Name: La liberación de dopamina en los terminales presinápticos individuales visualizados con FFNs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-31T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprende a visualizar la liberación de dopamina en terminales presinápticos individuales utilizando FFN 511 en rodajas de cerebro de ratón. Este método permite estudiar la neurotransmisión dopaminérgica en tiempo real.

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D. El Sames gracias Harold G. &amp; Y. Mathers Leila Charitable Foundation y la Universidad de Columbia iniciativas en ciencia e ingeniería. D. Sames y Sulzer D. agradecer a la Fundación McKnight de las innovaciones tecnológicas en McKnight Premio de Neurociencia D. Sulzer gracias NIDA, NIMH, y el Picower y Fundaciones Enfermedad de Parkinson. H. Zhang NARSAD gracias. HR Edwards gracias al Michael J. Fox Foundation, la Fundación Nacional de Parkinson, el NIDA y el NIMH. Damos las gracias a Robert Burke por 6-OHDA inyecciones y asesoramiento, Sonders Marcar útil para el debate, Merek Siu para la programación de análisis de imágenes, y Schmoranzer Jan de apoyo técnico con la configuración de la microscopía TIRF.

Este método se utilizó en la investigación publicada en <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/324/5933/1441">Gubernator et al., Science 324 (5933). 1441-1444 (2009)</a> . 1. Preparación aguda rebanadas estriatales <ol><li> Antes de preparar las rebanadas estriatal aguda, se debe oxigenar el líquido cefalorraquídeo artificial (ASCF) y enfriar con hielo durante al menos 15 minutos antes de la extracción del cerebro. Mantener el frío de hielo y ACSF oxigenada durante la disección. ACSF (en mM): NaCl 125, KCl 2,5, NaHCO3 26, CaCl2 2,4, MgSO4 1,3, KH 2 PO 4 0,3, glucosa 10, HEPES 5, pH 7,3-7,4, 290-295 mOsm. </li><li> Decapitar ratón macho sin anestesia. </li><li> Extraer todo el cerebro del ratón, y montarlo en la bandeja de vibratome colocado en el vibratome utilizando pegamento Krazy ®. Extracción del cerebro y el montaje se debe hacer en 2 minutos. Durante este tiempo, asegúrese de mantener el frío de hielo ACSF y oxigenado para mantener el tejido sano. </li><li> Corte coronal rodajas de cerebro del cuerpo estriado en espesor de 250 micras entre bregma desde 1.54 hasta 0.62 1. Tres rebanadas se obtiene que puede ser cortado en 6 rodajas de media con una aguja. </li><li> Se incuban las rodajas de cerebro en ACSF oxigenada a temperatura ambiente durante al menos 1 hora antes de la carga de la sonda. Rebanadas de buena exhibición FFN511 de carga y permanecer activos para obtener imágenes de hasta 4 horas después de la preparación rebanada. </li></ol> 2. Cargando FFN511 <ol><li> Prepare FFN511 solución de carga (10μM FFN511 en ACSF); también preparan 100μM ADVASEP-7 en ACSF. Todas las soluciones deben ser recién preparadas, oxigenada por lo menos 15 minutos antes de cargarlos en los cortes. </li><li> Individualmente se incuban con una solución de corte de carga FFN511 durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> A continuación, retire el tinte unido al tejido extracelular mediante la incubación de la corte en carga oxigenada 100μM ADVASEP-7 ACSF durante 30 minutos a temperatura ambiente 2. Rodajas ya están listos para la imagen. </li></ol> 3. Imágenes FFN511 en las rebanadas de cerebro Imágenes de FFN511 en los cortes se realiza mediante microscopio de barrido láser multifotónica. Estamos utilizando una pradera Ultima multifotónica microscopio de barrido láser (Estábamos utilizando un Zeiss LSM 510 NLO multifotónica microscopio de barrido láser anteriormente y algunos resultados se obtuvieron con el microscopio Zeiss). <ol><li> Coloque la rebanada FFN511 cargada en la cámara de grabación (RC-27L, Warner) y superfuse con ACSF oxigenada con un caudal de 2.1 ml por minuto. A continuación, coloque un arpa de platino con cuerdas de nylon en la parte superior de la rebanada para minimizar el movimiento durante el experimento. Para minimizar aún más el movimiento, permiten el corte se estabilice por lo menos 10 minutos en la cámara antes de la imagen. </li><li> Visualizar y localizar el cuerpo estriado dorsal, con la luminiscencia de campo claro en un objetivo de inmersión en agua 10 veces. </li><li> Lugar y la posición de los electrodos de tungsteno bipolar trenzado en esta región si se realiza un experimento de estimulación. El área de imagen ideal se encuentra a menos de 300 m entre las dos puntas del electrodo bipolar estimulante. Situar a la región en el centro del campo visual. </li><li> Imagen FFN511 marcado con terminales estriatales en un 63x (0,9 NA) objetivo de inmersión de agua ultravioleta. FFN511 se excita a 760 