2.9: Cuantificación de microorganismos ambientales y virus utilizando qPCR

1. muestras

1. Recoger el suelo con una barrena o pala a una profundidad determinada. Recogida de suelo de la rizosfera, sólo recoger suelo de 7 mm alrededor de la raíz de la planta, por golpear el exceso de suciedad de la raíz y raspar el suelo deseada en un barril de la colección.
2. Coloque una botella de Nalgene estéril en palillo de la inmersión. Sujete el extremo del palo y recoger agua sumergiendo la botella. Coloque la botella en una hielera con hielo.
3. Transferencia de muestras al laboratorio.

2. los ácidos nucleicos extracción

1. Para aislar microorganismos a partir de las muestras recolectadas y extraer DNA o RNA de ellos, por favor ver el video de Zeus Ciencias de la educación en la extracción de ácidos nucleicos de comunidad.

3. transcripción reversa

1. Si el material genético se ensayaron es ARN, debe utilizarse para generar ADN complementario (ADNc) mediante transcripción inversa antes de proceder a la PCR. Para obtener más información, consulte educación JoVE video de RT-PCR.

4. configuración del qPCR

1. Recuperar reactivos almacenados a-20 ° C y descongelarles en hielo o a temperatura ambiente dentro de una campana limpia. Reactivos utilizados en este ejemplo son la mezcla de reacción de qPCR (depende de la máquina de qPCR utilizado; contiene DNA polimerasa), cartillas de avance y retroceso y la sonda TaqMan. Las secuencias de la cartilla y la sonda están diseñadas con secuencias específicas en el organismo que se se enumeran. Se refieren a la literatura actual para encontrar secuencias de interés. En este ejemplo, se utilizará el sistema de reactivos Roche Light Cycler 480 puntas mezcla. Virus de moteado suave del pimiento se enumeran en la muestra de agua. ^1.2 ver tabla 1 para la cartilla y sonda de secuencias.
2. Deshielo extraído (c) el ADN de las muestras y el control positivo ADN (que se compone de secuencias específicas del organismo clonadas en plásmidos bacterianos) a temperatura ambiente.
3. Preparar una plantilla de 96 celdas de tabla que se asemeja a la placa de 96 pocillos qPCR. Etiqueta de cada célula con la que se cargará sobre la placa de reacción. Incluyen reacciones para cada muestra y estándar por triplicado, así como para el control positivo y control negativo, como una reacción no-DNA.
4. Calcular los volúmenes de reactivo necesarios para una reacción "master mix", que incluye todos los reactivos que son constantes entre las reacciones, basadas en las instrucciones del fabricante y de la literatura. Preparar suficiente mezcla maestra para reacciones por triplicado para todas las muestras y controles y un 10% adicional para tener en cuenta errores de pipeteo. Para un maestro muestra mezcla receta, refiérase a la tabla 2.
5. Trabajando dentro de una campana de limpieza, una vez que todos los reactivos son completamente descongelados, agregar la cantidad calculada de cada reactivo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL enlace de bajo para crear mix master. Vórtice y brevemente minicentrifuge cada reactivo antes de agregar. Cambiar la punta de la pipeta entre cada reactivo para evitar contaminación y asegurar concentraciones correctas. Después se han añadido los reactivos, vortex y minicentrifuge el tubo con la mezcla principal para asegurar la homogeneidad.
6. Alícuota del volumen adecuado de mezcla principal en cada uno señalado en la placa PCR de 96 pocillos.
7. Añadir el volumen adecuado de muestra de ADN (c), plásmido de control positivo y control negativo (agua grado molecular) en los pocillos designados.
8. Una vez que se han añadido todas las muestras y los controles, placa del sello con papel de aluminio del lacre. Utilice una herramienta de sellado para empujar el aire hacia fuera de debajo de la hoja y evitar burbujas. Corte los bordes de la hoja con cuidado.
9. Centrifugar la placa de 96 pocillos sellada en una centrifugadora con un sostenedor de la placa para obtener la mezcla en el fondo de cada pozo. Asegúrese de utilizar una placa de contrapeso para que la centrífuga equilibrará adecuadamente mientras gira. Pulse centrifugar a 1000 rpm y luego dejó la centrífuga lentamente deje sin frenos.

5. operación de qPCR

1. Coloque la placa de 96 pocillos sellada en qPCR máquina. Asegúrese de que la máquina indica que está listo para comenzar.
2. Siga las instrucciones de máquina de qPCR para ingresar correctamente toda la información necesaria por el software, luego fije el qPCR máquina para funcionar.
3. Una vez finalizada la máquina funcione, el software será capaz de utilizar las concentraciones conocidas de control positivo para calcular la cantidad de cDNA en cada reacción. Entonces se puede calcular la cantidad de virus en la muestra original basada en la dilución, filtración, concentración, amplificación y procesos de extracción para obtener la muestra de ADN.

