Detección de microorganismos ambientales con la reacción en cadena de polimerasa y la electroforesis en Gel de

La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una técnica biológica fundamental que se aplica ampliamente para detectar e identificar microorganismos presentes en muestras de suelo, agua y otros ambientales.

Clásicamente, los microorganismos se cultivan en laboratorios utilizando medios de crecimiento especializados. Sin embargo, muchos microbios en el entorno natural son "no cultivables", ya sea porque tienen una actividad metabólica o una tasa de crecimiento muy bajas, o porque tienen requisitos de crecimiento muy estrictos que pueden no ser replicables en una placa de cultivo. Las diferencias en la cultivabilidad entre los microbios también significan que, cuando se cultivan microorganismos de una muestra ambiental, su abundancia relativa en cultivo puede no reflejar sus niveles reales en el medio ambiente.

El advenimiento de la PCR, que puede amplificar específicamente incluso pequeñas cantidades de ADN presente en una muestra mixta, permite detectar e identificar rápidamente microbios específicos de interés, incluso los que no son cultivables, dentro de la compleja variedad de organismos presentes en una muestra ambiental.

Este video presentará los principios de la PCR. A continuación, se discutirá un protocolo general para realizar PCR en ADN aislado de una muestra ambiental con el fin de detectar la presencia de un organismo de interés. Por último, se explorarán varias aplicaciones de la identificación de microbios basada en PCR.

La premisa básica de la PCR es utilizar ciclos repetidos de cambios secuenciales de temperatura para lograr una amplificación exponencial del ADN, generalmente con una máquina conocida como termociclador para recorrer automáticamente las diferentes temperaturas. La síntesis de ADN se lleva a cabo mediante enzimas ADN polimerasa que se obtienen de bacterias que viven en aguas termales, como Thermus aquaticus o "Taq". Estas polimerasas son termoestables, lo que les permite soportar las altas temperaturas utilizadas durante la PCR.

La secuencia diana, conocida como amplicón, se amplifica a partir de la plantilla de ADN utilizando dos tramos cortos de nucleótidos conocidos como "cebadores". Debido a la alta especificidad de la unión complementaria de ácidos nucleicos, los cebadores permiten la amplificación dirigida de secuencias de interés muy específicas. Al diseñar cebadores que solo amplificarán una secuencia única, o una combinación única de secuencias, de un organismo de interés, la PCR se puede utilizar para detectar diferencialmente la presencia del ADN de ese organismo entre todos los materiales genéticos presentes en una muestra ambiental compleja.

Cada ciclo de PCR se divide en tres fases. La primera, conocida como "desnaturalización", suele situarse por encima de los 92 ? C y dura unos 30 s. La desnaturalización se utiliza para romper las moléculas de ADN en hebras individuales, para permitir que la reacción de amplificación continúe.

La segunda fase, "recocido", se establece 2 a 3 ? C por debajo de la temperatura de fusión más baja de los dos cebadores, generalmente entre 50 y 65 ? C, y también dura unos 30 s. La temperatura de fusión es la temperatura a la que el 50% de las moléculas de ADN bicatenario se han separado en hebras simples, por lo que el paso de recocido permite que los cebadores se unan a sus sitios objetivo en la plantilla de ADN.

La tercera fase de un ciclo de PCR es la "elongación" o "extensión", cuando la ADN polimerasa se une al dúplex cebador-molde y cataliza la síntesis de las nuevas hebras. Fijado en 72 ? C para la polimerasa de PCR más comúnmente utilizada, Taq, la duración de esta fase depende de la longitud del amplicón, generalmente 30 s por 500 pares de bases. Después de cada ciclo, el ADN amplificado se desnaturaliza una vez más y sirve como una nueva plantilla, lo que lleva a un aumento exponencial en la cantidad de productos de PCR.

