Cuantificación de microorganismos ambientales y virus utilizando qPCR

El advenimiento de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa o qPCR, ha hecho posible determinar cuantitativamente la cantidad de cualquier microorganismo en una muestra ambiental.

Como estándar de PCR, qPCR identifica microorganismos mediante la detección de la presencia o ausencia de secuencias de ADN específicas a los organismos de interés. Esto permite la detección de microbios que no pueden cultivarse en el laboratorio, lo que es posible analizar una gama mucho más amplia de organismos ambientales. Además, qPCR permite la cantidad de ADN a ser evaluados cuantitativamente. Pero al mismo tiempo, metodologías PCR detectan ADN de todos los organismos vivo o muertos, limitando la capacidad de buscar sólo crecimiento microbios en la muestra.

Este video será revisar las innovaciones químicas que distinguen la qPCR de PCR regular, explicar cómo qPCR puede utilizarse para medir cuantitativamente el ADN, demostrar un protocolo para el uso de qPCR para detectar un virus de ARN de muestras de suelo y por último, mostramos cómo qPCR se aplica a la Microbiología Ambiental hoy.

Los principios básicos detrás de qPCR son los mismos que PCR regular – repetido ciclos de primer recocido a la plantilla, alargamiento del producto de PCR y la desnaturalización del producto de plantilla, conduciendo a la amplificación exponencial de una secuencia de destino de interés, conocido como el amplicon, de una piscina de material de partida.

La innovación de qPCR es en la adición de productos químicos fluorescentes en la reacción, que permite la síntesis del producto de PCR en cada ciclo para ser visualizados directamente en “tiempo real” por termocicladores especializados, lo que permite cuantificar la cantidad de secuencia de la plantilla en la muestra original. La cantidad se mide generalmente en términos del ciclo umbral, abreviado C_t, también conocido como ciclo de cuantificación o C_q, que es el ciclo de la polimerización en cadena en el que la cantidad de productos fluorescentes supera el nivel de fondo.

Cuantificación puede ser relativa, cuando el valor de_t de C de una secuencia es comparada con la de otra secuencia estándar o control; la cantidad relativa es igual a dos elevado a la potencia de la diferencia de C_t. Alternativamente, si se ejecuta una serie de ADN de cantidad conocida junto con las muestras en la reacción, una curva estándar de comparar valor de fluorescencia a la cantidad de ADN se puede producir y permite que el ADN de la muestra a cuantificarse absolutamente.

Hay dos tipos generales de moléculas fluorescentes utilizados en qPCR. En un caso, tintes fluorescentes que se unen específicamente a ADN de doble hebra se incluye en la reacción. El tinte aparece sólo cuando ligada a ADN, por lo que la cantidad de producto de ADN de doble hebra a cuantificarse.

En el otro método, un corto tramo de ADN, conocidas como punta de prueba, está diseñado contra una secuencia Diana de interés. La sonda se une químicamente a un colorante fluorescente, así como una molécula “quencher” que suprime la señal de fluorescencia del tinte cuando en proximidad cercana. La enzima polimerasa, que sintetiza el producto ADN, tiene una actividad degradante de ADN que la molécula fluorescente a “liberarse” de la sonda, así separando el tinte del extintor y permitiendo que la señal de fluorescencia para detectar.

Ahora que usted entiende los principios detrás de qPCR, echemos un vistazo a un protocolo para el uso de esta técnica a la identificación de un virus ARN que infecta plantas, el virus del moteado suave de pimienta, de muestras de suelo.

En esta demostración, se recogerán muestras de la rizosfera, la zona de suelo aproximadamente de 7 mm alrededor de las raíces de la planta que está influenciado por las raíces y sus microorganismos simbióticos.

A recoger suelo de rizosfera, primero cuidadosamente extraer la planta de interés desde el suelo y golpear para eliminar todo el exceso a granel del suelo como sea posible. Paquete de la planta para su posterior procesamiento en el laboratorio.

Después de traer las muestras hacia el laboratorio, utilizar una espátula estéril para el desguace el suelo deseado en un vaso de colección. Luego, recoger el virus desde el suelo y extraer el RNA.

Una vez que la RNA es recogida de la muestra, se convierte en complementario o ADNc mediante transcripción inversa. Por favor, consulte el SciEd de JoVE video de transcripción reversa-PCR para los detalles de este procedimiento.

Cuando esté listo para llevar a cabo la qPCR, descongelar los congelados reactivos a temperatura ambiente dentro de una campana de flujo laminar dedicado y coloque en hielo descongelado. Componentes reactivos que contienen la enzima ADN polimerasa siempre debe mantenerse en hielo.

