Invierta genética Enfoque Morpholino Usando ventricular cardíaca inyección para transfectar múltiples tejidos difíciles de conectar por objetivo en el pez cebra Larva

El objetivo general de este procedimiento es administrar oligonucleótidos morfolinos mediante inyecciones ventriculares en larvas, aletas caudales, e inhibir genes para evaluar su función durante la regeneración. Esto se logra primero anestesiando la larva y colocándola en una ranura del molde de aros. A continuación, se inserta la aguja de inyección en el ventrículo cardíaco.

Luego, la solución de morfo se inyecta de cuatro a seis veces en el ventrículo con intervalos ponderados entre los pulsos para permitir la limpieza del corazón. Finalmente, se amputa la aleta caudal y se permite su regeneración durante tres días. En última instancia, el efecto sobre la regeneración de la aleta puede evaluarse midiendo el área regenerada de la aleta mediante la herramienta de trazado de líneas del software de código abierto Fiji ImageJ.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la transgénesis o la mutagénesis es que permite el silenciamiento génico mediante minos en tejidos larvales que no son adecuados para inyecciones directas. Utilizando capilares de vidrio con un diámetro de 0,75 milímetros, coloque uno en un extractor de agujas y estire la aguja con los siguientes parámetros; con pinzas de relojero y bajo un estereoscopio equipado con un ocular micrométrico, rompa el capilar estirado para producir una aguja con un diámetro de 20 micrómetros. Luego, use un torno con una rueda giratoria de goma adherida para afilar la aguja y obtener un bisel de 20 micrómetros. Prepare el stock de morfo disolviendo el morfo liofilizado en un XPBS hasta una concentración final de 7,5 milimolar.

Mezcle la solución de inyección de Morpho combinando 2,5 microlitros de la solución stock de Morpho con 2,8 microlitros de la solución stock de endo Porter de un milimolar para obtener una concentración final de 3,5 milimolar de morph y 0,5 milimolar de endo porter para realizar las inyecciones. Utilice una micropipeta con una punta de 10 microlitros para cargar la aguja de vidrio biselada con cinco microlitros de la solución de Morpho. A continuación, inserte la aguja de vidrio en el portaagujas del micromanipulador conectado a la bomba neumática de pico.

Ajuste el ángulo de las inyecciones a aproximadamente 45 grados para que la aguja solo necesite moverse en una dirección planar. A continuación, configure los valores del microinyector de la siguiente manera: una presión de retención de 20 libras por pulgada cuadrada o PSI, una presión de expulsión de 15 PSIA, un rango de compuerta de 100 milisegundos y un valor de período de 1,9, lo que corresponde a 10,9 milisegundos. Prepare 20 mililitros de agar al 1,5 % fundido en una XPBS y viértalos en una placa de Petri de 10 centímetros.

Luego, coloque un molde de inyección acanalado en los aros tibios para formar surcos en el gel endurecido y anestesiar las larvas. Colóquelas en 100 mililitros de agua de acuario con 20 miligramos por litro de trican. Después de que dejen de responder al tacto, utilice una pipeta pasteur de plástico para transferir cuidadosamente la larva a un surco del molde de aros húmedo, de modo que el lado ventral quede orientado hacia la pared vertical del surco de los aros.

Coloque la placa con el aros bajo el microscopio estereoscópico de manera que el ventrículo quede orientado en dirección opuesta a la aguja de inyección. A continuación, baje la aguja e insértela aproximadamente uno a dos micrómetros dentro del ventrículo cardíaco, teniendo cuidado de no insertarla demasiado profundamente.

Luego, inyecte un impulso de tres nanolitros de solución Morpho en el ventrículo y espere para permitir la limpieza del corazón antes de repetir con cinco impulsos más tras la inyección; retire la aguja y colóquela en una placa de Petri que contenga un XPBS para evitar que se seque. A continuación, utilizando una pipeta de transferencia llena de medio E tres, transfiera cuidadosamente las larvas de vuelta a una placa de Petri que contenga medio E tres fresco para asegurar la absorción y el mantenimiento del morpholino en las células. Repita las inyecciones cada 12 a 24 horas durante toda la duración del experimento para evaluar los efectos de las inyecciones.

Después de anestesiar los peces, colóquelos sobre una placa plana y húmeda de aros cubierta con medio E tres antes de usar un microscopio estéreo con campo brillante y fluorescencia para obtener imágenes de ellos. Analice las imágenes en busca de regeneración utilizando el software gratuito Fiji Image J, empleando la herramienta de trazado de líneas para determinar la cantidad de crecimiento regenerativo que ha ocurrido. Primero, calibre las imágenes arrastrando y soltando un archivo en la ventana principal de Fiji en el menú principal.

Establezca la escala para todas las imágenes haciendo clic en analizar en el menú desplegable. Haga clic en establecer escala, luego active la opción global marcando la casilla de verificación. Ahora arrastre y suelte la imagen nuevamente para medir la cantidad de crecimiento regenerativo en la barra de herramientas.

Seleccione la herramienta de selección manual y rodee el área que se desea medir. Finalmente, presione Ctrl M. Esto abrirá una nueva ventana de resultados que muestra el valor del área delimitada en píxeles cuadrados. Como se observa aquí, minutos después de la inyección, la solución de morpho endo porter se distribuye a través de la vasculatura hacia diferentes tejidos, como el pliegue de la aleta y el cerebro, durante al menos 12 horas o más.

Para evaluar la regeneración de las estructuras distales de la aleta larval, se eliminaron los siguientes componentes: la punta distal del pliegue de la aleta y la médula espinal, la región distal sin médula, el músculo distal del tronco, que no es visible aquí, y las células pigmentarias, que son difíciles de dirigir mediante inyección directa, pero que parecen incorporar el morfolino tras inyecciones ventriculares seriadas. Por lo tanto, este método promueve relativamente con facilidad la administración del morfolino a tejidos difíciles de dirigir individualmente, y permite evaluar la función génica en varios tejidos de la aleta en regeneración simultáneamente. Para analizar la importancia de genes específicos implicados en la regeneración, la aleta larval se amputa parcialmente, y se resecan todos los tejidos que han incorporado el morfolino.

El pliegue de la aleta larval regenera su estructura en unos pocos días posteriores a la amputación, como se ha demostrado. Aquí, el morfolino dirige genes necesarios para la regeneración, alterando la respuesta regenerativa en comparación con controles no inyectados y controles de morfolino con secuencia desemparejada. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la regeneración exploraran los mecanismos moleculares implicados en la regeneración de la aleta del pez cebra.