Name: Clonación funcional utilizando una Xenopus Sistema de Expresión de ovocitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprende clonación funcional en biología del desarrollo utilizando el sistema de ovocitos y cápsulas animales de Xenopus. Este método permite identificar productos génicos inductores en ectodermo competente.

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Este trabajo fue apoyado por una Beca de Desarrollo Profesional para C.Z.P. de la Fundación Shepherd University. Los autores desean agradecer a Brett Zirkle y Malia Deshotel por sus útiles discusiones sobre los protocolos, y a la Dra. Carol Hurney por su generosa ayuda.

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por la Universidad de Virginia Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión. Nota: La figura 1 muestra una vista general esquemática de los procedimientos experimentales. 1. Preparación de ovocitos <ol><li> X. Pre-prime laevis hembras con 150 U de Mare embarazada suero de gonadotropina (PMSG) aproximadamente una semana antes de que el aislamiento de los ovocitos. Inyectar 1 ml 150 U / ml PMSG en dorsal linfático salida con 1 cc jeringa estéril con 29 G aguja. </li><li> Preparar soluciones para inyección de ovocitos y ensayo casquillo ovocito-animal. <ol><li> Preparar Ca ++ / Mg ++ exento de OR2 (OR2-): NaCl 82 mM, KCl 2,5 mM, 1,5 mM Na 2 HPO 4, 50 mM HEPES pH 7,2. </li><li> Preparar OR2: OR2- más 1 mM CaCl2 y MgCl2 1 mM. </li><li> Preparar OCM: 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / ml BSA, 100 mg / ml de gentamicina, pH 7,8. </li><li> Prepare MBS 1x: NaCl 88 mM, 1 mM de KCl, 0,7 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 5 mM HEPES (pH 7,8), 2,5 mM NaHCO 3. </li><li> Preparar 3% de Ficoll en 1X MBS. </li><li> Preparar NAM 1x: NaCl 110 mM, KCl 2 mM, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, EDTA 0,1 mM, 1 mM NaHCO 3, 2 mM Na 3 PO 4, pH 7,4. </li></ol></li><li> Anestesiar la hembra en una solución al 0,03% de acetato de sal metanosulfonato 3-aminobenzoato (MS222) en 0,1x MBS (primero disolver 0,3 g MS222 en etanol 10 ml de 95%, luego se diluye en 1 litro MBS 0,1x) mediante la colocación de rana en solución para 10-15 minutos o hasta que no responde. <ol><li> Compruebe que la anestesia es completa girando rana anestesiado sobre su espalda para asegurarse de que no responde (incompletamente ranas anestesiados mover las extremidades o girar el cuerpo más). </li></ol></li><li> Quirúrgicamente aislar fragmentos de ovario haciendo una incisión abdominal a través de la piel y la pared del cuerpo con hoja de bisturí, aislando tejido ovárico con pinzasy tijeras. Coloque fragmentos de ovario en OR2-. Cierre la pared del cuerpo con una sutura de seda 3-0 en una aguja curva de 24 mm y cierre la piel por separado con los mismos puntos de sutura. Permitir la recuperación de la hembra en 1 g / l de sal de acuario en el agua. </li><li> Con unas pinzas finas, tejido ovárico lágrima en pequeños (10 - 20 ovocitos) piezas y traslado al OR2- fresco. </li><li> Fragmentos de ovario Defolliculate en 2,0 mg / ml de colagenasa A en OR2- agitando suavemente en un agitador durante 1 hora, la transferencia a colagenasa fresco y agitar durante una hora adicional. </li><li> Lavar ovocitos 10 veces en OR2 [que contienen Ca ++ / Mg ++], descartando ovocitos pequeños. </li><li> Lave ovocitos en OCM dos veces y traslado al fresco OCM. Aislar ovocitos Etapa VI por tamaño después de una inspección visual y desechar ovocitos inmaduros (más pequeñas): Etapa VI ovocitos son más grandes que los ovocitos inmaduros con pigmentación incluso en el hemisferio animales y son de aproximadamente 1,2-1,4 mm de diámetro. </li><li> Mantener ovocitos a 18-20 ° C in OCM antes de la inyección. Nota: placas de Petri recubiertas de agarosa se pueden utilizar para minimizar la adherencia de los ovocitos a plato. </li></ol> 2. La inyección de transcripciones Library <ol><li> Preparar una biblioteca de cDNA direccional 15 usando ARN extraído en una etapa apropiada de desarrollo (por ejemplo, la etapa placa neural 14 10). Compra una