el drenaje al vial cónico.
    5. Comience la perfusión y titule el flujo de la bomba para los parámetros de perfusión y caudal deseados.

7. Valoración de los parámetros de perfusión

  1. Perfusión de muestras de claves prehepáticas (circuitos laterales HA y PV) y posthepáticas (IVC o flujo de salida de cuenca) en numerosos puntos de tiempo para la valoración de los parámetros de perfusión en función de los valores de gases en sangre, electrolitos y hematocrito y hemoglobina en el punto de atención.
  2. Calibre los sensores CDI a lo largo de la perfusión utilizando los análisis manuales de muestras.
  3. Ajuste el flujo de entrada y salida de hemodiálisis en consecuencia para mantener el estado del volumen y la concentración de hematocrito del 30-40% y corregir cualquier alteración metabólica y electrolítica.
  4. Dosifique manualmente alícuotas de 5% de dextrosa, agua libre, 8,4% de bicarbonato de sodio y 0,9% de NaCl según sea necesario para corregir las anomalías electrolíticas.

8. Variantes del circuito de perfusión

  1. Adaptación del transporte
    1. Conecte las bombas a una fuente de alimentación móvil durante todo el recorrido para facilitar la perfusión continua en el camino a la máquina de imágenes. Conecte la fuente de alimentación móvil a la toma de CA para cargar la batería externa durante la perfusión.
    2. Desconecte la fuente de alimentación móvil de la toma de CA de la pared una vez concluido el experimento de perfusión.
    3. Desconecte el flujo de entrada de gas a los oxigenadores. Sujete el circuito lateral de hemodiálisis y desconecte el flujo de entrada de sangre al filtro. Detenga las bombas de dializado.
    4. Retire los sensores de flujo de la tubería de entrada. Desconecte las infusiones de medicamentos y apague las llaves de paso. Desconecte los sensores de presión del enchufe de entrada/salida.
    5. Mueva con cuidado el embudo de tambor y el tubo al carro móvil, que ahora es una unidad independiente y se puede transportar a la sala de imágenes.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Carreras porcinas representativas
Los hígados porcinos enteros se obtuvieron de un carnicero local para mejorar la rentabilidad y se perfundieron para varias fases de optimización y prueba del desarrollo de la máquina (Tabla complementaria 1). Aquí se evalúan las primeras 24 h de tres corridas hepáticas representativas (Figura 2). La presión arterial hepática media fue de 80 mmHg ± 11 mmHg, y la presión venosa portal media fue de 7,1 mmHg ± 3,3 mmHg con flujos de 107 mL/min ± 102 mL/min y 501 mL/min ± 329 mL/min, respectivamente. Las grandes desviaciones estándar de la presión y los flujos se correlacionan con la gran diferencia en el tamaño del hígado, con cerdos que oscilan entre 50 y 350 libras. Los circuitos duales de entrada permiten diferenciales fisiológicos de oxígeno con una saturación arterial media (SO2) de 95 ± 7,4% frente a la media de SO2 venoso portal de 85 ± 13% (p < 0,001). El flujo de salida deSO2 de las venas hepáticas fue de 74 ± 18%, indicativo de consumo de oxígeno (p < 0,01), y las mediciones de pH periférico estuvieron dentro de los rangos fisiológicos de 7,2 ± 0,09. Se monitorizaron parámetros fisiológicos adicionales como la hemoglobina total (9 ± 2,5 g/dL), los niveles de hematocrito (28,3 ± 6,4%), el nivel de glucosa (477 ± 15 mg/dL) y los cambios en lactato (3,0 ± 2,5 mmol) y potasio (-0,77 ± 2,3 mmol) durante la perfusión mediante muestreo a intervalos regulares. En el caso de las perfusiones porcinas, la producción de bilis fue indicativa de viabilidad orgánica. La vesícula biliar se drenó manualmente una vez que el órgano se volvió normotérmico, y el conducto biliar común se conectó a un pequeño tubo para su recolección. La producción total de bilis a lo largo de la perfusión fue de 41 ± 6,9 mL total, con una tasa de 6,9 ± 4,0 mL/h.

