Detección de microorganismos ambientales con la reacción en cadena de polimerasa y la electroforesis en Gel de

1. muestras

1. Recoger el suelo con una barrena o pala a una profundidad determinada. Recogida de suelo de la rizosfera (región estrecha del suelo circundante e influenciado por raíces de las plantas y los microbios asociados), sólo recoger directamente alrededor de las raíces de la planta golpeando el suelo en un barril de la colección.
2. Recoger muestras de agua sumergiendo una botella de plástico estéril en el agua sujetando el extremo del palillo que sumerge.

2. los ácidos nucleicos extracción y preparación

1. Recoger organismos y virus de la muestra y extraer el ADN y el ARN de ellos. Para obtener más información, consulte la enseñanza de las Ciencias JoVE video de extracción de ácidos nucleicos de comunidad.
2. Almacenar el ADN extraído en los tubos del microfuge etiquetados. Si el ADN debe almacenarse durante la noche o durante períodos prolongados de tiempo, congelarlo a-20 ° C y descongelar los tubos a temperatura ambiente cuando esté listo para su uso.
3. Si el material genético a ensayarse RNA (sea el genoma de los virus ARN y el ARN transcrito de organismos celulares), realizar la transcripción reversa (RT) en la muestra para crear ADN complementario (cDNA) antes de proceder a la PCR. Para obtener más información, consulte la enseñanza de las Ciencias JoVE video de RT-PCR.

3. reacción en cadena de polimerasa

1. Colocar la enzima de la polimerización en cadena (por ejemplo, Taq polimerasa) en el hielo y deshielo de los otros reactivos (tampón PCR, dNTPs, cebadores) dentro de una campana "limpia" designada a temperatura ambiente. La enzima se almacena a-20 ° C pero nunca se congela. Es de sensibles a la temperatura y así que debe estar fresco y su exposición a temperatura ambiente minimizado
2. Calcular el volumen de cada reactivo que se necesita para hacer un "master mix" de todos los reactivos que son constantes entre todas las reacciones (tabla 1). Asegúrese de que cuenta para positivos (por ejemplo, una plantilla que contiene la región de destino) y controles negativos (p. ej., no plantilla) en los cálculos. Agregar un 10% adicional al volumen final para tener en cuenta errores de pipeteo. Volúmenes de cartilla dependen de ensayos para microorganismos específicos; Consulte la bibliografía para los valores apropiados.
3. Usando una microcentrífuga de unión bajo tubo, que reduce al mínimo la adhesión de moléculas de reactivo a las paredes de plástico, agregar el volumen calculado de cada reactivo para montar la mezcla principal. Suavemente el vortex y centrifugar cada reactivo antes de agregar. Una vez que el amo de la mezcla es preparada, vortex para mezclar y recoge por centrifugación
4. Preparar tiras de 8 tubos PCR. Designar un tubo para cada muestra, incluyendo controles positivos y negativos
5. Distribuir el volumen apropiado de la mezcla PCR en cada tubo de la tira
6. Añadir el volumen adecuado de la plantilla de la DNA de las muestras, así como 5 μL de la plantilla de positivo y 5 μL de agua grado molecular como control negativo, en los respectivos tubos PCR.
7. Coloque la tapa firmemente en la franja de 8-tubo y centrifugar unos segundos con un minicentrifuge
8. Coloque la tira de 8 tubos en un termociclador
9. Establecer el programa PCR apropiado para funcionar en el termociclador. Un programa típico consta de los siguientes
   1. Desnaturalización a 94 ° C por 3 min.
   2. 30 – 40 ciclos de amplificación: desnaturalización a 94 ° C por 30 s, recocido a temperatura de cartilla específica (generalmente entre 50 – 60 ° C) durante 30 s y extensión a 72 ° C por 30 s / 500 bp.
   3. Extensión final a 72 ° C durante 7-10 minutos.