biblioteca de ADNc o construir uno usando un kit comercial por la visión general en los cuatro pasos siguientes. <ol><li> Aislar aproximadamente 5 g de ARNm mediante el uso de un producto para enriquecer en poli (A) + RNA (Ver Tabla de Materiales) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Nota: Las transcripciones que se utilizarán para producir la biblioteca de cDNA puede ser restringido a un tejido induciendo (tal como la placa neural, después de microdisección del tejido deseado), o pueden ser a partir de embriones enteros en una etapa particular. </li><li> Producir ADNc con un kit comercial, siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Ligar aproximadamente 20 ng de ADNc en un vector incluido con el kit comercial u otro vector adecuado. Un vector de plásmido apropiado incluye secuencias para la estabilidad del ARNm tales como 5 &#39;β-globina y 3 de poli (A) secuencias (pCS2 +, pTnT, pCS105). </li><li> Transformar ligación en células bacterianas competentes utilizando el protocolo recomendado por proveedor para la transformación de choque térmico. Nota: Alternativamente, una colección de (ORFeome) clones marco de lectura abierto está comercialmente disponible y puede ser usado para generar las transcripciones de inyección. </li></ol></li><li> Preparar 10 piscinas de plásmidos de desde 3 10 hasta abril 10 complejidad (desde abril 10 hasta 05 10 complejidad total). Esto representa 10 placas con 1.000 - 10.000 colonias cada una. <ol><li> Biblioteca placa de cultivo en 10 placas de 15 cm LB-ampicilina, crecer 12 - 18 horas a 37 ° C, y recoger colonias de cada por una suave presión con un esparcidor de vidrio en 7 ml LB. </li><li> Preparar un stock de glicerol a partir de 0,5 ml (añadir a 0,2 ml de glicerol estéril y se almacena a -20 y# 730; C), y el uso de los restantes 6,5 ml para preparar ADN con un estándar comercialmente disponible kit de ADN miniprep siguiendo las instrucciones del fabricante. </li></ol></li><li> Linealizar el ADN plásmido agrupada (1.0 - 2.0 g) con enzima de restricción apropiada digerir 16 a 37 C durante 1 - 1,5 h. Aislar el DNA linealizado con extracción con fenol / cloroformo seguido de precipitación con etanol y resuspensión en agua por las especificaciones del kit RNA polimerasa utilizada. Sintetizar ARN sentido con un kit de ARN polimerasa comercial siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Preparar agujas de microinyección (utilizando un extractor de aguja con un tubo capilar de vidrio) de aproximadamente 20 m de diámetro; medir puntas de aguja en un microscopio compuesto con un micrómetro ocular calibrado. Nota: La configuración del extractor de agujas deben determinarse empíricamente para producir una aguja con una punta fina de tal manera que cuando se rompen con unas pinzas finas produce el tamaño de la punta deseada. </li><li> Prepárese (empujar arcilla encapa uniforme sobre el fondo del plato) arcilla forrada 35 x 10 mm placas de Petri con ranuras paralelas para mantener ovocitos en su lugar durante la microinyección; producir ranuras con una sonda centro comercial o pipeta Pasteur fundido en la punta de la llama. Como una alternativa a la arcilla, preparar platos de agarosa haciendo muescas con un molde de elastómero 17. Ovocitos Transferir con una pipeta de gran calibre a un 3% de Ficoll en 1X MBS (aproximadamente 2 ml) en las filas de los platos de barro forradas. </li><li> Usando microinyector, llenar la aguja con 1 ng / nl ARN y ajustar el balance para producir ligera presión positiva (para evitar la elaboración de citoplasma del ovocito). </li><li> Inyectar ovocitos con aproximadamente 20 nl ARN en la región ecuatorial. Permitir 1 h para los ovocitos inyectados a permanecer en Ficoll-MBS, a continuación, transferir suavemente para 1x MBS. Incubar durante 8-24 horas a 20 ° C antes del ensayo casquillo animal. </li></ol> 3. Cap Ensayo Animal <ol><li> Preparar 3 / 4x NAM y obtener unas pinzas finas, bucle de cabello, fragmentos cubreobjetos curvas, dis barro forradashes con hendiduras en forma de copa para mantener ovocitos. Haga fragmentos cubreobjetos