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Figura 2: Métricas de perfusión durante la perfusión hepática porcina (n = 3). (A) Tasas medias de entrada de sangre (mL/min) de la arteria hepática y la vena porta a lo largo del tiempo. (B) Presiones medias de entrada de sangre (mmHg) de la arteria hepática y la vena porta a lo largo del tiempo. (C) Comparación del porcentaje de saturación de RBCO2 entre la arteria hepática, la vena porta y la vena cava inferior que demuestra la diferencia de oxígeno entre las entradas dobles y el consumo de oxígeno en la salida. Se determinaron diferencias estadísticamente significativas entre las saturaciones de la vena porta y arterial (p < 0,0001), las saturaciones de la vena porta y la VCI (p < 0,01) y las saturaciones arteriales y de la VCI (p < 0,0001). (D) Evaluación del pH sanguíneo entre la arteria hepática, la vena porta y la vena cava inferior. (E) Niveles de hematocrito (%) y hemoglobina (g/dL) (arriba) a lo largo de la perfusión, además de cambios en PV potasio (mmol) (abajo) como marcador de hemólisis. (F) Niveles de glucosa del reservorio que reflejan la glucosa del circuito medio (mg/dL) a lo largo de la perfusión. (G) Cambio en el nivel de lactato (mg/dL) a lo largo de la perfusión en comparación con los valores de lactato en el tiempo 0 en la entrada de la arteria hepática, la salida de la VCI y la perfusión del sistema. (H) Producción de bilis (mL) a lo largo del tiempo durante la perfusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Carreras humanas representativas
Se perfundieron tres segmentos hepáticos humanos portadores de tumores, con un tiempo de perfusión que osciló entre 48 y 72 h, dependiendo de los requerimientos del experimento (Figura 3). Para comparar los datos entre series de aplicación representativas, se evaluaron las primeras 48 h de los valores bioquímicos. Parámetros de perfusión aproximados in vivo con entrada venosa portal continua de baja presión y alto volumen y entrada arterial pulsátil de alta presión y bajo volumen, que se muestran en tiempo real para permitir una fácil valoración. Si el hígado no alcanzaba los valores bioquímicos fisiológicos dentro de las dos horas posteriores a la perfusión, se daba por terminado el experimento. Para el éxito de las perfusiones hepáticas, la presión arterial hepática media fue de 84 mmHg ± 11 mmHg, y la presión venosa portal media fue de 9 mmHg ± 4 mmHg con flujos de 113 mL/min ± 66 mL/min y 317 mL/min ± 302 mL/min, respectivamente. Los circuitos duales de entrada permiten diferenciales fisiológicos de oxígeno con una saturación arterial media (SO2) del 98% ± 3% en comparación con la media del SO2 venoso portal del 92% ± 7% (p < 0,0001). ElSO2 del flujo de salida de las venas hepáticas fue del 86% ± 9%, indicativo de consumo de oxígeno (p < 0,0001), y las mediciones de pH en todo el sistema estuvieron dentro de rangos fisiológicos de 7,3 ± 0,09. Se monitorizaron parámetros fisiológicos adicionales como la hemoglobina total (10,2 g/dL ± 1,6 g/dL), los niveles de hematocrito (30,2% ± 5,5%), el nivel de glucosa (170 mg/dL ± 68 mg/dL) y los cambios en el lactato (3,6 mmol/L ± 2,2 mmol/L) a lo largo de la perfusión mediante muestreo a intervalos regulares. En un ciclo representativo, se produjo un promedio de 1,4 mL/h de bilis. Antes y al final de los experimentos de perfusión, se obtuvieron biopsias para el análisis de tejidos. Las secciones de tejido representativo muestran parénquima hepático, tumor neuroendocrino metastásico y adenocarcinoma colorrectal metastásico después de la perfusión.

