Name: Una lectina Método HPLC para enriquecer péptidos selectivamente glicosilada de muestras biológicas complejas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-01T21:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 23 s
Description: Aprende a enriquecer glicopéptidos de plasma humano mediante cromatografía de afinidad con lectinas y HPLC. Este método optimiza el aislamiento selectivo para aplicaciones en descubrimiento de biomarcadores.

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Este trabajo fue apoyado por las Tecnologías de la Clínica Proteómica para el cáncer de la iniciativa, 5U24CA126477-04.

1) Prepare lectina conjugada columnas POROS <ol><li> Se puso una máscara para protegerse contra la inhalación de los poros-AL cuentas durante los pasos de 1,1 a 1,2. Pesar la cantidad deseada de granos POROS (100 mg beads/300 volumen final l) y la transferencia en un tubo eppendorf limpio. </li><li> Lávese las cuentas con la adición de 1 mL de buffer fosfato salino (PBS). Pellet cuentas por centrifugación en una microcentrífuga a máxima velocidad durante 3 minutos. Aspirar el sobrenadante y repetir el lavado. </li><li> Pesar la cantidad necesaria de lectina conjugada (1 - 4 mg / l 200 cuentas) y transferir a un tubo eppendorf limpio. Añadir PBS para formar un 5 a 20 mg / ml de solución. Reserva 25 l de esta solución. </li><li> Transferir la solución de lectina restantes a las cuentas poros. Añadir cianoborohidruro de sodio para una concentración final de 50 mM. Coloque el tubo en una mecedora y reaccionar durante la noche a temperatura ambiente. (Nota:. Cianoborohidruro de sodio es tóxico y debe ser manejado en una campana de extracción de residuos contaminados deben eliminarse de manera apropiada.) </li><li> Se precipitan los poros cuentas como en el paso 1.2. Aspirar el sobrenadante y guardar como la solución después de la conjugación. </li><li> Lávese las cuentas con un Buffer enfriamiento ml (1 M Tris-Cl, pH 7,4). Cuentas de pellets como en el paso 1.2 y de manera segura eliminar el sobrenadante. </li><li> Bloquear los sitios restantes reactiva en las cuentas de poros con un búfer de enfriamiento ml. Añadir cianoborohidruro de sodio para una concentración final de 50 mM. Coloque el tubo en una mecedora y se incuban a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Pellet cuentas como en el paso 1.2 y desechar el sobrenadante. </li><li> Lávese las cuentas con 1 ml de NaCl 1 M. Pellet cuentas y eliminar el sobrenadante. Repetir cuatro veces para un total de cinco lavados. Las cuentas ya están listos para empacar. </li><li> Para determinar la cantidad de proteína que se conjugó con las cuentas de Poros, realizar un ensayo de la concentración de proteínas en las soluciones de la lectina de pre-y post-conjugado conjugados. La diferencia en las concentraciones es la cantidad de proteína que se conjugó con las cuentas. La cantidad de proteína conjugada por volumen de cuentas es igual a la concentración de lectina en los granos. Las concentraciones objetivo lectina son entre 2 -20 mg / ml. </li></ol> 2) Embalaje de la cuentas de lectina conjugada con poros en una columna de PEEK <ol><li> Montar el sistema de empaque (descripción a continuación) y el apoyo en un soporte de anillo de metal. El sistema de embalaje se compone de, de abajo hacia arriba, limitador de presión, columna extremo del acoplador 1, frita, la columna (2 x 50 mm), acoplamiento final la columna 2, conector de columna, columna extremo del acoplador 3, columna (4,5 x 50 mm), columna extremo del acoplador 4 y montaje final. La columna superior sirve como depósito para el material de embalaje. </li><li> Volver a suspender las cuentas de poros en el volumen deseado de un Buffer. (10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM de cloruro de sodio, cloruro de calcio 10 mM, 10 mM de cloruro de magnesio) Si una columna de embalaje (~ 200 l de volumen de lecho), resuspender en 400 A. Buffer l </li><li> Transferencia conjugado cuentas POROS en la columna superior (el depósito). Añadir un Buffer para el depósito hasta que el buffer llega a la parte superior de la columna. Coloque con cuidado el conector de extremo en la parte superior de la columna, tratando de evitar burbujas de aire en la columna. Conecte el montaje final de la columna superior a la del sistema HPLC. </li><li> Paquete de la columna por la que fluye el tampón A través del sistema. Comience con un caudal de 0,5 mL / min. Aumentar la tasa de flujo de 0,5 mL / min cada minuto hasta que 4 ml / min o la presión máxima (3000 psi) se ha alcanzado. Continuar en la tasa de flujo máximo posible hasta por lo menos 35 ml de tampón A han pasado por la columna. </li><li> Apague la bomba y deje que la presión