curvas rompiendo aparte cubreobjetos de vidrio en fragmentos pequeños (aproximadamente 1 - 2 mm x 2-4 mm) y que pasa por la llama hasta que los bordes pulir y caerse, produciendo una pieza curva. </li><li> Fertilizar X. laevis huevos 18 a través in vitro o el apareamiento natural y la cultura a la gástrula etapas (10 - 11 horas después de la fertilización a RT) en 0,1x MBS antes de la clasificación por etapas; recoger mediados de gástrula (etapa 11 - 11,5) 10 embriones. </li><li> Embriones de transferencia a una placa de Petri, aproximadamente la mitad con 3 / 4x NAM. El uso de dos pares de pinzas finas, retire la fertilización (vitelina) membrana desde gastrulae. </li><li> Transferencia de ovocitos a 3 / 4x NAM (aproximadamente 2 ml) en platos de barro forradas e inmovilizar en impresiones individuales en la arcilla, que produce impresiones para dar cabida a los embriones individuales como ranuras fueron descritos anteriormente. </li><li> Embriones de traslado hasta los platos de barro forradas y cortar las tapas animales de gastrulae usando dos pares de pinzas finas. Tenga cuidado de aislar casquillo ectodermo animales y no tejido ecuatorial 18. </li><li> Colocar un casquillo animal en el hemisferio animales de cada ovocito con la superficie interior de la tapa de los animales en contacto con el ovocito. Mantenga recombinantes juntos mediante la aplicación de fragmento de cubreobjetos de vidrio curvada y aplicando presión hacia abajo al vidrio, aplanando el ectodermo como los contactos cubreobjetos la arcilla (CAPS animal puede permanecer abierta con la capa interior expuesta a la superficie del ovocito para 6 - 8 horas o más largo ). Nota: Como alternativa, coloque la tapa del animal en una hendidura de la arcilla con su superficie interna orientada hacia arriba y coloque un ovocito en la tapa; asegurar el recombinante con pequeñas extensiones de arcilla. </li><li> Cultura a 20 ° C hasta el control de los embriones llegan a la etapa deseada para el ensayo. </li><li> Recombinante separada mediante la eliminación de cubreobjetos / arcilla y aislar ectodermo con unas pinzas y un bucle de pelo. </li><li> Fijar fragmentos ectodérmicas durante 1 hora en MEMFA (3,8%formaldehído en MEM [0.1 M MOPS pH 7.4, 2 mM EGTA, 1 mM MgSO y 4]). </li><li> Fragmentos de transferencia (y embriones de control) de MEMFA en etanol y se almacena a -20 ° C. </li></ol> 4. Análisis de la Respuesta en ectodermo por hibridación in situ (ISH) <ol><li> Preparar soluciones para ISH. <ol><li> Preparar 1x PBS: 0,01 M tampón fosfato salino, NaCl 0,138 M, pH 7,4 </li><li> Preparar PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0,1% de Tween-20 </li><li> Preparar la solución de 100x Denhart: 2% de BSA, 2% de polivinilpirrolidona, 2% de Ficoll </li><li> Preparar Tampón de Hibridación: 50% formamida, 5x SSC, 1 mg / ml de ARN de levadura torula, 1 mg / ml de heparina, solución de Denhart 1x, 0,1% de Tween-20, 0,1% de CHAPS, EDTA 10 mM, DEPC-H 2 O </li><li> Preparar maleico Acid Buffer (MAB): ácido maleico 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 </li><li> Preparar MAB + bloque: MAB, 2% reactivo de bloqueo (calor a 60 ° C para disolver) </li><li> Preparar fosfatasa alcalina (AP) Tampón: Tris 100 mMpH 9,5, 50 mM de MgCl 2, NaCl 100 mM, 0,1% de Tween, dH 2 O </li></ol></li><li> Prepare la sonda de ARN. <ol><li> El uso de un kit RNA polimerasa comercial y DIG-NTP mezcla, añadir a un tubo de 1,5 ml (50 l de reacción): 25,5 l DEPC-H 2 O, 10 l 5X Transcription Buffer, 2,5 l de mezcla 10x dig-NTP, 5 l 100 mM TDT, 2 l ARNsin, 2 l plantilla de ADN linealizado (~ 1 g / l), 3 l ARN polimerasa e incubar 37 ° C durante 90 minutos. </li><li> Añadir 2 l ARN polimerasa e incubar 37 ° C durante 60 minutos. </li><li> Compruebe 2 l de reacción en un 1% en gel de agarosa. </li><li> Añadir 1 l RQ1 RNasa libre de DNasa e incubar 37 ° C durante 20 minutos. </li><li> Precipitar la sonda mediante la adición de 50 l DEPC-H 2 O, 25 l 10 M acetato de amonio y 313 l de etanol. Almacenar a -20 C durante la noche (O / N) a continuación, recuperar el ARN por centrifugación a 13.800 