Tabla 1. Secuencias de la cartilla y la sonda de muestra para la detección de virus del moteado suave de la pimienta.

Tabla 2. Volúmenes de reactivo para cada reacción y mezcla principal.

El advenimiento de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa, o qPCR, ha permitido determinar cuantitativamente la cantidad de cualquier microorganismo en una muestra ambiental.

Al igual que la PCR estándar, la qPCR identifica los microorganismos mediante la detección de la presencia o ausencia de secuencias de ADN específicas de los organismos de interés. Esto permite la detección de microbios que no se pueden cultivar en el laboratorio, lo que permite analizar una gama mucho más amplia de organismos ambientales. Además, la qPCR permite evaluar cuantitativamente la cantidad de ADN. Pero al mismo tiempo, las metodologías de PCR detectan el ADN de todos los organismos vivos o muertos, lo que limita la capacidad de buscar solo microbios en crecimiento activo en la muestra.

Este video revisará las innovaciones químicas que distinguen la qPCR de la PCR regular, explicará cómo se puede usar la qPCR para medir cuantitativamente el ADN, demostrará un protocolo para usar qPCR para detectar un virus de ARN a partir de muestras de suelo y, finalmente, mostrará cómo la qPCR se está aplicando a la microbiología ambiental en la actualidad.

Los principios básicos detrás de la qPCR son los mismos que los de la PCR regular: ciclos repetidos de recocido del cebador a la plantilla, elongación del producto de PCR y desnaturalización del producto a partir de la plantilla, lo que lleva a la amplificación exponencial de una secuencia objetivo de interés, conocida como amplicón, a partir de un grupo de material de partida.

La innovación de la qPCR está en la adición de productos químicos fluorescentes en la reacción, lo que permite que la síntesis del producto de PCR en cada ciclo se visualice directamente en "tiempo real" mediante termocicladores especializados, lo que permite cuantificar la cantidad de secuencia de plantilla en la muestra original. La cantidad generalmente se mide en términos del ciclo umbral, abreviado Ct, también conocido como ciclo de cuantificación o Cq, que es el ciclo de PCR en el que la cantidad de productos fluorescentes supera el nivel de fondo.

La cuantificación puede ser relativa, donde el valor de Ct de una secuencia se compara con el de otra secuencia estándar o de control; la cantidad relativa es igual a dos elevado a la potencia de la diferencia en Ct. Alternativamente, si una serie de ADN de cantidad conocida se ejecuta junto a las muestras en la reacción, se puede producir una curva estándar que compara el valor de fluorescencia con la cantidad de ADN. y permite cuantificar el ADN de la muestra de forma absoluta.

Hay dos grandes tipos de moléculas fluorescentes que se utilizan en la qPCR. En un caso, se incluyen en la reacción colorantes fluorescentes que se unen específicamente al ADN bicatenario. El tinte solo emite fluorescencia cuando se une al ADN, lo que permite cuantificar la cantidad de producto de ADN bicatenario.

En el otro método, un tramo corto de ADN, conocido como sonda, se diseña contra una secuencia objetivo específica de interés. La sonda se une químicamente a un tinte fluorescente, así como a una molécula "extinguidora" que suprime la señal de fluorescencia del tinte cuando está muy cerca. La enzima polimerasa, que sintetiza el producto de ADN, tiene una actividad de degradación del ADN que haría que la molécula fluorescente se "liberara" de la sonda, separando así el colorante del extinguidor y permitiendo que se detecte la señal de fluorescencia.

Ahora que comprende los principios detrás de la qPCR, veamos un protocolo para usar esta técnica para identificar un virus de ARN que infecta las plantas, el virus del moteado suave del pimiento, a partir de muestras de suelo.

En esta demostración, se recogerán muestras de la rizosfera, la zona del suelo de aproximadamente 7 mm alrededor de las raíces de las plantas que está influenciada por las raíces y sus microorganismos simbióticos.

Para recolectar tierra de rizosfera, primero extraiga con cuidado la planta de interés del suelo y golpéela para eliminar la mayor cantidad posible de tierra a granel. Empaque la planta para su posterior procesamiento en el laboratorio.

Después de llevar las muestras al laboratorio, use una espátula estéril para raspar la tierra deseada en un recipiente de recolección. Luego, recoge el virus del suelo y extrae el ARN.

Una vez que se recolecta el ARN de la muestra, conviértalo en complementario o ADNc mediante transcripción inversa. Consulte el video de JoVE SciEd sobre transcripción inversa-PCR para obtener detalles de este procedimiento.

Cuando esté listo para realizar la qPCR, descongele los reactivos congelados a temperatura ambiente dentro de una campana de flujo laminar dedicada y colóquelos en hielo una vez descongelados. Los componentes reactivos que contienen la enzima ADN polimerasa siempre deben mantenerse en hielo.