en la columna para bajar a &lt;20 psi. </li><li> Suavemente, desmontar el sistema de empaque, a partir de la parte superior. Al final de la columna 2 del acoplador se alcanza, quite cuidadosamente. Parte del material de envasado deberá extrusión de la parte superior de la columna. Con una navaja o filo similar, limpie suavemente lejos de la extrusión de cuentas, dejando una superficie de cuentas que es con la parte superior de la columna. No presione a las perlas mientras hace esto. </li><li> Desenganche la columna de relleno de la parada de anillo. Coloque una frita de nuevo en un acoplador de nuevo final y gire a la columna de relleno más que conectarse con el acoplador de frita / final en el extremo de la columna abierta (anteriormente parte superior). </li><li> Etiqueta de la columna apropiada. Ahora está listo para su uso. Cuando no esté en uso, la columna puede ser almacenada en PBS con azida de sodio 0,02% a 4 ° C durante un máximo de 6 meses. </li></ol> 3) Programa de la HPLC método <ol><li> Los detalles de la programación de la HPLC pueden variar de acuerdo a las especificaciones de software del fabricante. Utilizamos un paradigma Michrom MG4 HPLC. En este equipo, los métodos de crear y acceder en la sección &quot;Configuración&quot; en la parte superior de la pantalla. Programa de la siguiente forma: <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Tiempo </td><td> Caudal (l / min) </td><td> % A </td><td> % B </td></tr><tr><td> 0:00 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 09:00 </td><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 09:01 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13:50 </td><td> 500 </td><td> 0 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 13:51 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 19:50 </td><td> 3000 </td><td> 100 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> Tampón A: 10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM de cloruro de sodio, cloruro de calcio 10 mM, 10 mM de cloruro de magnesio Tampón B: 0,5 M de ácido acético El detector de UV debe ser programado para leer a 280 nm a partir de las 0:00 a las 19:50. El eje debe ser ajustado para detectar bajos niveles de absorción, por ejemplo, 0 - 50. UA. </li><li> Si es un muestreador automático de programas disponibles, el siguiente calendario para la recogida de fracción. De lo contrario, recoger las fracciones con la mano como lo indica la hora de realizar la cromatografía. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Fracción </td><td> Demora a la recogida de inyección de la muestra </td><td> Duración de la colección (min) </td></tr><tr><td> Flujo a través de </td><td> 2.8 </td><td> 4.1 </td></tr><tr><td> Obligado </td><td> 9 </td><td> 2.6 </td></tr></tbody></table></li></ol> 4) Preparación de muestras para HPLC <ol><li> Antes de su uso en este protocolo, el plasma humano deberá ser agotado de las 14 proteínas más abundante con una columna de MARS (Agilent, Santa Clara, CA). Agotado plasma, la lactoferrina humana y la invertasa de levadura debe ser individual tripsina digerido y como se describió previamente desalado 1. </li><li> Para preparar la lectina específica de la lactoferrina estándar, realice una cromatografía en 50 ug tripsina digerido lactoferrina sobre cualquiera de la AAL, o la columna SNA utilizando el método en la parte 3. La fracción unida se contienen lectina específica de glicopéptidos lactoferrina. Neutralizar las muestras como en la parte 4.4, y desalar como en la Parte 6. Resuspender la muestra en un ml de tampón A. La muestra resultante está listo para su uso. </li><li> Tres réplicas experimentales se llevarán a cabo. Para preparar la muestra para tres repeticiones, añadir 3 pmol de tripsina digerido invertasa y 1 l de lectina específica de la lactoferrina (ya sea AAL-LAC o SNA-LAC) y 30 l MARS-agotado, tripsina digerido equivalentes de plasma, (PE). PE se define como el volumen de plasma non-processed/intact/original del que se deriva una cantidad dada de procesado de plasma (MARS-agotado y tripsina digerido). Añadir un Buffer de la muestra para llegar a un volumen final de 330 microlitros. </li><li> Añadir tampón de neutralización (1 M Tris pH 8,0), a los viales de muestra que recogerá eluido. El número y el volumen de los viales que trabajan con dependerá de las limitaciones de su cargador de muestras. Para el paradigma MG4, un vial recoge el flujo continuo y dos recoger el eluido. Se requieren aproximadamente 1,5 ml de tampón Tris para neutralizar 1 ml de eluido. PH neutralizado objetivo es 7.0-8.0; prueba del pH prueba final con papel indicador de pH. </li></ol> 5) Realizar la cromatografía <ol><li> Todas las carreras en blanco y la muestra que siguen se