Invierta genética Enfoque Morpholino Usando ventricular cardíaca inyección para transfectar múltiples tejidos difíciles de conectar por objetivo en el pez cebra Larva

El objetivo general de este procedimiento es administrar eno oligonucleótidos morfo a través de inyecciones ventriculares en los genes larval, de aleta de cueca y knock down para evaluar su función durante la regeneración. Esto se logra anestesiando primero a la larva y colocándola en una ranura del molde aros. A continuación, se inserta la aguja de inyección en el ventrículo cardíaco.

Luego, la solución morfológica se inyecta de cuatro a seis veces en el ventrículo con intervalos de ponderación entre pulsos para permitir la limpieza del corazón. Finalmente, se amputa la aleta de la cojo y se deja regenerar durante tres días. En última instancia, el efecto sobre la regeneración de la aleta se puede evaluar midiendo el área regenerada de la aleta utilizando la herramienta de trazado de líneas del software de código abierto Fiji image J.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como la transgénesis o la mutagénesis, es que permite la eliminación de genes por minos en tejidos larvarios que no son aptos para inyecciones directas Utilizando capilares de vidrio de 0,75 milímetros de diámetro, coloque uno en un tirador de agujas y tire de la aguja con los siguientes parámetros con pinzas de relojero, y bajo un estereoscopio con un ocular de micrómetro, rompa el capilar tirado para producir una aguja de 20 micrómetros de diámetro. Luego use un torno con una rueca de goma para afilar la aguja y producir un bisel de 20 micrómetros. Prepare el material morpho disolviendo el morpho liofilizado en un XPBS hasta una concentración final de 7,5 milimolares.

Mezcle la solución inyectable de Morpho combinando 2,5 microlitros de solución madre de Morpho con 2,8 microlitros de una solución madre de endo Porter milimolar para una concentración final de 3,5 milimolares de morph y 0,5 milimolares de endo porter para llevar a cabo las inyecciones. Utilice una micropipeta con una punta de 10 microlitros para cargar la aguja de vidrio biselado con cinco microlitros de solución morpho. A continuación, inserte la aguja de vidrio en el portaagujas del micromanipulador conectado a la picobomba neumática.

Ajuste el ángulo de las inyecciones a aproximadamente 45 grados para que la aguja solo tenga que moverse en una dirección de la cepilladora. A continuación, configure los valores del microinyector de la siguiente manera, una presión de retención de 20 libras por pulgada cuadrada o PSI, una presión de expulsión de 15 PSIA, un rango de 100 milisegundos de compuerta y un valor de período de 1.9, que corresponde a 10.9 milisegundos. Prepare 20 mililitros de 1.5%aros derretidos en un XPBS y viértalo en una placa de Petri de 10 centímetros.

A continuación, coloque un molde de inyección ranurado en el aros caliente para formar surcos en el gel endurecido para anestesiar las larvas. Colócalos en 100 mililitros de agua de acuario con 20 miligramos por litro de trican. Después de que dejen de responder al tacto, use una pipeta pastoral de plástico para transferir cuidadosamente la larva a una ranura del molde de aros húmedo de modo que el lado ventral quede frente a la pared vertical de aros del surco.

Coloque la placa aros debajo del microscopio estereoscópico de modo que el ventrículo quede de espaldas a la aguja de inyección. A continuación, baje la aguja e insértela aproximadamente de uno a dos micrómetros en el ventrículo cardíaco. Teniendo cuidado de no insertarlo demasiado profundamente.

A continuación, inyecte un pulso de tres nanolitros de solución Morpho en el ventrículo y pese para permitir la limpieza del corazón antes de repetir con cinco pulsos más después de la inyección, retire la aguja y colóquela en una placa de Petri que contenga un XPBS para evitar que se seque. Luego, usando una pipeta de transferencia llena de medio E tres, transfiera cuidadosamente las larvas a una placa de Petri que contenga medio E tres fresco para asegurar la absorción y el mantenimiento del morfo en las células. Repita las inyecciones cada 12 a 24 horas durante la duración del experimento para evaluar las inyecciones.

Después de anestesiar a los peces, colóquelos en una placa plana y húmeda cubierta con medio E tres antes de usar un microscopio estereoscópico con campo claro y fluorescencia para obtener imágenes de ellos. Analice las imágenes para su regeneración utilizando el software gratuito Fiji Image J para utilizar la herramienta de trazado de líneas para determinar la cantidad de crecimiento regenerativo que se ha producido. Primero, calibra las imágenes arrastrando y soltando un archivo en la ventana principal de Fiji en el menú principal.

Establezca la escala para todas las imágenes haciendo clic en analizar en el menú desplegable. Haga clic en Establecer escala y, a continuación, active la opción global haciendo clic en la casilla de verificación. Ahora arrastra y suelta la imagen de nuevo para medir la cantidad de crecimiento regenerativo en la barra de herramientas.

Elija la herramienta de selecciones a mano alzada y rodee el área que se va a medir. Finalmente, presione Ctrl M.Esto abrirá una nueva ventana de resultados que muestra el valor del área encerrada en un círculo en píxeles cuadrados. Como se ve aquí, a los pocos minutos de la inyección, la solución morpho endo porter se distribuye a través de la vasculatura en diferentes tejidos, como el pliegue de la aleta y el cerebro, durante al menos 12 horas o más.

Para evaluar la regeneración de las estructuras distales de las aletas larvarias, se extirparon las siguientes características: la punta distal del pliegue de la aleta y la médula espinal, la médula no distal, el músculo distal del tronco, que no es visible aquí, y las células pigmentarias, que son difíciles de atacar mediante inyección directa, pero parecen incorporar el morfo después de las inyecciones ventriculares en serie. Por lo tanto, este método promueve con relativa facilidad la entrega de morfo a tejidos que son difíciles de atacar individualmente, y permite la evaluación de la función génica en varios tejidos de la aleta en regeneración a la vez. Para analizar la importancia de genes específicos implicados en la regeneración, se amputa parcialmente la aleta del mimo larvario y se resecan todos los tejidos que han incorporado el morfo.

El pliegue de la aleta larvaria regenera su estructura a los pocos días de la amputación, como se ha demostrado. Aquí, morpho se dirige a los genes necesarios para la regeneración, perturbó la respuesta de regeneración en comparación con la no inyectada y los controles de morpho no coincidentes después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la regeneración exploraran los mecanismos moleculares que están involucrados en la regeneración de la aleta del pez cebra.