Name: Un enfoque de genética inversa para probar la redundancia funcional durante la embriogénesis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Aprende a determinar la redundancia funcional de genes en embriogénesis de Danio rerio mediante knockdown doble con morfolinos. Este método revela interacciones genéticas compensatorias en especificación de linajes celulares.

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Agradecemos a los miembros del laboratorio de Evans por su ayuda en la preparación de esta presentación. Los morfolinos utilizadas aquí fueron validadas originalmente por el Dr. Audrey Holtzinger. TE es apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (HL064282 y HL056182). Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Instituto para la Protección de los Animales y el empleo, de la Weill Cornell Medical College.

<ol><li>Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+zebrafish+model+to+study+GATA+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Using the zebrafish model to study GATA transcription factors.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 69-77 (2009).</li>
<li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata5+and+Gata6+are+functionally+redundant+in+zebrafish+for+specification+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes.</a> Dev Biol. 312, 613-622 (2007).</li>
<li>Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundancy+and+evolution+of+GATA+factor+requirements+in+development+of+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium.</a> Dev Biol. 311, 623-635 (2007).</li>
<li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata4+regulates+the+formation+of+multiple+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gata4 regulates the formation of multiple organs.</a> Development. 132, 4005-4014 (2005).</li>
<li>Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA+factors+in+Drosophila+heart+and+blood+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">GATA factors in Drosophila heart and blood cell development.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).</li>
</ol>

En el experimento descrito aquí, combinamos dos morfolinos, cada uno de los cuales solo generan una gama de fenotipos distintos, y se encontró un fenotipo completamente diferente cuando se co-inyectados juntos. Por supuesto, necesitamos una justificación para hacer este experimento en el primer lugar. La sospecha de que los dos genes podría compensar entre sí por una función anterior, en este caso la especificación cardíaco. Esto se debe a los genes están muy relacionados (y capaces de unirse a secuencias de ADN) y se e...

<table><tbody><tr><td>Tanques reproductores para peces y divisores</td><td>Aquatic Habitats</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Redes para peces</td><td>Aquatic Habitats</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua del sistema</td><td></td><td></td><td>60 mg de Instant Ocean&amp;#8221; por litro de dH2O</td></tr><tr><td>Placas de Petri de 100 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de agujas para micropipetas</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97 Flaming/Brown</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de 3,5&quot;</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla de afeitar</td><td>Personna Medical Care</td><td>94-120-71</td><td></td></tr><tr><td>Micromolienda</td><td>Narishige International</td><td>EG-4</td><td></td></tr><tr><td>Ocular de microscopio con cuadrícula</td><td>Premiere</td><td>MF-02</td><td></td></tr><tr><td>Micrómetro</td><td>WARD&amp;rsquo;s Natural Science</td><td>94 W 9910</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa ultrapura</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>espátula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>Balanza</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Recipientes desechables para pesar</td><td>Fisher Scientific</td><td>2-202-B</td><td></td></tr><tr><td>Microondas convencional</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matraz Erlenmeyer</td><td>Corning</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos para microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552</td><td></td></tr><tr><td>Probeta graduada</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-572-6D</td><td></td></tr><tr><td>Manómetro de pipeta automático</td><td>BrandTech</td><td>2026333</td><td></td></tr><tr><td>Solución de lavado con etanol al 70 %</td><td>Tarr</td><td>801VWR</td><td></td></tr><tr><td>Depósito de N2</td><td>Tech Air</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microinyector</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Micro Instruments</td><td>LTD</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>American National Can</td><td>PM-992</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;gata5&lt;/em&gt; morfolino del sitio de empalme</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Bloqueador de ATG de gata5</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Bloqueador de ATG de la isoforma larga de &lt;em&gt;gata6&lt;/em&gt;</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur desechable</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina metanosulfonato</td><td>Argent Labs</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>Metilcelulosa</td><td>ICN Biomedicals</td><td>155495</td><td></td></tr><tr><td>Bloque calefactor</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-4</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Dumont</td><td></td><td>Tamaño 55</td></tr><tr><td>Portaobjetos con depresión</td><td>VWR international</td><td>48339-009</td><td></td></tr></tbody></table>

un enfoque de genética inversa para probar la redundancia funcional durante la embriogénesis

