Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Em larvas de zebrafish, um estímulo visual pode ativar neurônios somatosensoriais e desencadear uma resposta de fuga. Existem dois tipos de neurônios encontrados nos neurônios larva, trigeminal e Rohon-Beard. Podemos manipular a atividade desses neurônios modificando-os para expressar canais de íons transgênicos sensíveis à luz.
Para realizar esta técnica, monte uma larva transgênica com o lado dorsal voltado para cima em gel de agarose e coloque-a sob um microscópio dissecando. Use uma lâmina de barbear para desprender uma porção em forma de cunha de agarose ao redor da gema e cauda. Preencha esta área com água de ovo.
Posicione a ponta de um cabo óptico perto do tronco onde está localizado o corpo celular do neurônio Rohon-Beard. Entregue um pulso de luz laser azul. Após a exposição à luz azul, os canais de íons transgênicos sensíveis à luz na membrana do neurônio se abrem, permitindo que íons entrem, desencadeando um potencial de ação que provoca a resposta de fuga. Regisse o comportamento da larva usando uma câmera de alta velocidade.
No protocolo de exemplo, montaremos as larvas para ativar o neurônio Rohon-Beard, expressando uma variante channelrhodopsin e observar a resposta comportamental.
- Faça 1,5% de baixa derretimento em água dupla destilada e armazene em um bloco de calor de 42 graus Celsius para evitar que se solidifique. Usando uma pipeta Pasteur de vidro, transfira uma das larvas pré-tela para um tubo de 1,5% de baixa derretimento com o menor calírio azul possível.
Sob um microscópio dissecando, posicione o lado dorsal da larva para cima. Quando a agarose for solidificada, use uma lâmina de barbear fina para cortar a ágarose de ambos os lados da larva. Preencha a área ao redor da ágarose com água azul de embrião.
Em seguida, faça dois cortes diagonais de ambos os lados da gema, tomando cuidado para não cortar a larva.
Agora, monte a câmera de alta velocidade no escopo de dissecação e conecte a câmera ao computador. Em seguida, ligue o computador e a câmera de alta velocidade. Abra o software de imagem de vídeo e ajuste as configurações da câmera. Em seguida, conecte o cabo óptico, o laser e o estimulador juntos.
Em seguida, use o microscópio de dissecação fluorescente para posicionar a ponta do cabo óptico perto de um corpo de célula de neurônio com expressão ChEF-tdTomato. Entregue um pulso de luz azul para ativar o neurônio sensorial. Em seguida, registe as respostas usando uma câmera de alta velocidade fixada em 500 ou 1.000 quadros por segundo e repita os experimentos com pelo menos 1 minuto entre ativações para evitar a habituação.
Para liberar a larva, retire a agarose com fórceps e tenha cuidado para não ferir o animal. Em seguida, transfira-o para água de embrião azul fresco. Os animais podem ser autorizados a se desenvolver ainda mais, e o procedimento pode ser repetido em estágios mais antigos.
