La liberación de dopamina en los terminales presinápticos individuales visualizados con FFNs

El neurotransmisor falso fluorescente. FFN 511 es el monoaminofluorescente que puede actuar como sustrato para el transportador físico de monoaminas sináptico cuando se aplica a cortes cerebrales. FFN 511 es captado por las vesículas sinápticas dopaminérgicas mediante el transportador de monoaminas y puede utilizarse para visualizar directamente la liberación del transmisor desde terminales presinápticos de neuronas monoaminérgicas, como las del estrato S. La liberación del transmisor desde los terminales es visible en el corte como una reducción en las señales fluorescentes punteadas.

En este video, se preparan cortes coronales de sal de 250 micrómetros de grosor utilizando un vibrátomo, teñidos con FFN 511 e imagenados mediante un microscopio láser de múltiples fotones. Se muestran experimentos de detención que revelan una heterogeneidad dependiente de la frecuencia en la liberación de iCal. Hola, soy HU del Laboratorio de David en el Departamento de Neurología de la Universidad de Columbia.

Hola, soy Minerva, también del Laboratorio Soldier. Hoy les mostraremos un procedimiento para marcar terminales dopaminérgicos en cortes cerebrales con neurotransmisores falsos fluorescentes. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la liberación de dopamina.

Así que comencemos. Antes de preparar cortes agudos de la amígdala, se debe oxigenar el líquido cefalorraquídeo artificial A CSF y enfriarlo con hielo durante al menos 15 minutos antes de la extracción del cerebro; mantenga el A CSF helado y oxigenado. Durante la disección, extraiga todo el cerebro del ratón y colóquelo sobre la bandeja del vibrosomo, fijándolo a esta con pegamento instantáneo. La extracción y montaje del cerebro deben realizarse dentro de los dos minutos.

Llene la bandeja con A CSF oxigenado y enfriado, y corte coronales rectos del cerebro con un grosor de 250 micrómetros entre +1,54 y +0,623. Se obtendrán rodajas, que pueden dividirse en seis semirrodajas con una aguja. Incube las rodajas cerebrales en A CSF oxigenado a temperatura ambiente durante al menos una hora mientras se incuban las rodajas cerebrales.

En LCR A oxigenado, prepare la solución de carga de FFN 511 de 10 micromoles agregando la solución stock de FFN 511 de 10 milimoles al LCR A. Después, prepare una solución de A-D-V-A-S-E-P siete de cien micromoles en LCR A. Oxigene ambas soluciones durante al menos 15 minutos antes de cargarlas en los cortes individualmente. Incube cada corte cerebral con la solución de carga de FFN 511 durante 30 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, elimine el di unido al tejido extracelular incubando el corte cargado en 100 micromolar de advers en A CSF oxigenado durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los cortes ya están listos para la obtención de imágenes. La tinción con FFN 511 se observará en los cortes mediante un microscopio de barrido láser multiphotón prairie Ultima. Coloque el corte cargado con FFN 511 en la cámara de registro y suprafunda con A CSF oxigenado a un flujo de uno a dos mililitros por minuto. Luego, coloque una rejilla de platino con hilos de nailon encima del corte para minimizar el movimiento.

Durante el experimento, para minimizar aún más el movimiento, permita que los cortes se estabilicen durante al menos 10 minutos en la cámara antes de la adquisición de imágenes. Visualice y localice el cuerpo estriado dorsal AUM mediante luminiscencia de campo claro con un objetivo de inmersión en agua de 10x, y coloque los electrodos de tungsteno torcidos bipolares en esta región para realizar un experimento de estimulación. El área de adquisición de imágenes inactiva se encuentra dentro de los 300 micrómetros.

Entre las dos puntas del electrodo bipolar estimulante, coloque esta región en el centro de la imagen del campo visual con terminales Sal marcadas con FFN 511, utilizando un objetivo de inmersión en agua de 63x ultravioleta. FFN 511 se excita a 760 nanómetros con un láser mi tai de Spectral Physics. La fluorescencia óptima de los terminales SAL se observa mediante un filtro de paso de banda; capture las imágenes en formato de 12 bits, con regiones de interés de 75 por 75 micrómetros y una resolución de 512 por 512 píxeles. A continuación se muestra una imagen de ejemplo con terminales dopaminérgicos Sal marcados con FFN 511.

La marca FFN 511 puede desvanecerse ya sea por altas concentraciones de sulfato de anfetamina en cloruro de potasio o por estimulación eléctrica en el experimento de retención con cloruro de potasio, cuando se aplica al corte cerebral una solución de CSF con alto contenido de potasio. La marca FFN 511 se desvanece dentro de los cuatro minutos. Registre imágenes XYZT para rastrear la retención de FFN 511 a lo largo del tiempo en la tinción con FFN 511 mediante estimulación eléctrica. Obtenga una serie temporal de control de Zack antes de la estimulación durante al menos cinco minutos para asegurar un movimiento mínimo del corte y ausencia de fotoblanqueo provocado por el láser. Tras la adquisición de las imágenes de control.

Continúe con la adquisición de imágenes XYZT mientras inicia la estimulación a frecuencias de uno, cuatro o 20 hercios; los estímulos se aplican localmente al estriado mediante un aislador de estímulos Iso-Flex activado por un generador de pulsos maestro de ocho canales, utilizando electrodos bipolares. Este video muestra la liberación de FFN 511 durante la exocitosis en un corte cerebral de SAL. Una vez completada la carga de FFN 511 en el SAL, se observa una marcación abundante en el estriado, una marcación escasa en la corteza y ausencia de marcación en el cuerpo calloso.

La marcación selectiva de terminales dopaminérgicas puede realizarse mediante cloruro de potasio elevado, como se muestra en estas imágenes representativas antes del cloruro de potasio y dos minutos después de la aplicación de cloruro de potasio 70 milimolar. Asimismo, una marcación de FFN 511 en el LCR puede lograrse mediante anfetamina. Esta imagen muestra la marcación con FFN 511 en el estriado antes de la administración de anfetamina.

Aunque esta imagen muestra el estriado 20 minutos después de la retención con anfetamina de 20 micromolares, la retención de FFN 511 mediante estimulación eléctrica local se ilustra en estas imágenes, que muestran la marcación con FFN 511 en el estriado antes de la estimulación y a los 217 segundos y 514 segundos tras el inicio de la estimulación a cuatro hercios. Este gráfico de la intensidad de fluorescencia normalizada frente al tiempo muestra que la retención de FFN 511 depende del calcio y de la frecuencia; los controles representados por triángulos sin rellenar no recibieron estimulación. La retención con cloruro de cadmio, representada por círculos sin rellenar, fue idéntica a la de los controles sin estimular.

Las curvas de desensibilización para cada frecuencia de estimulación, representadas por los círculos de colores, se ajustaron mediante una función de decaimiento exponencial simple y los valores de semivida se calcularon como tau mediante Naut 0,693. Acabamos de mostrarle cómo cargar un neurotransmisor fluorescente de fuerza FFN cinco 11 en terminales dopaminérgicas en el corte agudo al y cómo liberarlo mediante potasio elevado y provocar la estimulación. Esta es la primera técnica desarrollada para examinar ópticamente la liberación de neurotransmisores a nivel de terminales sinápticos individuales.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener las secciones muy saludables y ser consciente del tiempo de carga, el blanqueo del fondo y los artefactos por movimiento; las secciones deben mostrar una buena carga de FFN cinco 11 e imágenes hasta cuatro horas después de la preparación de las secciones. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.