utilizará el método descrito en la Parte 1. La columna y tampones están a temperatura ambiente durante su uso. Las columnas se almacenan a 4 ° C, mientras que los amortiguadores son almacenados a temperatura ambiente. </li><li> Sujetar el AAL o la columna de lectina SNA en el sistema HPLC y ejecutar dos métodos en blanco (inyección de búfer sólo una). Asegúrese de que la columna de lectina corresponde a la lactoferrina lectina específica (Parte 2). </li><li> Cromatógrafo de las tres muestras de plasma, la inyección de un espacio en blanco entre cada muestra inyectada, para un total de 7 carreras por HPLC. Las fracciones de carreras en blanco no será preciso recoger. </li></ol> 6) Desalar fracciones recogidas Para cada fracción de utilizar una de 1 ml Agua Oasis HLB SPE cartucho de la siguiente manera: <ol><li> Coloque el número de cartuchos para colector de vacío. </li><li> Húmedo cada cartucho con un ACN mL 80% en 1% de ácido fórmico (medidor de vacío en el colector debe leer 5-20 LNHG). </li><li> Equilibrar los cartuchos con 1,5 ml de ácido fórmico al 0,1% (medidor de vacío en el colector debe leer 5-20 LNHG) </li><li> Volumen de carga total de una muestra en un cartucho (medidor de vacío en el colector debe leer 2 - 2.5. LNHG, y el caudal no debe exceder de 1 ml / min) </li><li> Lavado de los cartuchos con 3 x 1 ml de ácido fórmico al 0,1% (medidor de vacío en el colector debe leer 5-20 LNHG) </li><li> Péptidos eluir / glucopéptidos en tubos eppendorf marcados con una x 1% de acetonitrilo 80 ml en el 0,1% de ácido fórmico. (Medidor de vacío en el colector debe leer 2-2,5 LNHG, y el caudal no debe exceder de 1 mL / min.) Un tubo de recolección solo se debe utilizar para cada cartucho. </li><li> Neutralizar eluido mediante la adición de 60 l de bicarbonato de amonio 0,5 M a cada tubo de recolección. Objetivo neutrpH industrializados se está 7,0-8,0; pH prueba final con papel indicador de pH. </li><li> Concentrado péptidos eluidos / glicopéptidos a ~ 50 l por su ejecución en una centrífuga de vacío (por ejemplo, un Thermo Savant SpeedVac) de ~ 2 horas a 35 ° C. </li></ol> 7) PNGase F-digestión <ol><li> Prueba del pH de la muestra para asegurarse de que es entre 7,0 a 8,0. Si es necesario, añada bicarbonato amónico 50 mM para aumentar el pH. Si el volumen final de la muestra es&gt; 100 l de la muestra, speedvac hasta que esté entre 50 a 100 microlitros. </li><li> Añadir 0,5 l (250 U) de glicerol libre F PNGase a cada tubo de muestra y se incuba a 37 ° C durante la noche. </li></ol> 8) Ejemplos de Código Postal Consejo <ol><li> A partir de PNGase F-digerido muestras, ZipTip cada uno de ellos de la siguiente manera. </li><li> ZipTip húmedo con 10 l de acetonitrilo 100%, seguido de 10 l de acetonitrilo 80%, 0,1% de ácido fórmico. </li><li> Equilibre ZipTip con 20 l de ácido fórmico al 0,1%. </li><li> Cargar la muestra en la ZipTip pipeteando arriba y abajo a través de la matriz ZipTip 10 veces. </li><li> Lave la ZipTip pipeteando 10 l de ácido fórmico al 0,1%, cinco veces. </li><li> Eluir la muestra en un tubo eppendorf limpio con 10 l de acetonitrilo 80%, 0,1% de ácido fórmico. </li><li> Repetir la elución y añadir el segundo 10 l en el mismo tubo. </li><li> Speedvac las muestras a un volumen de &lt;2 l. </li><li> Resuspender en 20 muestras de ácido fórmico l 0,1%. Las muestras ya están listos para ser analizados por LC-MS/MS. </li></ol> 9) Los resultados representativos: La conjugación POROS produce normalmente en concentraciones de lectina de cuentas en el rango de 2 a 20 mg / ml. Esto es óptimo para la cromatografía de afinidad. Cromatografía de lectina de la tripsina digerido plasma MARS-agotado humanos normalmente enriquece glucopéptidos en la fracción unida. Como los glicopéptidos están PNGase F-tratada antes de LC-MS/MS, son identificadas como péptidos con la secuencia consenso de N-ligado, NXS / T (donde X es cualquier residuo, pero prolina), en el que se ha convertido en la asparagina un ácido aspártico por la acción de F. PNGase péptidos con estas características se considera que los péptidos deglicosilada (o &quot;deglycopeptides&quot;). En promedio, el flujo a través de (FT) de la fracción de AAL o cromatografía SNA contiene deglycopeptides 4.2%, mientras que el 30-50% de los péptidos se recuperó en la fracción unida se deglycopeptides. Por lo general, utilizando un Elite QStar, 1000-1300 péptidos se identificaron en la fracción de FT, y 200-400 péptidos se identificarán en la fracción unida. Dos o más deglycopeptides invertasa distintos deben ser observados en la fracción de FT y dos o más distintos deglycopeptides lactoferrina en la fracción unida (Tabla 1). <img src="/files/ftp_upload/1398/1398table.jpg" alt="Tabla 1" /> Tabla 1.