nm con un láser Mai Tai de la Física y de fluorescencia espectral óptimo de los terminales del cuerpo estriado se ve a través de un filtro pasa banda (480-520 nm). Las imágenes se capturan en formato de 12-bit con 75 x 75 m de las regiones de interés de 512 píxeles de resolución x 512. Para estimular los experimentos de decoloración, para compensar el eje Z de turno, un z-series de imágenes 5.7, separados por un m en el plano z, se obtiene para cada período de tiempo. </li></ol> 4. FFN511 decolorante La etiqueta puede ser FFN511 desteñido, ya sea por alta concentración de KCl (utilizamos 70 mM KCl), (+)-anfetamina sulfato (AMPH, 20 M), o la estimulación eléctrica. En el experimento de decoloración KCl, cuando una solución de potasio ACSF alta se aplica a la porción del cerebro, el FFN511 destains etiqueta en 2 minutos. Registro xyz-t imágenes para realizar un seguimiento FFN511 decoloración con el tiempo. A continuación se describe la estimulación eléctrica dependiente de decoloración de terminales de dopamina: <ol><li> Para realizar el seguimiento FFN511 decoloración con el tiempo, xyz-t se graban las imágenes. A fin de garantizar un mínimo movimiento de la porción (menos de 4 m en el eje Z) y no photobleaching por el láser, imágenes de la serie de control de tiempo de la z-stack se debe obtener por lo menos 5 minutos antes de la estimulación. En caso contrario, ajustar la potencia del láser. </li><li> A raíz de estas imágenes de control, continuar con la imagen xyz-t, mientras que iniciar la estimulación a frecuencias de 1, 4 o 20 Hz. Estímulos a los 1, 4 o 20 Hz (300 ms x 1 mA) se aplican en el cuerpo estriado a nivel local por un aislador de estímulo Iso-Flex provocado por un maestro-8 generador de impulsos (AMPI, Jerusalén, Israel), utilizando electrodos bipolares. Para reducir al mínimola variación en la despolarización de los sitios de liberación, hemos utilizado un protocolo de estimulación de aplicar el 150% de la intensidad de la estimulación máxima determinada por voltametría cíclica. </li><li> Utilice el software adecuado para el análisis de imágenes. En nuestro laboratorio, el uso de la imagen J (Wayne Rosband, Institutos Nacionales de Salud, Rockville, MD) y software a medida, escrito en IDL (Research Systems, Boulder, CO) para cuantificar la fluorescencia de puntos lagrimales y los cambios con tiempo3. </li></ol> Resultados represenative La figura 1 muestra FFN511 carga en parte del cuerpo estriado se ha completado. Imágenes representativas con el objetivo de 10x y 60x se muestran en la Figura 1. El etiquetado selectiva de los terminales de dopamina puede ser desteñido por las anfetaminas M 20. La figura 2 muestra decoloración de FFN511 etiquetado por KCl alta. La Figura 3 muestra decoloración de FFN511 etiquetado mediante la estimulación eléctrica local. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 FFN511 etiquetas de terminales de dopamina en vivo corticotalamoestriatales rodajas aguda (A) Etiquetado de FFN511 aguda en vivo corticotalamoestriatales corte:.. Etiquetado abundante en el cuerpo estriado (STR), etiquetado más escaso en la corteza (CTX), y no en la etiqueta cuerpo calloso (CC). Barra de escala:. 100 micras (B) Decoloración de FFN511 del cuerpo estriado por las anfetaminas. Paneles de la izquierda: antes de las anfetaminas, los paneles de la derecha: después de 20 minutos de la anfetamina M 20. Barra de escala: 10 micras. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Decoloración de FFN511 etiquetado por KCl alta. Etiquetado FFN511 es destained dentro de la aplicación de 2 minutos de KCl 70 en ACSF. Barra de escala: 10μm. <img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Dependiente de la frecuencia de decoloración de FFN511 etiquetado en el cuerpo estriado. (A) la estimulación local de 4 Hz como resultado de decoloración de los terminales. La estimulación se inició en t = 0. Barra de escala: 5 micras (B) Decoloración de FFN511 a 4 Hz es Ca 2 + - y dependientes de la frecuencia.. Controles no recibieron la estimulación (153 puntos lagrimales de 3 rebanadas). Decoloración con cloruro de cadmio (200 M) era idéntico a los controles sin estimular (475 puntos lagrimales de 5 rebanadas). Las curvas de decoloración para cada frecuencia de estimulación se forma por una función de decaimiento exponencial de una sola y la vida media (t 1 / 2) los valores calculados como τ x 0.693 (1 Hz: 765 puntos lagrimales de 9 rebanadas, 4 Hz: 410 puntos lagrimales de 7 segmentos, 20 Hz: 416 puntos lagrimales de 6 porciones). Por favor refiérase a la micrografía de vídeo de 2-fotones microscopía de FFN511 decoloración durante la exocitosis en la preparación del cerebro rebanada del cuerpo estriado.