xg durante 20 min. Lavar con 500 l 75% de etanol, girar brevemente, retireetanol y permitir pellet se seque al aire. Añadir 50 l DEPC-H 2 O. </li><li> Añadir Tampón de Hibridación a una concentración final de ~ 0,5 g / l. </li></ol></li><li> Preparar de tejidos para la hibridación. A menos que se indique lo contrario, llenar viales a la cima con cada cambio de solución descritos (aproximadamente 4 ml). <ol><li> Retire etanol a partir de viales y embriones de transferencia en 75% de etanol / PTW, entonces 50% de etanol / PTW durante 10 minutos cada uno, en posición horizontal sobre rockero. </li><li> Lavar tres veces en PTW durante 5 minutos cada uno en eje de balancín. </li><li> Transferencia a 10 mg / l tratamiento de proteinasa K en PTW; tubos de roca vertical 15 min. </li><li> Enjuague dos veces 10 minutos cada uno en 0,1 M trietanolamina pH 7.8 - tubos de roca vertical. </li><li> Añadir 12,5 l anhídrido acético para tubos y el rock verticalmente 5 min. Repita el procedimiento con anhídrido acético 12,5 l adicional durante 5 min. </li><li> Lave en PTW 5 min verticalmente en eje de balancín. </li><li> REFIX en 4% de paraformaldehído 20 min en eje de balancín. Heat Tampón de Hibridacióna 60 ° C. </li><li> Lavar tres veces en PTW durante 5 minutos cada uno en eje de balancín. </li><li> Retire todos pero ~ 1 ml de PTW de cada tubo y añadir 250 l Hyb Buffer; agitar suavemente los tubos para mezclar. Tubos de roca vertical 5 min. </li><li> Reemplazar con 60 ˚C Hyb Buffer (0,5 ml) y agitar suavemente a 60 ° C 10 min. Reemplazar con frescos Hyb Buffer y agitar a 60 ° C de dos a 4 horas. </li><li> Sonda de calor (1 ml a 0,5 mg / l en Hyb Buffer) a 60 ° C (3 min). Retire Hyb Buffer y añadir sonda para tubos. Agitar suavemente O / N a 60 ° C. </li></ol></li><li> Preparar tejidos para anticuerpos. <ol><li> Cálido Hyb Buffer y 2x SSC + 0,1% de Tween-20 soluciones a 60 ° C. </li><li> Reemplace solución sonda con Hyb Buffer (salvo sondas a -20 ° C durante 2 - 3 veces reutilización). Lavar a 60 ° C durante 10 minutos. </li><li> Lavar tres veces a 60ºC en 2x SSC-Tween (20 minutos cada uno con agitación). </li><li> Lavar tres veces a 60 ° C en 0,2x SSC-Tween (20 minutos cada uno con agitación). </li><li> Lavar dos veces en MAB (RT) durante 15 min cada uno horizontalmente en eje de balancín. </li><li> Añadir 1 ml MAB + bloque. Lávese las 2 horas verticalmente en eje de balancín. </li><li> Traslado a 1 ml MAB + bloque que contiene un anti-digoxigenina-AP 1/2000. Roca verticalmente en 4 CO / N. </li></ol></li><li> Preparar Tejidos para Color reactivo. <ol><li> Reemplace la solución de anticuerpo con MAB; lavar tres veces en el MAB 5 minutos cada uno horizontalmente en eje de balancín. </li><li> Lavar tres veces en el MAB de 1 hora cada uno horizontal en eje de balancín. </li><li> Lavar dos veces en AP Buffer 10 minutos cada uno en posición horizontal sobre rockero. </li><li> Traslado tejido para pozos múltiples bandeja de plástico, retire AP Buffer y añadir BM reactivo Púrpura (~ 1 ml). Permita reacción tenga lugar en la oscuridad 5 min de O / N. </li><li> Cuando se logra tinción apropiada, traslado de tejidos a viales de PTW. Lavar dos veces 10 minutos en cada una PTW en eje de balancín. </li><li> Fijar en solución de Bouin en 4 CO / N en eje de balancín. </li><li> Lave Bouin con tres 70% de etanol / 30% PTW lavados a TA. Proceda to captura de imagen usando epi-iluminación y una cámara montada en el microscopio, el blanqueado, si es necesario 18. </li></ol></li></ol> 5. Selección Sib y clonación <ol><li> Seleccione la piscina con la mayor actividad (mayor respuesta en el tejido ectodérmico). </li><li> Valorar (diluir con LB a la densidad apropiada) el stock de glicerol de la piscina con la mayor actividad y la placa a cabo diez nuevas placas con aproximadamente una décima parte de las colonias de la etapa previa (usando la sección 2 en el protocolo anterior). </li><li> Reducir el tamaño de la piscina hasta que la actividad se remonta a una sola colonia. </li><li> Obtener secuencia de ADN usando cebadores estándar en el vector. </li></ol>