Descongele el cDNA de la muestra y el control positivo ADN, como un pedazo circular de ADN conocidas como un plásmido que tiene el amplicon de interés clonados en él.

Antes de ensamblar las reacciones en una placa de 96 pocillos qPCR, preparar una plantilla de 96 celdas de tabla en el papel y cada célula con la reacción que se cargarán en la placa de la etiqueta. Incluyen reacciones para cada muestra y estándar por triplicado, así como para el control positivo y control negativo, como una reacción no-DNA.

Calcular los volúmenes de reactivo necesarios para una reacción “master mix”, que incluye todos los reactivos que son constantes entre las reacciones. Preparar suficiente mezcla maestra para reacciones por triplicado para todas las muestras y controles y un 10% adicional para tener en cuenta errores de pipeteo.

Una vez que los reactivos son descongelados, montar la mezcla principal en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL baja adsorción. Para ello, brevemente vortex cada reactivo a mezclar bien, recoger cualquier líquido en el lado de los tubos utilizando una mini centrífuga y pipetear el reactivo en el tubo de microcentrífuga. Asegúrese de usar puntas de pipeta nueva para cada componente de la reacción. Después de todos los reactivos se han añadido, vortex para mezclar y centrifugar. Entonces, alícuota la cantidad apropiada de mezcla principal en los pocillos designados en la placa de la polimerización en cadena.

A continuación, vortex y centrifugar cada tubo con la muestra y el control de ADN y pipetear la cantidad apropiada en los pocillos respectivos en la placa de la polimerización en cadena. Una vez que las muestras se han agregado, sellar la placa con una papel selladora y utilizar la herramienta selladora aplanar el sello y expulsar cualquier burbuja de aire. Rasgue con cuidado las lengüetas no adhesiva de los extremos del sello.

Para recoger completamente la mezcla de reacción en la parte inferior de los pozos, coloque la placa de reacción en una centrifugadora con un sostenedor de la placa y equilibrar adecuadamente el rotor con una placa de contrapeso. Centrifugadora de pulso la placa hasta 1.000 rpm, entonces permita que la centrifugadora lentamente a una parada sin frenos.

Coloque la placa de reacción en la máquina de la qPCR. Establecer el programa PCR según la especificación del fabricante, ajuste la temperatura de fusión según el par de la cartilla se utiliza. Establecer el programa de reacción para ejecutarse.

Una vez terminado el programa de qPCR, el software será capaz de utilizar las concentraciones conocidas de control positivo para calcular la cantidad de cDNA en cada reacción. Entonces se puede calcular la cantidad de virus en la muestra original.

Una vez terminado el programa de qPCR, el software será capaz de utilizar las concentraciones conocidas de control positivo para calcular la cantidad de cDNA en cada reacción.

Con los resultados de la qPCR, el volumen transferido en los pozos, la extracción de suelo y el factor de la transcripción reversa, se puede calcular el número de virus en la muestra de suelo inicial.

Ahora que sabes cómo se realiza la qPCR, veamos cómo puede utilizarse para analizar diferentes muestras ambientales.

qPCR puede utilizarse para cuantificar la cantidad de virus de muchos tipos de muestras. En esta aplicación, dos tipos diferentes de adenovirus se concentra a partir de muestras de agua por una serie de métodos diferentes. ADN fue extraído de los virus y sometido a la qPCR, para evaluar la eficiencia relativa de los métodos de concentración.

Otra aplicación para el recuento microbiano basado en qPCR es cuantificar el contenido bacteriano en muestras alimentarias y agrícolas – en este ejemplo, fecal y las muestras de granjas de pollo de la camada. En lugar de dirigidas a especies individuales, los científicos realizaron qPCR utilizando cebadores contra un gen altamente conservado que se encuentra en todas las bacterias y cuantificaron la total comunidad bacteriana encontrada en las muestras.

Finalmente, como se mencionó anteriormente, una de las desventajas de la metodología tradicional de la qPCR es que microbios vivos y muertos no pueden ser distinguidos. Sin embargo, mediante la adición de un químico conocido como monoazide de propidio, o PMA, que sólo puede entrar células muertas donde se une al ADN para inhibir reacciones enzimáticas posteriores como PCR, los investigadores aquí fueron capaces de distinguir entre las culturas vivas y muertas de e. coli O157: H7, una cepa patogénica común en agua y alimentos contaminados.

Sólo ha visto la introducción de Zeus para cuantificar microorganismos ambientales y los virus mediante qPCR. Ahora debe entender cómo funciona la qPCR, cómo utilizar qPCR para medir la cantidad de un microbio en una muestra ambiental y algunas aplicaciones de esta técnica. ¡Gracias por ver!