<ol><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxi coordinators. , Academic Press. San Diego. (1997).</li>
<li>Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+activity+in+intact+brain+and+slices+with+FM1-43+in+C.+elegans%2C+lamprey%2C+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat.</a> Neuron. 24, 8098-8117 (1999).</li>
<li>Bamford, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosynaptic+dopamine+neurotransmission+selects+sets+of+corticostriatal+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals.</a> Neuron. 42, 653-653 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este vídeo, se demuestra un método para visualizar la neurotransmisión ópticamente con análogos fluorescentes de la dopamina. FFN511 es la primera generación de FFNs que hemos desarrollado. A pesar de que fue diseñado por objetivo el transportador vesicular de monoaminas neuronales (VMAT2) que lleva la monoamino neurotransmisores desde el citoplasma en vesículas sinápticas y, específicamente, las etiquetas de terminales de dopamina en el estriado y catecolaminas presunta y / o terminales de la serotonina en la corteza (como se muestra en la ciencia papel), un período de carga adecuada es fundamental para la especificidad desde FFN511 es relativamente hidrofóbica. Se encontró que la incubación de más de 40 minutos se traducirá en manchas extensas inespecíficos en rebanadas estriatales. La especificidad puede ser directamente determinado por decoloración utilizando una alta concentración de KCl, que hace que la liberación de FFN dentro de las vesículas sinápticas funcionales. La exposición de la división para FFN511 de menos de 15 minutos se traducirá en una señal débil fluorescencia debido a la carga insuficiente de la tintura en las terminales. En este protocolo, el uso de 100μM ADVASEP-7 para quitar el tinte obligado a tejido extracelular. Este paso no es necesario, pero si se omite, el tiempo de lavado en ACSF debe ser prolongado. En resumen, dependiendo de la preparación que se elija, tendrá que modificar el período de concentración y de carga para determinar el etiquetado óptima.

<table><tbody><tr><td>FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one)</td><td>Columbia University - Dalibor Sames Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADVASEP-7 </td><td>CyDex</td><td>AR-OA7-005</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de registro RC-27L</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0375</td><td></td></tr><tr><td>Soporte PELCO PrepEze de 6 pocillos</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>36157-1</td><td>Para incubación de secciones</td></tr><tr><td>Estimulador de pulsos Master-8 y aislador de estímulos Iso-Flex</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la liberación de dopamina en los terminales presinápticos individuales visualizados con ffns

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

El sistema nervioso transmite señales entre las neuronas a través de la liberación de neurotransmisores durante la fusión de vesículas sinápticas. Para observar la captación de neurotransmisores y liberación de terminales presinápticas individuales directamente, hemos diseñado fluorescentes neurotransmisores falsos como sustrato para el transportador de monoamina vesicular sináptica. El uso de estas sondas para liberar la imagen de la dopamina en el estriado, que hizo varias observaciones pertinentes a la plasticidad sináptica. Hemos encontrado que la fracción de la liberación de las vesículas sinápticas del neurotransmisor por estímulo depende de la frecuencia del estímulo. A cinéticamente distintas &quot;reserva&quot; de la población de vesículas sinápticas no se observó en estas condiciones experimentales. Una heterogeneidad depende de la frecuencia de las terminales presinápticas se reveló que se depende en parte de los receptores D2 de la dopamina, lo que indica un mecanismo para dependientes de la frecuencia de codificación de la selección pre-sináptica. Hui Zhang y Gubernator Niko G. contribuyeron igualmente a este trabajo.