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Figura 3: Perfusión y métricas tisulares durante la perfusión de segmentos hepáticos humanos (n = 3). (A) Tasa media de entrada de perfusión (mL/min) para la arteria hepática y la vena porta. (B) Presión media de entrada de perfusión (mmHg) para la arteria hepática y la vena porta a lo largo del tiempo. (C) Saturación de oxígeno de los glóbulos rojos (%) para la arteria hepática de entrada, la vena porta de entrada y la vena hepática de salida. Se determinaron diferencias estadísticamente significativas entre las saturaciones de la vena porta y arterial (p < 0,0001), las saturaciones de la vena porta y de la VCI (p < 0,0001) y las saturaciones arteriales y de la VCI (p < 0,0001). (D) Perfundir el pH de la arteria hepática de entrada, la vena porta de entrada y la vena hepática de salida. (E) Métricas de glóbulos rojos a lo largo de la perfusión, incluidos los niveles medios de perfusión de hematocrito (%) y hemoglobina (g/dL) (arriba) con cambios en el potasio perfusionado (mmol) desde el inicio a lo largo del tiempo (abajo). (F) Concentración media de glucosa (mg/dL) para la arteria hepática de entrada, la vena porta de entrada y la vena hepática de salida a lo largo del tiempo. (G) Cambio en la concentración de lactato de perfusión (mg/dL) desde el inicio a lo largo del tiempo para la arteria hepática de entrada, la vena hepática de salida y la perfusión sistémica. (H) Producción de bilis (mL) a lo largo del tiempo. (I) Segmentos de hígado humano (Couinaud II-IV) durante (izquierda) y después de la perfusión (derecha) que demuestran la ausencia de necrosis por presión después de la optimización del sistema. Área superficial de cauterización presente en la parte superior de la imagen izquierda debido a hemostasia intraoperatoria. (J) Sección de tejido post-perfusión que demuestre parénquima hepático (tinción de hematoxilina y eosina, 10x, recuadro 40x; barra de escala 50 μM). (K) Sección de tejido post-perfusión que demuestre tumor neuroendocrino metastásico (tinción de hematoxilina y eosina, 10x, recuadro 40x; barra de escala 250 μM). (L) Sección de tejido post-perfusión que demuestre adenocarcinoma colorrectal metastásico (tinción de hematoxilina y eosina, 10x, recuadro 40x; barra de escala 50 μM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aplicación representativa: Imágenes por TC de muestras perfundidas
La capacidad de integrar fuentes de datos clínicos, como la tomografía computarizada (TC) o la resonancia magnética (RM), con la patología permite avanzar en el diagnóstico y la medicina personalizados. Sin embargo, los informes de patología son hallazgos resumidos, y la heterogeneidad inherente a los tumores sólidos supera con creces las capacidades humanas para la delineación. Una posible solución es la obtención de imágenes ex vivo seguida de la preparación inmediata de secciones de tejido a macroescala para permitir la integración radiómica de datos celulares que preservan espacialmente (por ejemplo, transcriptómica espacial, inmunofluorescencia altamente multiplex). Para acomodar las imágenes convencionales en el sistema, se construyó una configuración móvil, que incluía la transición de las bombas a una fuente de batería externa para proporcionar energía ininterrumpida durante el transporte y la obtención de imágenes (Figura 4A). Con el hígado en la mesa de TC, se administró contraste yodado y se obtuvieron imágenes que muestran características radiográficas consistentes con las adquiridas in vivo (Figura 4B).

Aplicación representativa: Perfusión renal y pancreática
Innato a su diseño, el sistema es adaptable a la perfusión de órganos adicionales (Figura 4C-F), lo que obvia la necesidad de un flujo de entrada dual y, por lo tanto, disminuye los costos por uso. Para demostrarlo, extirpamos el circuito venoso portal para una sola entrada arterial (Figura complementaria 2) y perfundimos un riñón humano (Figura 4C) y un páncreas parcial humano (Figura 4E). Las secciones representativas de tejido después de la perfusión muestran glomérulos (Figura 4D) e islotes de Langerhans (Figura 4F).