Una vez que se completa la reacción, los productos de PCR se pueden resolver por tamaño en un "gel" generalmente hecho del polímero agarosa, un proceso conocido como electroforesis. Se aplica un campo eléctrico a través del gel, y las cargas negativas en la columna vertebral de las moléculas de ADN hacen que migren hacia el extremo positivo del campo. En términos generales, las moléculas de ADN lineal que son más grandes tardarán más en viajar a través de la matriz de gel.

Ahora que entiendes cómo funciona la PCR, echemos un vistazo a cómo se puede utilizar la reacción para identificar microorganismos en una muestra ambiental.

Para empezar, calcule el volumen de cada reactivo necesario en función del número de muestras que se van a procesar, más un 10 % adicional para tener en cuenta los errores de pipeteo. Se debe incluir una plantilla de control positivo, que contenga la región objetivo, para garantizar que la reacción esté funcionando; así como un testigo negativo donde no se incluya molde de ADN, con el fin de descartar contaminación en alguno de los componentes de la reacción. Mantenga la enzima polimerasa Taq en hielo y descongele el resto de los reactivos y las muestras de ADN a temperatura ambiente en una campana de flujo laminar designada para evitar la contaminación.

Una vez que todos los reactivos se hayan descongelado, constituya la "mezcla maestra" de reactivos agregando el volumen calculado de cada reactivo en un tubo de microfuga de baja unión, lo que minimiza las discrepancias en las cantidades de reactivos debido a la adsorción de moléculas a la superficie del tubo. Agite suavemente y centrifugue cada reactivo antes de agregarlo. Una vez preparada la mezcla maestra, se utiliza el vórtice para mezclar y recoger por centrifugación.

Etiquete una tira de PCR de 8 tubos para designar un tubo para cada muestra, incluidos los controles. Dispense la cantidad adecuada de mezcla maestra de PCR en cada tubo de la tira. A continuación, añada cada muestra de ADN al tubo correspondiente.

Coloque la tapa de la tira de forma segura en el tubo de tira y centrifugue brevemente en una minicentrífuga con un adaptador de tira. Luego, coloque el tubo en el termociclador y ejecute la reacción de acuerdo con el programa de PCR adecuado.

Mientras se realiza la PCR, prepare un gel de agarosa para la electroforesis de los productos de PCR. Pese una cantidad adecuada de polvo de agarosa para obtener un gel con una concentración que pueda resolver los productos de PCR en función de sus tamaños esperados. Agregue la agarosa en un matraz de 125 ml, luego agregue el volumen apropiado de tampón de gel en el matraz, según el volumen del molde de gel, y revuelva para mezclar. Calienta la solución de agarosa en el microondas a alta potencia durante 1 min. Cuando esté completo, verifique que la agarosa se haya disuelto por completo agitando el matraz y repita el microondas en incrementos de 30 segundos si es necesario.

Asegure firmemente la tapa en el matraz y enfríe la solución de agarosa a 50 ? C agitando el matraz con agua fría corriente. Una vez enfriado, agregue 1 ? L de bromuro de etidio a la agarosa. Debido a que el bromuro de etidio es potencialmente cancerígeno, asegúrese de usar equipo de protección personal como gafas, una bata de laboratorio y guantes resistentes al bromuro de etidio.

Vierta la solución de agarosa en una bandeja de fundición en gel de electroforesis, asegurándose de que no queden burbujas de aire atrapadas dentro de la agarosa. Coloque un peine con el número requerido de pocillos en la solución. Deje el gel a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos para que se solidifique. Una vez que el gel esté listo, retire con cuidado el peine, asegurándose de no rasgar el gel en el proceso.

Coloque el gel solidificado en la cámara de electroforesis. Agregue tampón LB en la cámara hasta que el gel esté sumergido. En una pieza de Parafilm, pipetee un "punto" de escalera de ADN de un rango adecuado para el tamaño esperado de los productos de PCR. Recupere los tubos de PCR con las reacciones completadas del termociclador. Recoja los condensados en los tubos de PCR por centrifugación breve y agregue 8 ? L de cada muestra en el Parafilm. Sumar 2 ? L de 10x cargando el tinte en cada punto del producto de PCR, de modo que la concentración final del colorante sea 2x.

