Un enfoque de genética inversa para probar la redundancia funcional durante la embriogénesis

El objetivo general de este procedimiento es determinar si dos genes son funcionalmente redundantes para la especificación de un linaje celular definido. Esto se logra definiendo primero el fenotipo de pérdida de función de cada gen individual utilizando morfos específicos de genes inyectados en embriones de pez cebra en desarrollo. El segundo paso del procedimiento es desarrollar un ensayo para cuantificar la especificación o diferenciación del linaje celular.

Por ejemplo, utilizando una cepa de pez reportero, como mostraremos aquí. El tercer paso del procedimiento es combinar dos FENOs morfo para atacar la pérdida de función de ambos genes simultáneamente. El paso final del procedimiento es evaluar el fenotipo causado por el doble derribo.

En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren la pérdida o ganancia de función para las células de un linaje específico a través del examen del indicador de linaje o el análisis de la expresión para el marcador específico del linaje. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la combinación de knockouts en el modelo de ratón, es que dos o incluso tres genes pueden ser atacados en el modelo de peces simplemente combinando morfos validados en un solo experimento. Se pueden inyectar más de 100 embriones y evaluar los fenotipos en el transcurso de varios días.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave. En la biología del desarrollo, como la definición de las vías transcripcionales que controlan el destino de las células, las vías reguladoras clave a menudo están representadas por pequeñas familias de genes relacionados que son funcionalmente redundantes. Por lo tanto, su papel no es evidente en los estudios de knockout de ratones debido a la compensación de los genes hermanos.

Aunque este modelo puede proporcionar información sobre la embriogénesis del pez cebra, los resultados se pueden aplicar a otros sistemas como el ratón, ya que los mismos programas genéticos suelen estar bien conservados a lo largo de la evolución. Prepare las placas de microinyección antes de inyectar los embriones. Vierta aproximadamente 12 mililitros de 2%agros en el agua del sistema, que es agua limpia tomada directamente del sistema de la pecera en la tapa invertida de una placa de Petri de 100 milímetros.

Coloque dos portaobjetos de microscopio en ángulos de aproximadamente 45 grados en los dos lados de la tapa. Cuando el agros se haya solidificado, retire suavemente los portaobjetos de la tapa, creando canales donde descansarán los embriones durante la inyección, no se mantienen los tallos a temperatura ambiente a una concentración de un milimolar y se disipara agua destilada desionizada estéril antes de inyectar. Incube las reservas de morphos a 65 grados centígrados durante cinco minutos para asegurarse de que estén completamente en solución.

Deje que las caldas se enfríen a temperatura ambiente. Cada morfo recién diseñado debe ser validado empíricamente para la actividad y la tolerancia embrionaria. En los tubos de microcentrífuga, comience con una o dos diluciones en serie del morfo en stock en agua destilada desionizada, produciendo concentraciones de trabajo de un milimolar, 0,5 milimolar, 0,25 milimolar y 0,125 milimolar.

Bajo un endoscopio de disección, use la succión para cargar frontalmente una aguja de inyección calibrada que se haya conectado al micromanipulador y se haya colocado correctamente. Cargue la aguja con aproximadamente un microlitro de la solución morfo de concentración más baja. Utilice una pipeta de transferencia para mover los embriones fertilizados de una célula a los canales de la placa de microinyección.

Utilice la pipeta para eliminar el exceso de agua de la placa para que los embriones caigan al fondo del comedero. Coloque la placa de inyección bajo el microscopio, descienda la aguja a través del corion y dentro de la yema. Inyecte cada embrión antes de retirar la aguja y volver a colocar la placa de inyección para acceder al siguiente embrión.

Al aprender a inyectar, puede ser útil usar un tinte vital para visualizar la inyección en la célula, como se muestra aquí, transfiera los embriones a una placa de Petri de 100 milímetros con un sistema de cultivo de agua a 28.5 grados Celsius. Expulse cualquier resto de solución morfo de la aguja y llénela con la siguiente concentración más alta de morfo para inyectar el siguiente lote de embriones en una etapa apropiada de desarrollo. Examinar los embriones en busca de fenotipos en cada concentración de morfo inyectada.

La dosis umbral para cada morfo es la dosis más baja en la que hay un fenotipo fiable definido. Es posible que sean necesarias varias rondas de valoración para definir un umbral inexacto. Buscar una interacción genética entre dos genes distintos.

Prepare una mezcla de dos morfos de interés, cada uno en su respectiva concentración umbral. Es importante tener en cuenta que es posible que los embriones no toleren más de 20 nanogramos de morfo total por inyección. Inyecte los embriones de la misma manera que antes.

Mantener constantes los volúmenes de inyección entre los grupos experimental y de control, que deben incluir conjuntos inyectados con cada morfo solo bajo el microscopio de disección. Controle los embriones inyectados inmediatamente después de la inyección y varias veces a lo largo del día, utilice una pipeta de transferencia para extraer los embriones muertos o moribundos. Dado que estos pueden comprometer la viabilidad de las morfinas restantes con una pipeta de transferencia se mueve, sedado o eutanasia embriones en cualquier momento.

Señale un portaobjetos de depresión para observarlo. Para fotografía. Use pinzas afiladas para quitar el corion si es necesario.

Estabilizar el embrión en una gota de 3%Methyl celulosa cribar embriones para un fenotipo distinto, único en la combinación de morfos en contraposición a una mayor penetrancia del fenotipo de morfinas individuales. Aquí hay varios embriones de tipo salvaje cuando se inyectan con morphos en el umbral. Para gata cinco, el fenotipo típico es cardio bífida o dos corazones, porque los progenitores no lograron fusionarse en la línea media.

Observe los cardiomiocitos GFP positivos indicados por las flechas. El fenotipo de seis morfinas incluye corazones deformes que no se enrollan correctamente. Estos embriones también desarrollan cardiomiocitos GFP positivos.

Sin embargo, los embriones inyectados con una combinación de morfos de gata five y gata six se muestran aquí. Exhiben pérdida total del desarrollo de los cardiomiocitos, lo que indica que se debe expresar gata cinco o gata seis para que los cardiomiocitos se desarrollen. Los dos genes son funcionalmente redundantes para la especificación de cardiomiocitos.

Al intentar este procedimiento, es importante primero validar completamente sus morphos y estar lo más seguro posible de que representan un verdadero derribo de un solo gen objetivo Después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la combinación de alelos nulos condicionales de ratón, para demostrar que funcionan los mismos genes. Lo mismo ocurre en los mamíferos.

Después de ver el video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar si dos genes son funcionalmente redundantes durante la embriogénesis.