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Figura 4: Aplicación representativa de las máquinas de perfusión: TC y modularidad de órganos. (A) Adaptación móvil del sistema para el transporte. (B) Imágenes representativas de TC del hígado con tumor después de la administración de contraste yodado in vivo (arriba) y ex vivo después de la perfusión (abajo). (C) Perfusión renal humana en la máquina reconfigurada para entrada única. (D) La sección de tejido post-perfusión muestra glomérulos renales y conductos colectores (tinción de hematoxilina y eosina, 8x; barra de escala 250 μm). (E) Perfusión de páncreas distal humano en la máquina reconfigurada para entrada única. (F) La sección de tejido post-perfusión muestra islotes pancreáticos (tinción de hematoxilina y eosina, 8x; barra de escala 250 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Configuración del código Python para facilitar la perfusión semiautomatizada. Esquema que representa los parámetros de entrada y salida utilizados por el código que permite la semiautomatización con la adición de ajustes manuales comúnmente empleados (Tabla). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Esquema de entrada única utilizado para la perfusión de riñón y páncreas. Sensor P/F: Sensores de presión y caudal. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Optimización de los glóbulos rojos. (A) El experimento de perfusión solo en sangre demostró significativamente menos hemólisis en condiciones de bajas RPM en comparación con las condiciones de altas RPM (p < 0.01) utilizando hemoglobina libre de plasma como sustituto de la lisis celular. (B) La comparación cualitativa de la hemólisis plasmática a lo largo del tiempo demuestra visualmente menos hemólisis en estados de bajas RPM en comparación con los estados de altas RPM. (C-F) Evaluación de la hemólisis en sistemas con diferentes niveles de resistencia e integración de la cuenca con sustitutos de plasma: (C) Se determinó una diferencia significativa en los niveles de lactato entre la configuración del circuito paralelo y la configuración cerrada y de la cuenca (p < 0.0001 y p < 0.0001, respectivamente). (D) Se determinó una diferencia significativa en los niveles de potasio entre la configuración del circuito paralelo y la configuración en serie cerrada y en serie con cuenca (p < 0.0001 y p < 0.0001, respectivamente). (E) Se determinó una diferencia significativa en los niveles de hematocrito entre la configuración del circuito paralelo y la configuración de la serie cerrada y la serie con cuenca (p < 0.0001 y p < 0.0001, respectivamente). (F) Se determinó una diferencia significativa en los niveles de hemoglobina entre la configuración de circuito paralelo y la configuración de serie cerrada y serie con cuenca (p < 0.0001 y p < 0.0001, respectivamente). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 1: Perfusiones de optimización de órganos porcinos. Treinta y cinco experimentos de perfusión porcina realizados durante las fases de optimización, incluyendo 25 hígados parciales, 2 riñones y 8 hígados enteros. Se incluye la duración de la perfusión y el motivo de la terminación. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 2: Validación hepática humana y perfusiones de aplicación. Catorce perfusiones hepáticas parciales humanas, incluyendo hepatectomías formales izquierda y derecha que abarcan experimentos de perfusión de un solo segmento. Se incluyen la patología, el objetivo experimental, la duración de la perfusión y la justificación de la terminación. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 3: Optimización de solo perfusión. Veintidós ejecuciones de optimización de solo perfusión, incluido el tipo de especie, el objetivo experimental, la duración del experimento y el motivo de la finalización. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

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Las máquinas de perfusión normotérmica comúnmente empleadas antes del trasplante de órganos sólidos han permitido avances significativos en la perfusión ex vivo. Si bien su uso con órganos parciales es técnicamente factible en algunos casos 7,8,9, siguen siendo inaccesibles para el investigador debido a los altos costos y la disponibilidad limitada. En este trabajo, buscamos proporcionar una alternativa comparable y de código abierto a la comunidad de investigación en general mediante el uso de componentes de fácil acceso y código de libre acceso para ejecutar el sistema para una amplia gama de puntos finales de investigación.

Varios pasos dentro del protocolo son esenciales para lograr una perfusión estable de órganos. Uno de los pasos más críticos es la descarga efectiva de la presión para prevenir el colapso parenquimatoso y la dilatación sinusoidal. Esto se logró mediante la implementación de espuma viscoelástica apoyada por un diafragma oscilante para distribuir uniformemente el peso del órgano y mantener la presión portal cercana a la atmosférica para un drenaje adecuado. El uso inicial de una rejilla metálica para sostener el hígado resultó en colapso parenquimatoso y congestión sinusoidal, como se observó en el análisis histológico y en las imágenes de ultrasonido durante la perfusión. Esto se resolvió parcialmente mediante la transición a una hamaca de silicona perforada. Si bien la necrosis por presión macroscópica se resolvió, todavía había evidencia notable de colapso parenquimatoso, como lo demuestran las altas presiones de la vena porta y los especímenes significativamente congestionados después de 48 h de perfusión. También se intentó sumergir el hígado en solución salina o sangre y tuvo éxito en aliviar la congestión y la hipertensión portal; Sin embargo, no fue factible debido a la gran cantidad de perfusión requerida, la dificultad para mantener la esterilidad y la falta de un drenaje eficiente en el depósito. En comparación con la técnica de flotación, observamos la misma presión portal cercana a la atmosférica cuando el hígado se colocó sobre un cojín de espuma viscoelástica con un diafragma oscilante para dispersar el peso de manera más uniforme (Figura 1B y Figura 3I). Este diseño da como resultado segmentos más suaves y mejor perfundidos, al tiempo que permite un drenaje fácil y eficiente de la salida de sangre de la muestra.

