Clonación funcional utilizando una

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un sistema de ovocito de Xenopus y de casquete animal, adecuado para la identificación de productos génicos capaces de inducir una respuesta en ectodermo competente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como qué genes son necesarios para provocar una respuesta inductiva. La principal ventaja de esta técnica es su uso del ovocito de Xenopus como sistema de expresión, para producir e identificar inductores que actúan sobre un tejido diana, o incluso genes que actúan aguas arriba de los inductores.

La demostración visual de este método es extremadamente útil, ya que los pasos de disección y recombinación dependen en gran medida de la etapa y requieren una técnica refinada. Después de recolectar el tejido ovárico de ranas hembra anestesiadas, desgarre el tejido en fragmentos pequeños, cada uno conteniendo aproximadamente de 10 a 20 ovocitos. Luego transfiera estos fragmentos primero a solución OR2 fresca y después a OR2 que contiene 2,0 miligramos por mililitro de colagenasa A. Continúe agitando suavemente la mezcla que contiene el tejido en un agitador durante una hora.

Luego, transfiera los fragmentos a una solución fresca de colagenasa y agite durante una hora adicional. Espere observar ovocitos desagregados al final de este tratamiento. A continuación, lave los ovocitos 10 veces en OR2 completo y luego dos veces en medio de cultivo de ovocitos, abreviado como OCM.

A continuación, coloque los ovocitos en OCM fresco e inspéccionelos visualmente bajo un microscopio de disección. Aísle los ovocitos en la etapa seis descartando los ovocitos más pequeños e inmaduros. Luego, coloque los ovocitos en una placa de Petri recubierta con agarosa que contenga OCM y manténgalos a una temperatura de 18 a 20 grados Celsius hasta la inyección.

Para prepararse para la microinyección, coloque el tubo capilar de vidrio en un extractor de agujas, extráigalo y luego rompa las puntas del vidrio para generar agujas de aproximadamente 20 micrómetros de diámetro. En un microscopio compuesto, mida las puntas de las agujas con un micrómetro ocular calibrado. A continuación, presione arcilla para formar una capa uniforme en el fondo de una placa de Petri de 35 por 10 milímetros.

Luego, cree surcos paralelos en esta capa, utilizando una herramienta similar a una sonda fina. Llene el recipiente revestido de arcilla con aproximadamente 2 mililitros de Ficoll al 3% en solución salina de Barth modificada 1x, o MBS. A continuación, transfiera los ovocitos a este medio, utilizando una pipeta de gran orificio.

Coloque los ovocitos en las ranuras para que queden sujetos durante la microinyección subsiguiente. Utilizando un microinyector, llene una aguja con aproximadamente dos microlitros de un pool previamente generado de ARNm y ajuste el equilibrio para generar una ligera presión positiva, lo que evitará que el citoplasma del ovocito sea aspirado hacia la aguja durante la inyección. Luego, inyecte 20 nanolitros de ARN en la región ecuatorial de cada ovocito.

Posteriormente, deje los ovocitos en el MBS con Ficoll durante una hora y luego transfiéralos suavemente al MBS 1x. Incube los ovocitos durante ocho a 24 horas a 20 grados Celsius. Para comenzar el ensayo de casquete animal, reúna la solución de medio anfibio normal al 3/4, abreviada como solución NAM, pinzas finas, un bucle de cabello, ovocitos previamente inyectados y embriones de Xenopus en la etapa 11 a 11,5.

Luego, rompa las laminillas de vidrio en fragmentos de aproximadamente un milímetro por dos milímetros de tamaño, y pase estas piezas por una llama hasta que sus bordes se pulan y redondeen. A continuación, presione arcilla para formar una capa única en un recipiente, como se describió anteriormente. Y utilice una sonda fina para crear impresiones individuales con forma de copa en este recubrimiento.

Proceda a llenar el recipiente con aproximadamente dos mililitros de NAM al 3/4x. Y a este, transfiera los ovocitos inyectados, colocando varios de modo que cada uno quede inmovilizado en una depresión individual. Para preparar los embriones, transfiéralos a un recipiente que contenga solución de NAM al 3/4x.

Seleccione un subconjunto de gástrulas que se utilizarán como controles de estadio para determinar la edad del ectodermo y transfiéralos a otro recipiente que contenga la misma solución. Luego aparte esta placa. Para los embriones que se utilizarán en el ensayo de casquete animal, retire sus membranas vitelinas con dos pares de pinzas finas.

A continuación, transfiera la gástrula al recipiente revestido de arcilla junto con los ovocitos. Para comenzar, corte los casquetes animales de los embriones utilizando dos pares de pinzas finas, teniendo cuidado de evitar el tejido ecuatorial. Para generar recombinantes mediante el primer método, coloque un casquete animal de manera que su superficie interna haga contacto con el hemisferio animal de un ovocito, previamente colocado en una depresión.

Y repita este proceso con varios de los ovocitos inyectados. Para asegurar que estos recombinantes permanezcan unidos, coloque un fragmento curvado de cubreobjetivo de vidrio encima de cada uno de ellos y aplique presión hacia abajo hasta que el animal quede aplanado y el cubreobjetivo entre en contacto con la arcilla. Para generar recombinantes mediante el segundo método, coloque las tapas animales y los ovocitos juntos en indentaciones individuales vacías en la arcilla.

Asegúrese de que las superficies internas de los casquetes animales estén orientadas hacia el ovocito. Luego, fije los dos tejidos juntos utilizando pequeñas extensiones de arcilla. Una vez que se hayan generado varios recombinantes mediante cualquiera de los métodos, cultive estos y los embriones control reservados a 20 grados celsius.

Cuando los embriones control alcancen la etapa deseada, retire las cubreobjetos de los embriones recombinantes y aísle el ectodermo del casquete animal utilizando pinzas y un lazo de cabello. A continuación, fije tanto los fragmentos ectodérmicos como los embriones control en MEMFA durante una hora. Luego transfiera los tejidos a etanol y almacénelos a menos 20 grados centígrados.

Aquí, se inyectaron grupos de ovocitos con mezclas de ARNm correspondientes a números progresivamente menores de clones o colonias, y luego se cultivaron con casquetes animales. Posteriormente, se determinó el número de casquetes animales en cada grupo que expresaban foxe3, un marcador normalmente observado en el ectodermo de lente presumido desde las etapas de placa neural temprana hasta la formación de la vesícula, y utilizado aquí para evaluar la capacidad inductora de la lente. Este método identificó al gen que codifica al factor nuclear ldb1, el cual puede producir una respuesta inductora de lente en 50 de 179, o el 28 %, de los casquetes animales evaluados.

Se muestran aquí imágenes de hibridación in situ que representan la señal de foxe3, indicada mediante cabezas de flecha, en casquetes animales cultivados con ovocitos inyectados con ldb1 desde aproximadamente la etapa 11 hasta la etapa 23. No se observa expresión de foxe3 en los casquetes animales control correspondientes colocados sobre ovocitos no inyectados. Cuando se realizaron secciones a partir de estos casquetes animales, se observó expresión de foxe3 tanto en las capas ectodérmicas interna como externa.

La expresión en la capa interna es característica de una respuesta del cristalino. O, cuando se señala en ambas capas, indica otras estructuras como la placa olfativa. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar métodos como inmunohistoquímica, hibridación in situ o detección directa de un gen reportero fluorescente, con el fin de evaluar una respuesta inductiva en el ectodermo del casquete animal.