<ol><li>Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((multiplexed+assays+for+low+abundance+proteins+in+plasma+by+targeted+mass+spectrometry+and+stable+isotope+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 2212-2229 (2007).</li>
</ol>

Este protocolo proporciona un método rápido para el aislamiento y la identificación de los glucopéptidos en forma de glicanos específicos. Como la glicosilación varía ampliamente dentro de un organismo, en particular durante el desarrollo y patogénesis, esta técnica puede aplicarse para hacer frente a una amplia variedad de preguntas. En particular, estamos usando el método para enriquecer selectivamente glicopéptidos que han sido modificados con cáncer asociado a epítopos como un primer paso hacia el descubrimiento de biomarcadores.

<table><tbody><tr><td>Plasma humano</td><td></td><td></td><td>Se prepara en el laboratorio</td></tr><tr><td>Lactoferrina humana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0520</td><td>Digerir con tripsina antes de usar</td></tr><tr><td>Invertasa de levadura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0408</td><td>Digerir con tripsina antes de usar</td></tr><tr><td>Cartuchos SPE Oass HLB</td><td>Waters</td><td>WAT094225</td><td>Volumen de 1 cc</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta ZipTip</td><td>Fisher Scientific</td><td>ZTC1 8M0 96</td><td>Millipore, C18 para pipeta de 10 ml</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td>99%</td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6141</td><td>99%</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>96%</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>98%</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242853</td><td>99,7%</td></tr><tr><td>Papel indicador de pH</td><td>Fisher Scientific</td><td>M95903</td><td>Rango 0-14</td></tr><tr><td>Aetonitrilo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998</td><td>99,9%</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>28905</td><td>99%</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Invitrogen</td><td>14190-136</td><td>Sin calcio ni magnesio</td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71289</td><td>99,5%</td></tr><tr><td>PNGasa F</td><td>New England Biolabs</td><td>P0705L</td><td>Sin glicerol</td></tr><tr><td>Matraces para filtración al vacío</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGVU05RE</td><td>Poros de 0,2 mm</td></tr><tr><td>Perlas POROS-AL</td><td>Applied Biosystems</td><td>1-6028-02</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aleuria aurantia&lt;/em&gt; lectina</td><td>Vector Laboratories</td><td>L-1390</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sambucus nigra&lt;/em&gt; aglutinina</td><td>Vector Laboratories</td><td>L-1300</td><td></td></tr><tr><td>Cianoborohidruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296945</td><td>Solución 5,0 M</td></tr></tbody></table>

una lectina método hplc para enriquecer péptidos selectivamente glicosilada de muestras biológicas complejas

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Los glicanos son una clase importante de modificaciones post-traduccionales. Por lo general se encuentran en las moléculas secretadas y extracelular, las estructuras de glicanos de la señal del estatuto interno de la célula. Glicanos en las células tumorales tienden a tener el ácido siálico y abundantes restos de fucosa. Proponemos que estas variantes asociadas con el cáncer de glicanos ser explotado para el desarrollo de biomarcadores destinados a diagnosticar enfermedad en estadio inicial. En consecuencia, hemos desarrollado una espectrometría de masas basado en flujo de trabajo que incorpora la cromatografía de afinidad sobre matrices formado a partir de las lectinas, proteínas que se unen las estructuras específicas de glicanos. Las lectinas Sambucus nigra (SNA) y aurantia Aleuria (AAL), que se unen el ácido siálico y fucosa, respectivamente, se acoplaron de forma covalente a cuentas POROS (Applied Biosystems) y se introduce en columnas PEEK para cromatografía líquida de alta presión (HPLC). En pocas palabras, el plasma se agotó de los catorce proteínas más abundantes con un sistema de eliminación de afinidad múltiples (MARS-14; Agilent). Agotado el plasma fue digerido con tripsina y se separaron en el filtrado y fracciones obligado por SNA o HPLC AAL. Las fracciones fueron tratados con PNGaseF para eliminar la N-glicanos ligados, y se analizaron por LC-MS/MS en Elite QStar. Los datos fueron analizados