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Función de los genes durante la embriogénesis se define por los experimentos de pérdida de función, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida (knockout) en el ratón. En el modelo de pez cebra, técnicas efectivas de genética inversa se han desarrollado mediante la microinyección de morfolinos antisentido de genes específicos. Morfolinos objetivo a través de un ARNm específico de apareamiento de bases y la función del gen bloquear transitoriamente por la traducción de inhibir o empalme por varios días durante la embriogénesis (caída). Sin embargo, en los vertebrados, como el ratón o el pez cebra, algunas funciones de los genes puede ser oscurecida por estos métodos debido a la presencia de otro gen que compensa la pérdida. Esto es especialmente cierto para las familias de genes que contienen genes de la hermana que son co-expresados ​​en los mismos tejidos en desarrollo. En el pez cebra, la compensación funcional puede ser probado de una manera relativamente alto rendimiento, por co-inyección de morfolinos que se dirigen a la precipitación de los dos genes simultáneamente. Del mismo modo, con morfolinos, una interacción genética entre dos genes puede ser demostrado por la precipitación de ambos genes en conjunto en los niveles sub-umbral. Por ejemplo, morfolinos pueden ajustarse de manera que ni caída individual genera un fenotipo. Si, bajo estas condiciones, la co-inyección de ambos morfolinos causa un fenotipo, una interacción genética se muestra. Aquí se demuestra cómo mostrar redundancia funcional en el contexto de dos factores relacionados con la transcripción GATA. GATA factores son esenciales para la especificación de los progenitores cardíacos, pero esto sólo se revela por la pérdida de ambos GATA5 y Gata6. Se muestra cómo llevar a cabo experimentos de microinyección, validar los morfolinos, y evaluar el fenotipo compensado cardiogénesis.

Función de los genes puede ser oscurecida en los experimentos de la pérdida de función de si hay una compensación por otro gen. El modelo de pez cebra ofrece un relativamente alto rendimiento medio para revelar la redundancia funcional como en embriones vivos.

Un enfoque de genética inversa para probar la redundancia funcional durante la embriogénesis

La función génica durante la embriogénesis se define habitualmente mediante experimentos de pérdida de función, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida (knockout) en el ratón. En ...

El objetivo general de este procedimiento es determinar si dos genes son funcionalmente redundantes para la especificación de una línea celular definida. Esto se logra primero definiendo el fenotipo de pérdida de función de cada gen individual mediante morfolinos específicos para el gen, inyectados en embriones de pez cebra en desarrollo. El segundo paso del procedimiento consiste en desarrollar un ensayo para cuantificar la especificación o diferenciación de la línea celular.Por ejemplo, utilizando una cepa de pez reportero, como mostraremos aquí. El tercer paso del procedimiento consiste en combinar dos morfo-FENO para dirigirse a la pérdida de función de ambos genes simultáneamente. El paso final del procedimiento es evaluar el fenotipo causado por el doble silenciamiento.Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren pérdida o ganancia de función en células de una linaje específico mediante el examen del reportero de linaje o el análisis de la expresión de marcadores específicos del linaje. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como combinar genes knockout en el modelo de ratón, es que se pueden dirigir dos o incluso tres genes en el modelo de

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un método de genética inversa adaptable para el pez cebra para evaluar la función de genes durante las etapas posteriores del desarrollo y la homeostasis fisiológica, tales como la regeneración de tejidos usando inyecciones intraventriculares de morfolinos de genes específicos.

