Modelos experimentales para el estudio de la fisiología epiteliales del pigmento retiniano y fisiopatología

El objetivo general de este procedimiento es generar cultivos de pigmento de la retina fetal humana, epitelio o EPR que se puedan utilizar como modelo. En las investigaciones de enfermedades oculares humanas, los tejidos se reciben de los donantes como globos oculares intactos. El primer paso del procedimiento es recortar el músculo y el tejido conectivo adicionales y luego abrir el ojo mediante la extracción de la córnea y el cristalino.

El ojo se trata con dispa y se aplana, y luego se retira la monocapa de EPR de la coroides. Disecado. Los EPR se siembran en matraces y se cultivan durante varias semanas hasta que alcanzan monocapas confluentes y desarrollan pigmento. Los cultivos celulares se utilizan en experimentos funcionales in vitro.

Los experimentos in vitro exitosos se repiten en modelos animales de ensayos preclínicos donde las respuestas de RPE se pueden evaluar mejor en entornos de señalización más complejos. El modelo demostrado aquí conducirá a una mejor comprensión de la fisiología del EPR y a nuevas intervenciones terapéuticas para tratar las enfermedades oculares. Hola, mi nombre es Sheldon Miller.

Mi laboratorio está ubicado en el Instituto Nacional del Ojo, que forma parte de los Institutos Nacionales de Salud en el campus de Bethesda, Maryland. Hola, soy Arki de Miller Lab. Hoy te mostraremos un procedimiento para la preparación de cultivos primarios de células epiteliales pigmentarias de la retina fetal humana.

Estas células se prepararán como monocapas confluentes que pueden montarse en cámaras de canto modificadas. También utilizaremos estas células RPE humanas aisladas para estudios de bioquímica y genética. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para establecer cultivos primarios de células epiteliales para estudiar la función y la regulación de los procesos fisiológicos y fisiopatológicos y desarrollar modelos clínicos animales de enfermedades.

Nos centramos en el epitelio pigmentario de la retina o EPR, que se encuentra en la parte posterior del ojo, separando la retina neural y el suministro de sangre coroidea. Este diagrama esquemático del ojo muestra la ubicación de la lámina de EPR en la parte posterior del ojo, justo adyacente a los fotorreceptores. El inserto muestra las células de la retina con los fotorreceptores a la derecha y las células ganglionares a la izquierda.

Este epitelio es metabólicamente extremadamente activo. Fagocitosis los fotorreceptores de forma continua y diurna, y almacena, mide y transporta el pigmento visual vitamina A a los fotorreceptores. En el ciclo visual, actúa homeostáticamente para mantener la composición química y el volumen de los espacios extracelulares circundantes.

Una propiedad crítica de los epiteliales es su polaridad. La entrega asimétrica continua de proteínas a las membranas apical y lateral basal es un proceso regulado que permite que el epitelio lleve a cabo el tráfico vectorial de metabolitos, iones y fluidos de un espacio extracelular a otro. Esta actividad ayuda al epitelio a mantener la salud y la integridad de la retina neural.

La preparación in vitro que aquí describimos permite el análisis de proteínas transportadoras, receptores y vías de señalización que determinan la polaridad y función epitelial antes de comenzar la disección. Prepare una placa de 12 pocillos en una campana de flujo laminar con soluciones a temperatura ambiente. Cada ojo requiere un pocillo de 10 x solución antibiótica antimicótica, dos pocillos de un XPBS y un pocillo de dos unidades por mililitro de espacio en disco diluido en medio RPE al 5% con suero Llene un plato de disección acolchado de silicona con un X-H-B-S-S, drene el líquido y transfiera cada ojo a un pocillo de solución antibiótica antimicótica.

Incube durante tres a cinco minutos a temperatura ambiente. Evite aplicar una presión excesiva en el globo ocular. Enjuague el ojo en dos pocillos sucesivos de un XPBS para eliminar el exceso de antibiótico.

Luego use pinzas para transferirlo a la placa de disección llena con un X-H-B-S-S bajo un microscopio estereoscópico de disección. Use tijeras de iris para eliminar el exceso de músculo y tejido conectivo alrededor del ojo. Alinee el ojo de modo que la córnea quede hacia arriba.

Use dos agujas estériles de calibre 27 para sujetar el ojo con alfileres por el tejido conectivo sin dañar la esclerótica de la almohadilla de silicona. En esta orientación, use un cuchillo de puerto lateral para hacer una incisión a través de la esclerótica. El corte debe ser de un tercio de la distancia desde el ecuador del ojo hasta la superficie anterior.

Use tijeras de iris para continuar el corte circularmente alrededor del ojo para evitar daños al pigmento de la retina. Epitelio, abreviado EPR por la atracción vítrea de la retina. Use las mismas tijeras para cortar el cuerpo vítreo para separar la solapa del ojo frontal de la copa del ojo.

Levante la porción anterior del IOA y deséchelo. Use fórceps para transferir el ojo abierto al pozo de la enfermedad. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en el ojo. Taza.

Incubar durante 40 a 60 minutos a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Transfiera el ojo del espacio de distribución de regreso a la placa de disección, que se ha llenado con temperatura ambiente fresca uno X-H-B-S-S. Coloque el ojo con la copa hacia arriba y asegúrelo con 2 agujas de calibre 27.

Bajo el microscopio de disección, use pinzas finas para levantar suavemente la retina parcialmente separada con unas tijeras para la retina. Corta la retina del nervio óptico. Desecha la retina con las tijeras de iris.

Haga una incisión desde la periferia del ojo hasta el nervio óptico. Sujeta el ojo con 5 agujas de calibre 27. Para estirar la capa de EPR, use unas tijeras para la retina para hacer un corte circular alrededor del nervio óptico.

Separar la capa RPE cambiando a un aumento de 250x o más. Encuentra el borde de la lámina de EPR a lo largo del corte hecho por las tijeras de iris y cerca del nervio óptico. Utilice dos pares de pinzas para separar el EPR y la membrana brus de la capa de tejido coroideo.

Pruebe varias áreas a lo largo del borde de corte para encontrar dónde es más débil la conexión entre el RPE y la coroides. Retire suavemente la membrana para eliminarla por completo. Coloque las láminas de RPE en un tubo cónico de 15 mililitros lleno de disparos a temperatura ambiente en EDTA.

Cuando se recojan todas las hojas, tape el tubo, incube los tubos en un baño de agua durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Agite el tubo vigorosamente para separar el EPR en pequeños grupos. La ausencia de grupos de células oscuras significa que la separación es completa.

Regrese el tubo al baño de agua durante otros cinco minutos. Use una pastadora, una pipeta y una succión suave para eliminar los restos de tejido no digeridos. Gire las celdas en una centrífuga a 280 5G durante cuatro minutos.

Retire el sobrenadante. Lleve el volumen final hasta los nueve mililitros con una pipeta media de RPE al 15 % para resuspender. Las células pipetean tres mililitros de la suspensión celular en un matraz de 25 centímetros cuadrados.

Agregue dos mililitros de cultivo medio a temperatura ambiente fresca, 15% de RPE. Las células durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. A medida que los cultivos maduran, su pigmentación aumentará después de tres o cuatro semanas.

Los cultivos exitosos serán confluentes y uniforme, intensamente pigmentados. Acabamos de mostrarle cómo preparar cultivos primarios de RP fetal humano. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.