Descongele el ADNc de la muestra y un ADN de control positivo, como una pieza circular de ADN conocida como plásmido que tiene el amplicón de interés clonado en ella.

Antes de ensamblar las reacciones en una placa qPCR de 96 pocillos, prepare una plantilla de tabla de 96 celdas en papel y etiquete cada celda con la reacción que se cargará en la placa. Incluya las reacciones para cada muestra y el patrón por triplicado, así como para el control positivo y el control negativo, como una reacción sin ADN.

Calcule los volúmenes de reactivos necesarios para una "mezcla maestra" de reacción, que incluye todos los reactivos que son constantes entre las reacciones. Prepare suficiente mezcla maestra para reacciones por triplicado para todas las muestras más los controles, y un 10% adicional para tener en cuenta el error de pipeteo.

Una vez descongelados los reactivos, ensamble la mezcla maestra en un tubo de microfuga de baja adsorción de 1,5 mL. Para hacer esto, haga un vórtice breve de cada reactivo para mezclarlo completamente, recoja cualquier líquido en el costado de los tubos con una minicentrífuga y pipetee el reactivo en el tubo de microfuga. Asegúrese de utilizar puntas de pipeta nuevas para cada componente de reacción. Después de que se hayan agregado todos los reactivos, vórtice para mezclar y centrifugar. A continuación, alícuota la cantidad adecuada de mezcla maestra en los pocillos designados en la placa de PCR.

A continuación, vórtice y centrifuga cada tubo con ADN de muestra y control, y pipetee la cantidad adecuada en los pocillos respectivos de la placa de PCR. Una vez que se hayan agregado las muestras, selle la placa con una lámina de sellado y use la herramienta de sellado para aplanar completamente el sello y expulsar las burbujas de aire. Arranca con cuidado las lengüetas no adhesivas de los extremos del sello.

Para recoger completamente la mezcla de reacción en el fondo de los pocillos, coloque la placa de reacción en una centrífuga con un soporte de placa y equilibre adecuadamente el rotor con una placa de contrapeso. Centrífuga por pulsos de la placa hasta 1.000 rpm, luego deje que la centrífuga se detenga lentamente sin frenos.

Coloque la placa de reacción en la máquina de qPCR. Configure el programa de PCR de acuerdo con las especificaciones del fabricante, configurando la temperatura de fusión de acuerdo con el par de cebadores que se esté utilizando. Configure el programa de reacción para que se ejecute.

Una vez completado el programa de qPCR, el software podrá utilizar las concentraciones conocidas del control positivo para calcular la cantidad de ADNc en cada reacción. A continuación, se puede calcular la cantidad de virus en la muestra original.

Una vez completado el programa de qPCR, el software podrá utilizar las concentraciones conocidas del control positivo para calcular la cantidad de ADNc en cada reacción.

Con los resultados de la qPCR, el volumen transferido a los pocillos, la extracción del suelo y el factor de la transcripción inversa, se puede calcular el número de virus en la muestra inicial de suelo.

Ahora que ya sabes cómo se realiza la qPCR, veamos cómo se puede utilizar para analizar diferentes muestras ambientales.

La qPCR se puede utilizar para cuantificar la cantidad de virus recuperados de muchos tipos diferentes de muestras. En esta aplicación, se concentraron dos tipos diferentes de adenovirus a partir de muestras de agua mediante varios métodos diferentes. A continuación, se extrajo el ADN de los virus y se sometió a qPCR, para evaluar la eficacia relativa de los métodos de concentración.

Otra aplicación de la enumeración microbiana basada en qPCR es cuantificar el contenido bacteriano en muestras de alimentos y agricultura, en este ejemplo, muestras fecales y de hojarasca de granjas avícolas. En lugar de dirigirse a especies individuales, los científicos realizaron qPCR utilizando cebadores contra un gen altamente conservado que se encuentra en todas las bacterias y cuantificaron la comunidad bacteriana total encontrada en las muestras.

Finalmente, como se mencionó anteriormente, una desventaja de la metodología tradicional de qPCR es que no se pueden distinguir microbios vivos de muertos. Sin embargo, al agregar una sustancia química conocida como monoazida de propidio, o PMA, que solo puede ingresar a las células muertas donde se une al ADN para inhibir reacciones enzimáticas posteriores como la PCR, los investigadores pudieron distinguir entre cultivos vivos y muertos de E. coli O157:H7, una cepa patógena común que se encuentra en alimentos y agua contaminados.

Acabas de ver la introducción de JoVE a la cuantificación de microorganismos y virus ambientales mediante qPCR. Ahora debería comprender cómo funciona la qPCR, cómo usar la qPCR para medir la cantidad de un microbio en una muestra ambiental y algunas aplicaciones de esta técnica. ¡Gracias por mirar!