utilizando el software mascota. El diseño experimental incluye controles positivos-fucosilados y sialylated humanos glicopéptidos y lactoferrina negativos los controles de altura glicopéptidos manosa de Saccharomyces cerevisiae, que se utiliza para controlar la especificidad de la captura de lectina. Las principales características de este flujo de trabajo incluyen la reproducibilidad derivado del formato de HPLC, la identificación positiva de los glicopéptidos capturado y PNGaseF tratos de sus motivos Asn-Xxx-Ser/Thr desamidado y evaluación de la calidad con las normas glicoproteína. Optimización del protocolo también incluye la determinación de la proporción adecuada de material de partida a la capacidad de la columna, la identificación de la captura más eficiente y tampones de elución, y el control de la PNGaseF-tratamiento para asegurarse de deglicosilación completo. Direcciones futuras incluyen el uso de este flujo de trabajo para llevar a cabo la espectrometría de masas basado en experimentos de detección en plasma de pacientes con cáncer de mama y el control de los individuos.

Lectina conjugada con perlas de Poros fueron empleados para HPLC. Normas glicopéptido sirvieron como controles positivos y negativos. MARS-14 empobrecido, tripsina digerido plasma humano y se sometió a cromatografía de flujo continuo (FT) y las fracciones recogidas obligado para el análisis de ESI-LC-MS/MS. Glicopéptidos fueron enriquecidos en la fracción unida en comparación con el FT.

Una lectina Método HPLC para enriquecer péptidos selectivamente glicosilada de muestras biológicas complejas

Los glicanos son una clase importante de modificaciones postraduccionales. Presentes habitualmente en moléculas secretadas y extracelulares, las estructuras de los glicanos señalizan el...

Este procedimiento aísla glucopéptidos específicamente glicosilados del plasma humano. El plasma se digiere con tripsina para obtener una mezcla de péptidos y glucopéptidos, junto con estándares de glucopéptidos. Se agregan controles positivos y negativos para la cromatografía de lectinas al plasma.La muestra se somete a cromatografía de afinidad por lectinas basada en cromatografía líquida de alta presión. Las lectinas utilizadas se unen respectivamente a difucona y ácido siálico; los péptidos y glicopéptidos irrelevantes eluyen de la columna en la fracción de flujo directo. Se utiliza ácido acético para eluir la fracción retenida de la columna.Esto está enriquecido con glicopéptidos modificados específicamente. Hola, soy Penny Drake del laboratorio de Susan Fisher en el Departamento de Obstetricia, Ginecología y Ciencias de la Reproducción y en la instalación central de espectrometría de masas San Lamore en la Universidad de California en San Francisco. Y yo soy Eric Johansen, también de la instalación central de espectrometría de masas Sandler Moore y del Laboratorio Fisher.Hoy les mostraremos un procedimiento para realizar cromatografía de lectinas con el fin de enriquecer glicopéptidos a partir de plasma humano y otras mezclas complejas. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio como una herramienta general que tiene numerosas aplicaciones. Por ejemplo, desempeña un papel importante en nuestro flujo de trabajo para el descubrimiento de biomarcadores del cáncer de mama.Así que comencemos. Para iniciar este procedimiento, use una mascarilla para protegerse contra la inhalación de las perlas. Luego pese 100 miligramos de perlas porro y transfiera a un tubo einor limpio.Se necesitan aproximadamente 300 microlitros de perlas para empaquetar una columna. Además, pese la lectina no conjugada y transfiérala a un tubo einor limpio. Se utilizan las lectinas SNA y AAL.Proceda a añadir PBS a la lectina para formar una solución de cinco a veinte miligramos por mililitro. Reserve 25 microlitros de esta solución previamente conjugada. A continuación, lave los porro speeds añadiendo un mililitro de PBS y centrifugando en una microcentrífuga a velocidad máxima.Durante tres minutos, retire el sobrenadante y repita el lavado. Ahora trabaje en la campana extractora y transfiera la solución de lectina restante a las perlas de porro lavadas. Añada sano borohidruro de sodio hasta una concentración final de 50 milimolar.Tenga en cuenta que el borohidruro de sodio es tóxico y los desechos deben eliminarse adecuadamente. Selle el tubo cerrado con perfil y colóquelo en un agitador para que reaccione durante la noche a temperatura ambiente. Después de la incubación nocturna de