Invierta genética Enfoque Morpholino Usando ventricular cardíaca inyección para transfectar múltiples tejidos difíciles de conectar por objetivo en el pez cebra Larva

Describimos un sistema de ovocitos y capuchones animales de Xenopus para la clonación de expresión de genes capaces de inducir una respuesta en ectodermo competente, y discutimos técnicas para el análisis posterior de dichos genes. Este sistema es útil en la identificación funcional de una amplia gama de productos génicos.

Clonación funcional utilizando una<em&gt; Xenopus</em&gt; Sistema de Expresión de ovocitos

El objetivo de este protocolo es para describir un deficitaria y ganancia de función que el método es aplicable para identificar neogenin como un receptor de la etapa específica que lleva a trophectoderm y diferenciación masa celular interna de embriones de preimplantación ratón.

Deficitaria y en el enfoque de ganancia de función de investigar la célula destino temprano Determinantes de preimplantación embriones de ratón

Este artículo de vídeo detalla una sencilla metodología vivo que se puede utilizar para caracterizar de manera sistemática y eficiente los componentes de las vías de señalización complejos y las redes de regulación en muchos embriones de invertebrados en.

El poder de la simplicidad: Erizo de mar como embriones<em&gt; En Vivo</em&gt; Modelos de desarrollo para el estudio celular de la célula-a-complejo de señalización de red Interacciones

Presentamos un protocolo de pantalla simple supresor en fisión levaduras. Este método es eficiente, libre de mutágeno y selectivo para las mutaciones que ocurren a menudo en un locus genómico.  El protocolo es conveniente para aislar los supresores que paliar defectos de crecimiento en cultivo líquido que son causados por una mutación o una droga.

Una pantalla de supresor asistida por secuenciación profunda, espontánea en la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe

Hemos desarrollado un nuevo enfoque de pérdida de función que implica la introducción e integración genómica de secuencias artificiales de micro-ARN en embriones de pollo mediante el uso de electroporación in ovo y el sistema de transposones Tol2. Esta técnica proporciona una metodología de eliminación de genes robusta y estable para estudios de la función de los genes durante el desarrollo.

Enfoque de pérdida de función en la retina embrionaria de pollo mediante el uso de la expresión transgénica mediada por transposones Tol2 de microARN artificiales

La prueba de la transición de luz / oscuridad es una de las pruebas más utilizadas para medir la ansiedad-como el comportamiento de los ratones. A continuación, presentamos una película que muestra los procedimientos detallados sobre cómo realizar la prueba.

Luz / oscuridad de transición de prueba para ratones

Este video muestra la nueva cultura, un método por el cual los embriones de pollo se cultivan fuera del huevo hasta por 24 horas. Este método le permite a uno para estudiar el desarrollo temprano (línea primitiva a 14 som.), Un período que corresponde a E7-9 en el ratón. Las aplicaciones de esta técnica incluyen la electroporación, la hibridación in situ e inmunohistoquímica.

Método para la Cultura de primeros embriones del polluelo ex vivo (Nueva Cultura)

Este video muestra a 2 colores montar toda la hibridación in situ, un método por el cual el patrón de expresión espacial y temporal de dos genes diferentes se pueden visualizar en embriones de pollo joven. Este método fue introducido originalmente por David Wilkinson, Henrique Domingos, Ingham Phil y David Ish-Horowicz.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

Inducción neural es el primer paso en la formación del cerebro. Se trata de un mecanismo por el cual el nodo de Hensen (organizador), instruye a los tejidos adyacentes a la adopción de un destino neuronal, es decir, para dar lugar al sistema nervioso. Este video muestra un ensayo de inducción neural en el embrión de pollo.

Ensayo de inducción neural en el embrión de pollo

Aprende a determinar la redundancia funcional de genes en embriogénesis de Danio rerio mediante knockdown doble con morfolinos. Este método revela interacciones genéticas compensatorias en especificación de linajes celulares.

Un enfoque de genética inversa para probar la redundancia funcional durante la embriogénesis

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