Un segundo paso crítico es minimizar la resistencia del circuito que imparte tensión de cizallamiento en los glóbulos rojos para prevenir la hemólisis. Esto se logró mediante la introducción de circuitos laterales con componentes restrictivos para facilitar el flujo fisiológico sin someter la perfusión a presiones innecesarias. La hemólisis es un proceso inevitable y continuo durante la perfusión de la máquina. En las primeras iteraciones del sistema, la hemólisis extensiva contribuyó significativamente a la terminación temprana. El esfuerzo de cizallamiento que el sistema imparte a los glóbulos rojos proviene principalmente de las bombas debido a la estasis de perfusión y la recirculación, además de los diámetros estrechos de los tubos y las membranas. Las bombas empleadas actualmente provocan cierto grado de hemólisis, que aumenta con el tiempo. La eficiencia de la bomba es un factor importante en la hemólisis, ya que los flujos más altos podrían ser beneficiosos debido a las tasas más bajas de reciclaje de sangre y flujo secundario, mitigados por un mayor volumen de perfusión y/o velocidades de bombeo más bajas. Dado que a menudo es difícil adquirir grandes volúmenes de glóbulos rojos, centramos nuestros esfuerzos en rediseñar el sistema para proporcionar caudales fisiológicos a velocidades de bombeo más bajas, impartiendo una menor resistencia en el circuito en general31. Para disminuir aún más la resistencia intrínseca del circuito, integramos circuitos laterales en paralelo, lo que resultó en niveles más bajos de lactato y potasio y niveles más altos de hematocrito y hemoglobina con el tiempo (Figura complementaria 3). Por último, el hemofiltro actual está integrado en el circuito lateral de la vena porta con sangre impulsada por una bomba peristáltica que confiere una importante cantidad de hemólisis debido a la notable resistencia y esfuerzo cortante impartido tanto por el filtro como por su bomba. Uno de nuestros esfuerzos de optimización actuales se centra en eliminar este circuito lateral mediante la investigación de la posible implementación de tubos de hemodiálisis en el depósito. La eliminación de los hemofiltros de grado clínico permitiría la extracción posterior de la bomba peristáltica, minimizaría aún más la hemólisis y reduciría el costo total del sistema.

A pesar de la utilidad y adaptabilidad del sistema aquí descrito, se deben reconocer las limitaciones. Cabe destacar que la duración de la perfusión viable es reproducible de 3-4 días. La hemólisis sigue siendo un factor central que limita la longevidad de la perfusión, como se ha comentado anteriormente. Sin embargo, encontramos que aumentar significativamente el volumen total de perfusión puede extender sustancialmente la duración de la perfusión si se requieren tiempos de perfusión más largos, pero esto aumenta la utilización de recursos más allá de lo que describimos aquí. La duración óptima de la perfusión dependerá, en última instancia, de la pregunta experimental específica que se haga al sistema. Por ejemplo, los estudios que investigan la cinética de administración de fármacos o la inhibición de la vía pueden realizarse eficazmente durante 2-12 h, mientras que las cuestiones relacionadas con el reclutamiento de células en el microambiente tumoral pueden requerir 48 h32. Extender la viabilidad más allá de la ventana actual puede ser importante para aplicaciones como la remodelación de la matriz extracelular (es decir, fibrosis), pero creemos que la mayoría de las aplicaciones relacionadas con el cáncer no requerirán el gasto de recursos adicional. El enfoque principal se centró en las aplicaciones traslacionales orientadas a la oncología, con el objetivo de mantener los tumores humanos en un entorno ex vivo controlado en el que la terapia pueda administrarse a través del parénquima intacto y la vasculatura tumoral, condiciones que replican más de cerca las complejidades de los escenarios in vivo25. En este escenario, el sistema aborda problemas de larga data en los modelos oncológicos preclínicos actuales relacionados con la administración de fármacos, la heterogeneidad tumoral y el metabolismo de los fármacos, lo que puede explicar el frecuente fracaso en traducir el éxito preclínico en eficacia clínica33,34.