la lectina con las porro speeds, centrifugue las porro speeds. De nuevo, retire el sobrenadante y guárdelo como la solución post-conjugación para bloquear los sitios reactivos restantes en las perlas.Primero, lave las perlas mediante centrifugación con un mililitro de tampón de bloqueo compuesto por un molar CL a pH 7,4. Luego, agregue un mililitro de tampón de bloqueo e hidruro de sodio sano hasta una concentración final de 50 milimolar. Coloque el tubo en un agitador rotatorio e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos.La extinción ha finalizado. Centrifugue las perlas, como antes.Elimine el sobrenadante y proceda a lavar las perlas cinco veces con un mililitro de cloruro de sodio uno molar cada vez, descartando el sobrenadante. Realice un ensayo de concentración de proteína en las soluciones de lectina antes y después de la conjugación, y utilice la diferencia para determinar la cantidad de proteína que se conjugó a las perlas Porro. Las concentraciones objetivo de lectina están entre dos y 20 miligramos por mililitro, calculadas como la cantidad de proteína conjugada por volumen de perla.Las perlas porro conjugadas ya están listas para empaquetarse en una columna. Para empaquetar las perlas en una columna, arme el sistema de empaquetado compuesto por dos columnas sostenidas sobre un soporte metálico con anillo. La columna superior sirve como depósito para el material de empaquetado.El sistema de empaque consta, de abajo hacia arriba, del restrictor de presión. El acoplador final de columna uno para la columna objetivo, el acoplador final de columna, el conector de dos columnas, el acoplador final de columna tres, la columna de depósito, el acoplador final de columna cuatro y el accesorio final. A continuación, resuspenda los 300 microlitros de porro speeds en 600.Microlitros de tampón A Para empaquetar una columna, transfiera las perlas al depósito superior de la columna. Añada tampón A hasta que alcance la parte superior de la columna. Coloque suavemente el accesorio final en la parte superior de la columna.Trate de evitar burbujas de aire en la columna. Conecte el accesorio final de la columna superior al sistema de HPLC. Empaquete la columna haciendo pasar tampón A o PBS a través del sistema.Comience con un caudal de 0,5 mililitros por minuto. Aumente el caudal en 0,5 mililitros por minuto cada minuto hasta alcanzar ya sea 4 mililitros por minuto o la presión máxima. Continúe al caudal máximo posible hasta que al menos 35 mililitros de tampón hayan pasado a través de la columna.Una vez finalizado, apague las bombas y permita que la presión en la columna disminuya por debajo de 20 PSI. Ahora que la columna está empaquetada, desarme cuidadosamente el sistema de empaquetado comenzando desde la parte superior. Al llegar al acoplador final de la columna dos, retírelo con cuidado.Con una cuchilla de afeitar, limpie suavemente el material empaquetado que sobresale de la parte superior de la columna. No aplique presión sobre las perlas al hacer esto. Desacople la columna empaquetada del soporte con anillo.Coloque un nuevo frit en un nuevo acoplador terminal y gire la columna empaquetada para conectarla con el acoplador terminal FR+ en el extremo abierto de la columna. Ahora la columna está lista para la corrida de HPLC. Cuando no se utilice, la columna puede almacenarse en PBS con azida de sodio al 0,5% a cuatro grados Celsius durante hasta seis meses.Los detalles de la programación de su HPLC variarán según su configuración y las especificaciones del software del fabricante. Aquí utilizamos un HPLC microme paradigm MG four en esta máquina. Los métodos se crean y acceden desde la pestaña de configuración en la parte superior del programa de la pantalla.El método mostrado, que también se describe en detalle en el protocolo escrito adjunto. Si se utiliza un programa de muestreo automático, siga también el protocolo escrito. Use el tampón A como antes y el tampón B para realizar la HPLC y mantenga tanto los tampones como las columnas a temperatura ambiente.Configure el detector UV para leer a dos y 80 nanómetros desde cero hasta 19 minutos y 50 segundos. Ajuste el eje Y para detectar niveles bajos de absorbancia en el rango de cero a 50 unidades de absorbancia. A continuación, prepare las muestras.Las muestras de prueba se derivan de plasma humano al que se le han eliminado las 14 proteínas más abundantes mediante una columna MARS. Las muestras de plasma agotadas y dos estándares, lactoferrina humana e invertasa de