Una nueva forma de medir la neurotransmisión ópticamente con análogos fluorescentes de la dopamina.

La liberación de dopamina en los terminales presinápticos individuales visualizados con FFNs

El sistema nervioso transmite señales entre neuronas mediante la liberación de neurotransmisores durante la fusión de las vesículas sinápticas. Para observar la captación de neurotransmisores y...

El neurotransmisor falso fluorescente. FFN 511 es el monoaminofluorescente que puede actuar como sustrato para el transportador físico de monoaminas sináptico cuando se aplica a cortes cerebrales. FFN 511 es captado por las vesículas sinápticas dopaminérgicas mediante el transportador de monoaminas y puede utilizarse para visualizar directamente la liberación del transmisor desde terminales presinápticos de neuronas monoaminérgicas, como las del estrato S. La liberación del transmisor desde los terminales es visible en el corte como una reducción en las señales fluorescentes punteadas.En este video, se preparan cortes coronales de sal de 250 micrómetros de grosor utilizando un vibrátomo, se tiñen con FFN 511 y se imagina mediante un microscopio láser de múltiples fotones. Se muestran experimentos de detención que revelan una heterogeneidad dependiente de la frecuencia en la liberación de iCal. Hola, soy HU del Laboratorio de David en el Departamento de Neurología de la Universidad de Columbia.Hola, soy Minerva, también del Laboratorio Soldier. Hoy les mostraremos un procedimiento para marcar terminales dopaminérgicos en cortes cerebrales con neurotransmisores falsos fluorescentes. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la liberación de dopamina.Así que comencemos. Antes de preparar cortes agudos de la sal, se debe oxigenar el líquido cefalorraquídeo artificial A CSF y enfriarlo con hielo durante al menos 15 minutos antes de la extracción del cerebro; mantenga el A CSF helado y oxigenado. Durante la disección, extraiga todo el cerebro del ratón y colóquelo en la bandeja del vibrosomo, fijándolo a esta con pegamento instantáneo. La extracción y montaje del cerebro deben realizarse dentro de los dos minutos.Llene la bandeja con A CSF oxigenado y enfriado y corte coronales directos del cerebro con un grosor de 250 micrómetros entre +1,54 y +0,623. Se obtendrán rodajas que pueden dividirse en seis semirrodajas con una aguja. Incube las rodajas cerebrales en A CSF oxigenado a temperatura ambiente durante al menos una hora mientras se incuban las rodajas cerebrales.En LCR A oxigenado, prepare la solución de carga de FFN 511 de 10 micromolar añadiendo la solución stock de FFN 511 de 10 milimolar al LCR A. Después, prepare una solución de A-D-V-A-S-E-P siete de cien micromolar en LCR A. Oxigene ambas soluciones durante al menos 15 minutos antes de cargarlas en las secciones individualmente. Incube cada sección cerebral con la solución de carga de FFN 511 durante 30 minutos a temperatura ambiente.A continuación, elimine el di unido al tejido extracelular incubando la sección cargada en 100 micromolar de advers en A CSF oxigenado durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones ya están listas para la obtención de imágenes. La tinción con FFN 511 se observará en las secciones utilizando un microscopio de barrido láser multiphotón prairie Ultima. Coloque la sección cargada con FFN 511 en la cámara de registro y suprafunda con A CSF oxigenado a un flujo de uno a dos mililitros por minuto. Luego, coloque una parrilla de platino con hilos de nailon encima de la sección para minimizar el movimiento.Durante el experimento, para minimizar aún más el movimiento, permita que los cortes se estabilicen durante al menos 10 minutos en la cámara antes de la adquisición de imágenes. Visualice y localice el estriado dorsal AUM mediante luminiscencia de campo claro con un objetivo de inmersión en agua de 10x, y coloque los electrodos de tungsteno bipolares torcidos en esta región para realizar un experimento de estimulación. El área de adquisición inactiva se encuentra dentro de los 300 micrómetros.Entre las dos puntas del electrodo bipolar estimulante, coloque esta región en el centro de la imagen del campo visual con terminales Sal marcados con FFN 511 bajo un objetivo de inmersión en agua de 63 x ultravioleta. FFN 511 se