En comparación con las máquinas comerciales existentes, el sistema ofrece importantes ventajas de costes, escalabilidad modular y flexibilidad experimental. Los dispositivos comerciales suelen ser patentados, costosos y optimizados para la perfusión de órganos completos en entornos de trasplante. El sistema es escalable de una manera que las máquinas comerciales no lo son, de modo que podemos imaginar su aplicabilidad de manera amplia. El sistema presentado aquí no es un producto final, sino más bien un anteproyecto, que puede modificarse, adaptarse y reutilizarse para adaptarse a una amplia variedad de intereses de investigación y preguntas experimentales, llenando un vacío para los científicos de muchas disciplinas.

Las direcciones futuras de esta plataforma incluyen la reducción a segmentos hepáticos subsegmentarios y el volumen de perfusión para permitir el uso de productos sanguíneos autólogos para respaldar aplicaciones de inmunooncología. También estamos trabajando para integrar plataformas multiómicas e imágenes en tiempo real para proporcionar un seguimiento dinámico de la respuesta al tratamiento, allanando el camino para estudios farmacológicos detallados. Esperamos que el sistema fomente la colaboración y la innovación en un esfuerzo por forjar nuevas profundidades de conocimiento en múltiples campos de la ciencia traslacional.

Divulgaciones

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Los autores no informan de conflictos de intereses en este estudio y sus hallazgos. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el programa de investigación intramuros de los Institutos Nacionales de Salud. Fuente de financiación para las imágenes de muestras y la radiómica preliminar respaldada por el Premio de Investigación para Médicos del Personal Identificación de la Propuesta 231145 a Elliot Levy.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores desean reconocer y expresar su agradecimiento en apoyo de este proyecto a los siguientes grupos: Departamento de Medicina Transfusional de los NIH, Departamento de Medicina Perioperatoria de los NIH, Departamento de Patología de los NIH, Wagner's Meats.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" Pared Versilon  C-219-A Tubería de PVC flexibleCorporación de plástico de EE. UU.57682
Jeringas de 10 cc con punta BD Luer-LockBD302995
Jeringas de 1cc con punta BD Luer-LockBD309628
25 Cánula del Portal del P.XVIVO11.01.520
Soporte para sensor de flujo impreso en 3DN/AN/Aconsulte GitHub para archivos SDL
Soporte magnético impreso en 3DN/AN/Aconsulte GitHub para archivos SDL
48 pulg. H x 24 pulg. W Tablero perforado blancoHome Depot109099
Llave de paso de 4 vías, amarillo, 2 cerraduras Luer hembras, Luer macho con bloqueo giratorioInstrumentos de precisión del mundo14057-10
Jeringas de 50 cc con punta BD Luer-LockBD309653
ACF00023 Tygon S3  por Saint Gobain | 5/16" I.D. x 1/2" O.D. x 3/32" Pared | E-3603 Sin DEHP | Tubos de laboratorio libres de ftalatos | Longitud del paquete de 50'Almacén de manguerasACF00023
AnfotericinaFarmacia VeterinariaN/Ahttps://mms.mckesson.com/product/505635/Xgen-Pharmaceuticals-39822105505
Accesorio de púas, conector en Y, diámetro interior del tubo de 3/8", PP, 5/PKVWRMFLX06368-24El tipo de material no es crítico
Calibrador CDI 540Terumo540CL
Soporte de cabeza de cable CDITerumoCDI519CL
CDI MonitorTerumo500AVHCTCL
Abrazadera de poste CDITerumoCDI517CL
Conector de tubo Clave IV sin aguja 100/CaHenry Schein Dental1097422
Clinimix con electrolitosBaxterModelo 2B7721Solo use el lado de aminoácidos, no mezcle con el lado de dextrosa