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<li>Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+large+set+of+full-length+clones+from+a+Xenopus+tropicalis+EST+project%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project.</a> Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).</li>
<li>Karpinka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%2C+the+Xenopus.+model+organism+database%3B+new+virtualized+system%2C+data+types+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).</li>
<li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+Genome-Wide+In+Vivo+Screen+Identifies+New+Regulators+of+Signaling+Pathways+during+Early+Xenopus+Embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis.</a> PLoS ONE. , e79469(2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El método descrito aquí para la clonación funcional de genes capaces de inducir una respuesta en ectodermo competente puede ser usado para identificar una amplia gama de productos génicos. Este método se expande al trabajo anterior mediante la combinación de los ensayos de inducción de tejido con técnicas de clonación de expresión. Utilizamos las vías metabólicas de Xenopus el ovocito como una fuente de producción de factores de inducción de, directa o indirectamente, después de la inyección de ARN. Esto, en co...

Los enfoques genéticos avanzados para identificar genes de interés a través de su función o pérdida de función1,2 son una parte integral de la comprensión de eventos de patrones complejos en el desarrollo. Junto con las poderosas técnicas de genética inversa disponibles para una gama cada vez más amplia de sistemas e investigadores3-5, ahora es posible identificar genes con un papel funcional clave en una vía y luego dilucidar esa función a nivel celular y en interacción con otros productos génicos. Un enfoque para la identificación funcional de genes de interés que ha producido muchos hallazgos clave en el pasado es la clonación de expresión6,7.
Nuestro reciente objetivo8 fue identificar los factores inductivos tempranos del cristalino, ya que se ha demostrado que los pasos iniciales en el proceso inductivo del cristalino de los vertebrados ocurren ya en las etapas de la gástrula. Con ese fin, utilizamos el ectodermode 9 sombreros animales transitoriamente competente para el cristalino (estadio 11-11,510) de embriones de Xenopus como tejido que responde a la inducción, y el ovocito de Xenopus en estadio VI como fuente de producción de los factores inductores.
El siguiente protocolo se basa en los protocolos de clonación de expresiones y selección de hermanos de Smith y Harland6,7, también utilizados con éxito por otros11-13. En nuestro sistema de expresión de ovocitos (utilizado por primera vez para la producción de factores inductores por Lustig y Kirschner14), se seleccionan e identifican grupos de transcripciones inyectadas capaces de hacer que los ovocitos produzcan directa o indirectamente factores que provoquen una respuesta inductiva del cristalino en el ectodermo del sombrero animal. Dado que el sistema es útil para expresar directamente las moléculas inductoras secretadas (el ARNm de INHBB inyectado en ovocitos causa la inducción del mesodermo en el ectodermo8 del sombrero animal competente para el mesodermo), originalmente esperábamos que el procedimiento de cribado fuera útil principalmente para la identificación de factores paracrinos. Sin embargo, dado que identificamos un factor nuclear en nuestro cribado (ldb18), está claro que el sistema puede utilizarse para identificar una amplia variedad de moléculas, como factores reguladores transcripcionales o traduccionales, miRNAs, cofactores o factores de yuxtacrina.