levadura, se digirieron individualmente con tripsina y se desalaron como se describió previamente.Para neutralizar las muestras, tenga listo el tampón de neutralización en los viales de muestra que recogerán el EIT para el paradigma MG; un vial recoge el flujo directo y tres recogen el eluato. Se requerirán aproximadamente 1,5 mililitros de tampón para neutralizar un mililitro de EIT. El pH deseado tras la neutralización es de 7,0 a 8,0.Asegúrese de comprobar el pH final con papel indicador de pH. Desaline los muestras como se describe más adelante en este protocolo. Y resuspenda la muestra en un mililitro de tampón A para obtener los mejores resultados.Realice tres réplicas experimentales para que los datos puedan compararse y combinarse. Para preparar muestras para tres réplicas, agregue tres picomoles de tripsina, invertasa digerida y un microlitro de lectina purificada por HPLC específica para lactoferrina a 30 microlitros de equivalentes de plasma digeridos con tripsina agotados de Mars o pe. Esto equivale aproximadamente a 50 microgramos de proteína plasmática utilizada para cada réplica; agregue el tampón A a la muestra para alcanzar un volumen final de 330 microlitros o 110 microlitros por réplica experimental, utilizando primero la columna de lectina A a L o SNA. Ejecute dos métodos en blanco inyectando solo el tampón A. Asegúrese de que la columna de lectina corresponda a la lectina específica para lactoferrina utilizada como estándar y previamente purificada por cromatografía.Los tres muestras de plasma inyectando un blanco entre cada muestra inyectada para un total de siete corridas de HPLC. No es necesario recolectar las fracciones de las corridas en blanco. Nuevamente, asegúrese de neutralizar las muestras colocando tampón de neutralización en los viales que recogen el eluato tras la desalación y la digestión con P-N-G-A-F; así, las muestras estarán listas para el análisis por espectrometría de masas.Utilice un cartucho de una mililitro de aguas oasis, H-L-B-S-P-E por cada una de las fracciones HBLC del estándar de lactoferrina y de las muestras experimentales para desalar. Comience por sujetar el número de cartuchos necesarios a un manifold de vacío. Humedezca cada cartucho con un mililitro de acetonitrilo al 80% en ácido fórmico al 1%.El manómetro de vacío en el colector debe marcar entre cinco y veinte pulgadas. Equilibre los cartuchos con 1,5 mililitros de ácido fórmico al 0,1 % en mercurio. Nuevamente, el manómetro de vacío en el colector debe marcar entre cinco y veinte pulgadas.Mercurio cargue todo el volumen de una muestra en un cartucho. Ahora, el manómetro de vacío en el manifold debería marcar entre dos y 2,5 pulgadas. El mercurio y la velocidad de flujo no deben exceder un mililitro por minuto.Lave los cartuchos tres veces con un mililitro de ácido fórmico al 0,1 % utilizando un tubo colector etiquetado individualmente para cada cartucho. Eluya los glicopéptidos con un mililitro de acetonitrilo al 80 % en ácido fórmico al 0,1 %, y neutralice el EIT añadiendo 60 microlitros de bicarbonato de amonio 0,5 molar a cada tubo colector. El pH neutralizado objetivo debe estar entre 7,0 y 8,0.Asegúrese de probar el pH final con papel indicador de pH. Concentre los péptidos eluidos hasta aproximadamente 50 microlitros utilizando una centrífuga de vacío, como la Thermo Savant Speed Vac, durante aproximadamente dos horas a 35 grados Celsius. Nuevamente, compruebe el pH de la muestra después de la concentración para asegurarse de que esté entre 7,0 y 8,0. Si es necesario, agregue bicarbonato de amonio 50 milimolar para aumentar el pH.Si el volumen final de la muestra es mayor de 100 microlitros, concentre la muestra mediante centrifugación al vacío hasta que esté entre 50 y 100 microlitros. Finalmente, elimine los carbohidratos N-ligados de los péptidos añadiendo 250 unidades de péptido n-glicosidasa F libre de glicerol o P-N-G-A-F a cada tubo de muestra e incube a 37 grados Celsius durante la noche. Tras la incubación nocturna con P-N-G-S-F, utilice puntas de pipeta tipo zip tip que contengan una matriz de fase reversa C 18 para desalar las muestras antes de comenzar.Prepare dos gotas, una de ácido fórmico al 0,1 % y otra de acetonitrilo al 80 % más ácido fórmico al 0,1 % sobre un trozo de paraformo para lavar y eluir. Las gotas se utilizan para evitar la contaminación cruzada de péptidos entre muestras, y se preparan nuevas gotas para cada muestra que se procesa con el tip. Comience humedeciendo un tip zip con soluciones