excita a 760 nanómetros con un láser mi tai de Spectral Physics. La fluorescencia óptima de los terminales SAL se observa mediante un filtro de paso de banda; capture las imágenes en formato de 12 bits con regiones de interés de 75 por 75 micrómetros a una resolución de 512 por 512 píxeles. A continuación se muestra una imagen de ejemplo con terminales dopaminérgicos Sal marcados con FFN 511.La marca FFN 511 puede desvanecerse ya sea por altas concentraciones de sulfato de anfetamina en cloruro de potasio o por estimulación eléctrica en el experimento de retención con cloruro de potasio, cuando se aplica al corte cerebral una solución de CSF con alto contenido de potasio; la marca FFN 511 se desvanece dentro de los cuatro minutos. Registre imágenes XYZT para rastrear la retención de FFN 511 a lo largo del tiempo en la tinción con FFN 511 mediante estimulación eléctrica. Obtenga una serie temporal de control de la región de interés antes de la estimulación durante al menos cinco minutos para asegurar un movimiento mínimo del corte y ausencia de fotoblanqueo provocado por el láser. Tras la adquisición de las imágenes de control.Continúe con la adquisición de imágenes XYZT mientras inicia la estimulación a frecuencias de uno, cuatro o 20 hercios; los estímulos se aplican localmente al estriado mediante un aislador de estímulos Iso-Flex activado por un generador de pulsos maestro modelo Master 8, utilizando electrodos bipolares. Este video muestra la liberación de FFN 511 durante la exocitosis en un corte cerebral SAL. Una vez completada la carga de FFN 511 en el SAL, se observa una marcación abundante en el estriado, una marcación escasa en la corteza y ausencia de marcación en el cuerpo calloso.La marcación selectiva de terminales dopaminérgicas puede ser observada mediante cloruro de potasio elevado, como se muestra en estas imágenes representativas antes del cloruro de potasio y dos minutos después de la aplicación de cloruro de potasio 70 milimolar. También se puede lograr una marcación de FFN 511 en el LCR mediante anfetamina. Y esta imagen muestra la marcación con FFN 511 en el estriado antes de la administración de anfetamina.Aunque esta imagen muestra el estriado 20 minutos después de la retención con anfetamina de 20 micromolares, la retención de FFN 511 mediante estimulación eléctrica local se ilustra en estas imágenes, que muestran la marcación con FFN 511 en el estriado antes de la estimulación y a los 217 segundos y 514 segundos tras el inicio de la estimulación a cuatro hercios. Este gráfico de la intensidad de fluorescencia normalizada frente al tiempo muestra que la retención de FFN 511 depende del calcio y de la frecuencia; los controles representados por triángulos sin rellenar no recibieron estimulación. La retención con cloruro de cadmio, representada por círculos sin rellenar, fue idéntica a la de los controles sin estimular.Las curvas de desecho para cada frecuencia de estimulación representadas por los círculos de colores se ajustaron mediante una función de decaimiento exponencial simple y los valores de semivida se calcularon como tau mediante Naut 0,693. Acabamos de mostrarle cómo cargar un neurotransmisor fluorescente de fuerza FFN cinco 11 en terminales dopaminérgicas en el corte agudo al y cómo liberarlo mediante potasio alto y provocar la estimulación. Esta es la primera técnica desarrollada para examinar ópticamente la liberación de neurotransmisores a nivel de terminales sinápticos individuales.Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener las secciones muy saludables y ser consciente del tiempo de carga, el blanqueo del fondo y los artefactos por movimiento; las secciones deben mostrar una buena carga de FFN cinco 11 y permitir la adquisición de imágenes hasta cuatro horas después de su preparación. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Biología

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Aprende a visualizar la liberación de dopamina en terminales presinápticos individuales utilizando FFN 511 en rodajas de cerebro de ratón. Este método permite estudiar la neurotransmisión dopaminérgica en tiempo real.

La liberación de dopamina en los terminales presinápticos individuales visualizados con FFNs

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