<table><tbody><tr><td>12/101</td> Estudios de desarrollo de anticuerpos <td>Banco de hibridomas</td><td>12/101</td><td>Anticuerpo monoclonal para la detección de tejido muscular</td></tr><tr><td>20x SSC Buffer</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>Anhídrido acético</td><td>Sigma</td><td>A6404</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>Anti-Dig-AP</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>Aurum Plasmid Mini Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6400</td><td>Purificación de ADN plasmídico</td></tr><tr><td>Reactivo de bloqueo</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>BM Purple</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>Boekel Horno de hibridación</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-245-121</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>Bouin's Solution</td><td>Sigma</td><td>HT10132</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td>para OCM</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma</td><td>C3023</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>Colagenasa A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>Desfoliculación de ovocitos</td></tr><tr><td>Cisteína</td><td>Sigma</td><td>C121800</td><td>Embriones de Dejelly</td></tr><tr><td>DEPC-H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP5611</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>Mezcla de marcaje de ARN Dig Roche</td><td></td><td>11277073910</td><td>para sondas ISH</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td>para envoltura Vitelline </td></tr><tr><td>3-aminobenzoato de etilo</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>MS222 anestésico</td></tr><tr><td>Ficoll PM 400</td><td>Sigma</td><td>F4375</td><td>para medios de inyección</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G1914</td><td>para OCM</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio</td><td>World Precision Instruments</td><td>4878</td><td>3,5" de largo, I,D, 0,530 mm</td></tr><tr><td>Viales de muestra de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-408B</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>Hair loop</td><td></td><td></td><td>Pelo adherido en pipeta Pasteur para la manipulación de tejidos</td></tr><tr><td>Sal sódica de heparina</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td>para inyector ISH</td></tr><tr><td>Nanoliter 2010</td><td>World Precision Instruments</td><td>Nanoliter 2010</td><td>Microinyector controlado por microprocesador</td></tr><tr><td>Instant Ocean</td><td>Carolina</td><td>972433</td><td>Aquarium Sal para la recuperación de ranas</td></tr><tr><td>IRBG XGC Xenopus verificado de longitud completa cam cDNA</td><td>Source Bioscience</td><td>989_IRBG</td><td>cDNA library&nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de agar LB con 100 &micro; g/ml Ampicilina</td><td>Teknova</td><td>L5004</td><td>Placas LB-Amp prevertidas de 150 mm para la selección de hermanos</td></tr><tr><td>LB Luria Caldo</td><td>Teknova</td><td>L8650</td><td>LB para la recolección de colonias en la selección de hermanos a partir de placas y dilución de cultivos Kit de aislamiento magnético</td></tr> de <tr><td>ARNm</td><td>New England BioLabs</td><td>S1550S</td><td>para el aislamiento de ácido maleico de ARN enriquecido con poli(A)</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>Micromanipulador manual Microfil</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3310R</td><td>Micromanipulador manual</td></tr><tr><td>Mezclador nutante</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-152</td><td>Balancín para ISH</td></tr><tr><td>Permoplast</td><td>Nasco SB33495M</td><td></td><td>Arcilla para placas de inyección y disección</td></tr><tr><td>Salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td>para estimular el desarrollo de los ovocitos</td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona</td><td>Sigma</td><td>PVP40</td><td>para</td></tr><tr><td>ISH Extractor programable</td><td>World Precision Instruments</td><td>PUL-1000</td><td>Extractor de agujas de micropipeta</td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Sigma</td><td>P6556</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>pTnT Vector</td><td>Promega</td><td>L5610</td><td>Construcción de la biblioteca de ADNc</td></tr><tr><td>Sistema de combinación Riboprobe</td><td>Promega</td><td>P1450</td><td>in vitro transcripción</td></tr><tr><td>Superíndice Kit de construcción de bibliotecas de ADNc de longitud completa</td><td>Kit</td> de <td>18248013</td><td>Life Technologies para la construcción de bibliotecas de ADNc</td></tr><tr><td>Suturas, seda 3-0</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-037-516</td><td>Hilo y aguja de sutura para la extracción post-ovocito</td></tr><tr><td>Torula RNA</td><td>Sigma</td><td>R3629</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>Trietanolamina</td><td>Sigma</td><td>T1502</td><td>para ISH</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>para</td></tr><tr><td>el sistema de síntesis de ADNc RiboClone universal</td><td>ISH Promega</td><td>C4360</td><td>kit alternativo para la construcción de bibliotecas de ADNc</td></tr><tr><td>Clones de entrada ORF completos de Xenopus - ORProfuente de colaboración</td><td>Bioscience</td><td>5055_XenORFeome</td><td>ORFeome clones</td></tr><tr><td>XL2-Blue Células ultracompetentes</td><td>Agilent Technologies</td><td>200150</td><td>células para la transformación de ADNc biblioteca</td></tr></tbody></table>