CO2 USP Grado 50 LBEl oxígeno de RobertR25
Monitores de computadora para GUIN/AN/Acualquier tipo de pantalla para ver la GUI
Dispositivo de adquisición de datosComputación de mediciónVersión USB-202necesidad 2 o 3, dependiendo de cómo esté conectada la maquinaria
Fuente de alimentación de escritorio para bombaLevitronix100-40015necesita 2, uno para HA y otro para PV
Embudo de tambor Eagle 1662 con pantalla de latón, 18" de diámetro x 7" de altura, amarilloGlobal IndustrialWB440139
EpoprostenolFarmacia VeterinariaN/Ahttps://mms.mckesson.com/product/1239813/Sun-Pharmaceuticals-62756005940
Luer hembra ¼ " Púa en sala limpia de nailon natural fabricada; Paquete de 10VWRMFLX40314-26El tipo de material no es crítico
Adaptadores de Conexión, Polipropileno, Recto, Hembra Luer a Hosebarb, 1/8" ID; 25/PKVWRMFLX30800-08El tipo de material no es crítico
Adaptador, Polipropileno, Recto, Macho Luer Lock a Hosebarb, 1/8" ID; 25/PKVWRMFLX30800-18El tipo de material no es crítico
Accesorio, PVDF, Recto, Reductor de Manguera, 5/16" ID x ¼ " ID; 10/PKVWRMFLX40614-62El tipo de material no es crítico
Soportes de flujo N/AN/Aconsulte GitHub para archivos SDL
Abrazadera del sensor de flujoClaveFD-XC20R1
Controlador del sensor de flujoClaveFD-XA1
Cabezal del sensor de flujoClaveFD-XS20
Fuente de alimentación del sensor de flujoClaveMS2-H50
Mezclador de gas Pregunta múltipleGB100+2necesita 2, uno para HA y otro para PV
Botella de gas A, CDI 500TerumoCDI506
Botella de gas B, CDI 500TerumoCDI507
Kit de glucagón, glucagón 1 mg, agua estéril 1 ml, vialFresenius0593-03
CUBETA H/S 1/4x1/4 W/6" EXT 1CA=10EA 70-2006-4298-4Terumo6934
Depósito rígido con 150 µ Filtro MCorporación de Hemonáutica00205-00
Almohadilla de calor frío, Mul-T-Pad, Tamaño de almohadilla TP12E 13" x 18" para bomba Gaymar TP700Mul-T-Pad8002-062-012https://www.amazon.com/Heat-Cold-Mul-T-Pad-Gaymar-TP700/dp/B00HFF7876. De  tenga en cuenta que Stryker también proporciona camisas de agua calentadas similares a las del "Mul-T-Pad C2Dx 8002-062-012"
InsulinaFarmacia Veterinariahttps://mms.mckesson.com/product/294668/Novo-Nordisk-Pharmaceutical-00169183311
Bomba Ismatec Modelo Ecoline VC-280 IIIsmatecISM1078B-115
Ventilador pediátrico LTV 1200Carefusionhttps://coastbiomed.com/product/carefusion-ltv-1200-ventilator/?srsltid=AfmBOopSCKwTLmKhZXcI
CgGQHfiKwj__78jNWxVaznJCS
aq3RjXw2E-H.
Este modelo de ventilador pediátrico se reutilizó a partir del excedente hospitalario y no se compró. Cualquier bomba intermitente comercial o máquina de aireación es un reemplazo adecuado.
Cable de la bomba principalLevitronix190-10331necesita 2, uno para HA y otro para PV
MaPerSol Solución de Preservación de Órganos, Bolsa de 1LSoluciones de preservaciónPS005
Masterflex Adaptadores de Accesorios, Luer a Luer, Tee, Avantor VWRMFLX45508-56El tipo de material no es crítico
Masterflex Lengüeta Luer hembra de 3/16" de diámetro interior en PVDF natural fabricado en sala limpiaVWRMFLX40314-22El tipo de material no es crítico
Bomba digital Masterflex Ismatec Reglo con MasterflexLive, 4 canales, 8 rodillos; 115/230 VCAMasterflexMFLX78018-22https://www.avantorsciences.com/us/en/product/NA5139147/masterflex-ismatec-reglo-digital-multichannel-pumps-avantor
Masterflex Macho Luer 1/4" ID Barb en PVDF Natural Fabricado en Sala Limpia, 10/PKVWRMFLX40318-27El tipo de material no es crítico
Masterflex Macho Luer 3/16" ID Barb en PVDF Natural Fabricado en Sala LimpiaVWRMFLX40318-22El tipo de material no es crítico
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