de acetonitrilo. Equilibre el tip zip pipeteando de arriba abajo tres veces con 10 microlitros de ácido fórmico al 0,1 %.Cargue la muestra pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Luego, lave la punta con 10 microlitros de ácido fórmico al 0,1 % cinco veces. Finalmente, eluya la muestra dos veces con acetonitrilo al 80 % en ácido fórmico al 1 %, y recoja los péptidos eluidos en un tubo eppendorf.Reduzca el volumen de la muestra a menos de dos microlitros mediante concentración en un centrífugo de vacío y finalice resuspendiendo las muestras en 20 microlitros de ácido fórmico al 0,1%. Las muestras ya están listas para su análisis mediante L-C-M-S-M-S. La conjugación porro generalmente produce concentraciones de lectina en perlas en el rango de dos a 20 miligramos por mililitro, lo cual es óptimo para cromatografía de afinidad.La cromatografía de lectinas de plasma humano agotado de albúmina digerido con tripsina normalmente enriquece los glicopéptidos en la fracción retenida. Nuestro flujo de trabajo identifica glicopéptidos N-enlazados, que contienen la secuencia de consenso NXS o NXT, donde X es cualquier residuo excepto prolina. El tratamiento con PNGF elimina los glicanos N-enlazados y desamina el residuo de asparagina al que estaban unidos los glicanos.La dación provoca un desplazamiento de masa de un Dalton en el péptido desglicosilado o el deglicopéptido respecto al péptido sin modificar. Por lo tanto, los deglicopéptidos DEG se identifican como péptidos que contienen la secuencia de consenso para enlace N, en la cual el residuo de asparagina dentro de la secuencia de consenso está desamidado, observándose como una diferencia de masa de más uno en comparación con un residuo de asparagina sin modificar. A continuación, dos espectros de ejemplo ilustran este concepto.El espectro superior muestra la fragmentación de un péptido no modificado que contiene la secuencia consenso EnLink. El espectro inferior muestra la fragmentación del mismo péptido con el residuo de asparagina desaminado dentro de la secuencia consenso EnLink. Los iones moleculares marcados con círculo de los fragmentos Y siete, Y ocho y B tres del péptido desamidado presentan un aumento en masa de un dalton en comparación con sus contrapartes en el péptido no modificado.Este cambio de masa indica que el péptido en el espectro inferior contiene un residuo de asparagina desamidado. Habitualmente, utilizando un QStar elite, se identificarán entre 1000 y 1300 péptidos totales en la fracción de flujo libre y entre 200 y 400 péptidos en la fracción retenida. En promedio, la fracción de flujo libre procedente de una cromatografía de l o SNA contiene entre un 2 y un 4 % de péptidos desglicosilados, mientras que entre el 30 y el 50 % de los péptidos recuperados en la fracción retenida son péptidos desglicosilados.Utilizamos el término deg glicopéptidos en lugar de glicopéptidos, ya que las moléculas desglicosiladas y desamidadas se observan durante el análisis espectrométrico de masas. Sin embargo, proponemos que la mayoría de los glicopéptidos DEG en nuestras muestras eran glicopéptidos previamente no ligados que fueron desglicosilados y desaminados mediante el tratamiento con PN GF. El enriquecimiento de desglicopéptidos en nuestra muestra ligada respalda esta hipótesis y nos permite utilizar la detección de glicopéptidos D como un indicador indirecto de los glicopéptidos capturados por nuestro protocolo de cromatografía de afinidad por lectinas.Deben observarse dos o más glicopéptidos distintos de invertasa d en la fracción de flujo y dos o más glicopéptidos distintos de desglicosilada lactoferrina en la fracción retenida. Acabamos de mostrarle cómo preparar columnas de lectina y realizar cromatografía de afinidad por lectina en formato HPLC. Al realizar este procedimiento, es importante comenzar con muestras de glicopéptidos de alta calidad, monitorear el pH de sus muestras durante todo el experimento y confirmar la calidad de su cromatografía mediante estándares de glicopéptidos.Así es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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Pulso-caza de análisis de cadenas de azúcares unidos a N de glicoproteínas en células de mamífero

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Anticuerpos, químicamente bloqueado Microarray de multiplexado de alto rendimiento de perfiles de glicosilación de proteínas específicas en muestras complejas

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