clonación funcional utilizando una<em&gt; xenopus</em&gt; sistema de expresión de ovocitos

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

La identificación de genes responsables de la inducción embrionaria plantea una serie de desafíos; por nombrar algunos, las moléculas secretadas de interés pueden ser bajas en abundancia, pueden no ser secretadas sino estar atadas a la(s) célula(s) señalizadora(s), o pueden requerir la presencia de socios de unión o moléculas reguladoras aguas arriba. Por lo tanto, en la búsqueda de productos genéticos capaces de provocar una respuesta inductiva temprana del cristalino en un ectodermo competente, utilizamos un sistema de clonación de expresión que permitiría la identificación de factores paracrinos o yuxtacrinos, así como proteínas transcripcionales u otras proteínas reguladoras. Se inyectaron grupos de ARNm en los ovocitos de Xenopus y el tejido que respondió se colocó directamente sobre los ovocitos y se realizó un cocultivo. Después de la clonación funcional de ldb1 a partir de una biblioteca de ADNc en etapa de placa neural basada en su capacidad para provocar la expresión del marcador de placa del lente temprano foxe3 en el ectodermo de la tapa animal competente para el lente, caracterizamos el patrón de expresión del ARNm y analizamos la progresión del desarrollo después de la sobreexpresión o el derribo de ldb1. Este sistema es adecuado en una amplia variedad de contextos en los que se busca la identificación de un inductor o sus moléculas reguladoras aguas arriba utilizando una respuesta funcional en tejido competente.

En respuesta a la expresión del ARNm inyectado en oocitos, respondiendo tejido casquillo animal se sometió a ensayo para la expresión de Otx2 mediante hibridación in situ (Figura 2 y Tabla 1); Otx2 se expresa en el ectodermo lente presuntiva (PLE) a partir de cierre del tubo neural a través de placoda del cristalino engrosamiento 19. Sin embargo, desde Otx2 se expresa también en el ectodermo neural anterior, así como la cabe...

Describimos un sistema de ovocitos y capuchones animales de Xenopus para la clonación de expresión de genes capaces de inducir una respuesta en ectodermo competente, y discutimos técnicas para el análisis posterior de dichos genes. Este sistema es útil en la identificación funcional de una amplia gama de productos génicos.

Clonación funcional utilizando una<em&gt; Xenopus</em&gt; Sistema de Expresión de ovocitos