4. preparación del Gel de agarosa

1. Basado en el volumen deseado de gel y gel de concentración (tabla 2), pesar la cantidad adecuada de agarosa en polvo en un erlenmeyer de 125 mL.
2. Añadir el volumen adecuado de funcionamiento gel tampón en el matraz y agitar el matraz con la mano.
3. Calentar la mezcla de buffer-agarosa en un microondas a potencia alta durante 1 minuto.
4. Quitar el matraz del microondas y agitar a mano para asegurarse de que la agarosa se disuelva. Si la agarosa no ha disuelto completamente, repita el microondas en incrementos de 30 s.
5. Después de asegurar bien la tapa en el frasco, enfriar a 50 ° C girando bajo el chorro de agua fría.
6. Añadir 1 μL de bromuro de etidio (EtBr) a la mezcla de agarosa utilizando un micropippette designado para las EtBr. EtBr es un colorante que se une ácidos nucleicos de doble hebra y fluorescencia naranja cuando se ilumina con luz UV. Nota que EtBr es potencialmente cancerígeno, por lo que debe usarse equipo de protección personal (gafas, bata de laboratorio, guantes resistentes de EtBr).
7. Verter el gel derretido en una bandeja de fundición del gel de electroforesis. Asegúrese de que no hay burbujas quedan atrapadas dentro de la agarosa. Coloque un peine en el gel y sujete firmemente. Esperar unos 20-30 min para el gel se solidifique.
8. Una vez que el gel se ha solidificado, retirar el peine cuidadosamente sin causar cualquier lágrimas en el gel. El peine crea pocillos en el gel para la carga de las muestras.

5. electroforesis

1. Coloque el gel de agarosa solidificada en la cámara de electroforesis.
2. Añadir el buffer corriente adecuado en la cámara hasta que el gel esté apenas sumergido.
3. Sobre un trozo de Parafilm, pipetee puntos de carga de tinte concentrado. También incluye una escalera de DNA de un rango adecuado para los tamaños esperados de los productos PCR. Como alternativa, utilice una nueva serie de tubos de microcentrífuga, uno para cada muestra.
4. Una vez completada la polimerización en cadena, recuperar esa franja de tubo de 8 en el termociclador y centrifugar brevemente para recoger cualquier condensados. Añadir un volumen adecuado de producto ADN carga colorante y pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Por ejemplo, 2 μl de 10 x carga colorante se mezcla con 8 μl de la muestra a un volumen final de 10 μl, con el tinte en 1 x.
5. Pipetee cada mezcla de tinte-muestra en los pocillos designados en el gel de agarosa, teniendo cuidado de no perforar los pozos.
6. Conecte los electrodos a la cámara de electroforesis. ADN está cargado negativamente, por lo que "corre" hacia el electrodo positivo. Por lo tanto, conectar el electrodo positivo hacia el lado opuesto de la cámara, donde fueron cargados a los pozos. Establecer la fuente de alimentación a una tensión apropiada para el sistema de buffer y el tamaño de la cámara de gel y ponerlo a funcionar. Pequeñas burbujas deben ser visibles en movimiento hacia los lados de la cámara si la electroforesis está procediendo correctamente.
7. Una vez que el frente de tinte ha avanzado lo suficiente por el gel, apague la fuente de alimentación. Cuidadosamente el gel en el transiluminador o imágenes visuales de transporte y encienda la UV luz para visualizar las bandas de ADN en el gel.
8. Analizar el tamaño de banda y las posiciones en el gel. Comparar las posiciones de la banda de las muestras para el control positivo para determinar si el ADN del organismo de interés está presente en la muestra (figura 1).

Componente	Volumen por tubo (μL)	Volumen para 5 tubos (μL)	Concentración final
10 x Ex buffer Taq	5.0	25	1 x
dNTPs 2,5 mM	4.0	20	0,2 mM
Primer avance *	2.0	10	400 nM
Primer revés *	2.0	10	400 nM
Molecular H2O	31.75	158.75	-
Ex Taq	0.25	1.25	2.5 U
Mezcla PCR	45	225

Tabla 1. Los volúmenes de reactivos para PCR master mix. * Volúmenes cartilla varían de ensayo del organismo. Ajustar el volumen de agua de grado molecular para que el volumen final 45 μL. Volúmenes de otros componentes no deben variar.

Recomendada % de agarosa	Resolución óptima para Fragmentos de ADN lineal (pares de bases)
0.5	1.000-30.000
0,7	800-12.000
1.0	500-10.000
1.2	400-7.000
1.5	200-3.000
2.0	50-2,00

Tabla 2. Gamas del tamaño del fragmento de ADN óptimamente resueltas por gel de agarosa diferentes porcentajes.