Cargue las muestras y la escalera en los pocillos designados en el gel de agarosa, teniendo cuidado de no hurgar a través del gel. Una vez completada la carga, coloque la tapa de la cámara de electroforesis y conecte los electrodos a la fuente de alimentación. Dado que el ADN está cargado negativamente y migra hacia el electrodo positivo, asegúrese de que los pocillos estén en el lado más cercano al electrodo negativo. Encienda la fuente de alimentación y configúrela a un voltaje apropiado para el tamaño de la cámara de electroforesis y el sistema de almacenamiento intermedio que se está utilizando. Configure la electroforesis en "ejecutar". Se observarán pequeñas burbujas que se mueven por los lados de la cámara si la electroforesis se está llevando a cabo correctamente.

Una vez que el frente del tinte haya avanzado lo suficiente en el gel, apague la fuente de alimentación. Transporte con cuidado el gel a un generador de imágenes de gel para visualizar los productos electroforedos. Con un escudo protector, encienda la luz ultravioleta y visualice las bandas de ADN en el gel. Analice la posición de las bandas para ver si coincide con el patrón esperado que indica la presencia de la especie de interés en la muestra ambiental.

Ahora que has visto cómo se realiza la PCR, veamos varias formas en que se aplica para detectar microorganismos de interés en el medio ambiente.

Uno de los usos de la detección microbiana ambiental basada en PCR es la identificación de organismos causantes de enfermedades, como la "ameba comecerebros" Naegleria fowleri, un organismo unicelular que se encuentra en cuerpos de agua dulce y piscinas sin cloro que puede atacar el sistema nervioso humano, a menudo fatalmente. La presencia de este microbio mortal en muestras de agua o en el líquido cefalorraquídeo de pacientes sospechosos se puede probar mediante la realización de PCR con cebadores que se dirigen a secuencias de ADN únicas en el genoma de la ameba.

Otra aplicación para la identificación microbiana basada en PCR es la prueba de la presencia de bacterias patógenas en moscas capturadas en las proximidades de establecimientos de alimentos, como parte de la vigilancia de la salud pública y las investigaciones de brotes de enfermedades.

Aquí, los investigadores buscaron la presencia de bacterias patógenas como Salmonella y Listeria, primero aislando bacterias tanto de la superficie corporal como del canal digestivo de las moscas, y luego utilizando condiciones de cultivo específicas de la especie para enriquecer para estas especies de interés. Después de extraer el ADN de las bacterias cultivadas, se utilizaron kits de PCR de detección específicos de especies disponibles en el mercado para probar su identidad.

Por último, con la PCR se pueden identificar y diferenciar diferentes cepas de bacterias patógenas resistentes a los antibióticos, como el Staphylococcus aureus, que presentan importantes problemas de salud pública.

En este ejemplo, los investigadores aislaron y cultivaron S. aureus a partir de muestras clínicas, luego extrajeron el ADN de las colonias bacterianas y realizaron PCR. Las reacciones de amplificación aquí fueron "multiplexadas", lo que significa que múltiples conjuntos de cebadores dirigidos a diferentes regiones únicas del genoma bacteriano se combinaron en la misma reacción. Los juegos de cebadores individuales se diseñaron de modo que los productos de PCR resultaran del ADN de algunas cepas pero no de otras, de modo que, en combinación, se observaron patrones de bandas de productos únicos para cada cepa.

Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre la detección de microorganismos basada en PCR. Hemos analizado los principios detrás de la reacción en cadena de la polimerasa; un protocolo para realizar PCR en ADN extraído de microorganismos ambientales; y, por último, varias aplicaciones específicas de esta técnica para testear organismos de interés en diferentes tipos de muestras ambientales o clínicas. ¡Gracias por mirar!