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un sistema de ovocito de Xenopus y de casquete animal, adecuado para la identificación de productos génicos capaces de inducir una respuesta en ectodermo competente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como qué genes son necesarios para provocar una respuesta inductiva. La principal ventaja de esta técnica es su uso del ovocito de Xenopus como sistema de expresión, para producir e identificar inductores que actúan sobre un tejido diana, o incluso genes que actúan aguas arriba de los inductores.La demostración visual de este método es extremadamente útil, ya que los pasos de disección y recombinación dependen en gran medida de la etapa y requieren una técnica refinada. Después de recolectar el tejido ovárico de ranas hembra anestesiadas, desgarre el tejido en fragmentos pequeños, cada uno conteniendo aproximadamente de 10 a 20 ovocitos. Luego transfiera estos fragmentos primero a solución OR2 fresca y después a OR2 que contiene 2,0 miligramos por mililitro de colagenasa A. Continúe agitando suavemente la mezcla que contiene el tejido en un agitador durante una hora.Luego, transfiera los fragmentos a una solución fresca de colagenasa y agite durante una hora adicional. Espere observar ovocitos desagregados al final de este tratamiento. A continuación, lave los ovocitos 10 veces en OR2 completo y luego dos veces en medio de cultivo de ovocitos, abreviado como OCM.A continuación, coloque los ovocitos en OCM fresco e inspéccionelos visualmente bajo un microscopio de disección. Aísle los ovocitos en la etapa seis descartando los ovocitos más pequeños e inmaduros. Luego, coloque los ovocitos en una placa de Petri recubierta con agarosa que contenga OCM y manténgalos a una temperatura de 18 a 20 grados Celsius hasta la inyección.Para prepararse para la microinyección, coloque el tubo capilar de vidrio en un extractor de agujas, extráigalo y luego rompa las puntas del vidrio para generar agujas de aproximadamente 20 micrómetros de diámetro. En un microscopio compuesto, mida las puntas de las agujas con un micrómetro ocular calibrado. A continuación, presione arcilla para formar una capa uniforme en el fondo de una placa de Petri de 35 por 10 milímetros.Luego, cree surcos paralelos en esta capa, utilizando una herramienta similar a una sonda fina. Llene el recipiente revestido de arcilla con aproximadamente 2 mililitros de Ficoll al 3% en solución salina de Barth modificada 1x, o MBS. A continuación, transfiera los ovocitos a este medio, utilizando una pipeta de gran orificio.Coloque los ovocitos en las ranuras para que queden sujetos durante la microinyección subsiguiente. Utilizando un microinyector, llene una aguja con aproximadamente dos microlitros de un pool previamente generado de ARNm y ajuste el equilibrio para generar una ligera presión positiva, lo que evitará que el citoplasma del ovocito sea aspirado hacia la aguja durante la inyección. Luego, inyecte 20 nanolitros de ARN en la región ecuatorial de cada ovocito.Posteriormente, deje los ovocitos en el MBS con Ficoll durante una hora y luego transfiéralos suavemente al MBS 1x. Incube los ovocitos durante ocho a 24 horas a 20 grados Celsius. Para comenzar el ensayo de casquete animal, reúna la solución de medio anfibio normal al 3/4, abreviada como solución NAM, pinzas finas, un bucle de cabello, ovocitos previamente inyectados y embriones de Xenopus en la etapa 11 a 11,5.Luego, rompa las laminillas de vidrio en fragmentos de aproximadamente un milímetro por dos milímetros de tamaño, y pase estas piezas por una llama hasta que sus bordes se pulan y redondeen. A continuación, presione arcilla para formar una capa única en un recipiente, como se describió anteriormente. Y utilice una sonda fina para crear impresiones individuales con forma de copa en este recubrimiento.Proceda a llenar el recipiente con aproximadamente dos mililitros de NAM al 3/4x. Y a este, transfiera los ovocitos inyectados, colocando varios de modo que cada uno quede inmovilizado en una depresión individual. Para preparar los embriones, transfiéralos a un recipiente que contenga solución de NAM al 3/4x.Seleccione un subconjunto de gástrulas que se utilizarán como controles de estadio para determinar la edad del ectodermo y transfiéralos a otro recipiente que contenga la misma solución. Luego aparte esta placa. Para los embriones que se utilizarán en el ensayo de casquete animal, retire sus membranas vitelinas con dos pares de pinzas finas.A continuación, transfiera la gástrula al recipiente revestido de arcilla junto con los ovocitos. Para comenzar, corte los casquetes animales de los embriones utilizando dos pares de pinzas finas, teniendo cuidado de evitar el tejido ecuatorial. Para generar recombinantes mediante el primer método, coloque un casquete animal de manera que su superficie interna haga contacto con el hemisferio animal de un ovocito, previamente colocado en una depresión.Y repita este proceso con varios de los ovocitos inyectados. Para asegurar que estos recombinantes permanezcan unidos, coloque un fragmento curvado de cubreobjetivo de vidrio encima de cada uno de ellos y aplique presión hacia abajo hasta que el animal quede aplanado y el cubreobjetivo entre en contacto con la arcilla. Para generar recombinantes mediante el segundo método, coloque las tapas animales y los ovocitos juntos en indentaciones individuales vacías en la arcilla.Asegúrese de que las superficies internas de los casquetes animales estén orientadas hacia el ovocito. Luego, fije los dos tejidos juntos utilizando pequeñas extensiones de arcilla. Una vez que se hayan generado varios recombinantes mediante cualquiera de los métodos, cultive estos y los embriones control reservados a 20 grados celsius.Cuando los embriones control alcancen la etapa deseada, retire las cubreobjetos de los embriones recombinantes y aísle el ectodermo del casquete animal utilizando pinzas y un lazo de cabello. A continuación, fije tanto los fragmentos ectodérmicos como los embriones control en MEMFA durante una hora. Luego transfiera los tejidos a etanol y almacénelos a menos 20 grados centígrados.Aquí, se inyectaron grupos de ovocitos con mezclas de ARNm correspondientes a números progresivamente menores de clones o colonias, y luego se cultivaron con casquetes animales. Posteriormente, se determinó el número de casquetes animales en cada grupo que expresaban foxe3, un marcador normalmente observado en el ectodermo de lente presumido desde las etapas de placa neural temprana hasta la formación de la vesícula, y utilizado aquí para evaluar la capacidad inductora de la lente. Este método identificó al gen que codifica al factor nuclear ldb1, el cual puede producir una respuesta inductora de lente en 50 de 179, o el 28 %, de los casquetes animales evaluados.Se muestran aquí imágenes de hibridación in situ que representan la señal de foxe3, indicada mediante cabezas de flecha, en casquetes animales cultivados con ovocitos inyectados con ldb1 desde aproximadamente la etapa 11 hasta la etapa 23. No se observa expresión de foxe3 en los casquetes animales control correspondientes colocados sobre ovocitos no inyectados. Cuando se realizaron secciones a partir de estos casquetes animales, se observó expresión de foxe3 tanto en las capas ectodérmicas interna como externa.La expresión en la capa interna es característica de una respuesta del cristalino. O, cuando se señala en ambas capas, indica otras estructuras como la placa olfativa. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar métodos como inmunohistoquímica, hibridación in situ o detección directa de un gen reportero fluorescente, con el fin de evaluar una respuesta inductiva en el ectodermo del casquete animal.

functional-cloning-using-a-xenopus-oocyte-expression-system

Research

Investigación

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