Name: Modelos experimentales para el estudio de la fisiología epiteliales del pigmento retiniano y fisiopatología (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Aprende a cultivar células epiteliales de pigmento retiniano humano fetal para crear modelos de enfermedades oculares. Este método permite estudiar la fisiología del RPE y desarrollar intervenciones terapéuticas.

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Damos las gracias al laboratorio de Jeffrey Adijanto, Banzon Tina, Li Rong, Wan Qin, Zhang Congxiao, Zhao Jing, Zhi Connie, Zia Awais,, Strunnikova Natalia miembros para ayudar en la caracterización de estos cultivos celulares. Un agradecimiento especial a Jing Zhao, Zhi Connie, y Tina Banzon por su ayuda en el mantenimiento de grandes cantidades de cultivos de células. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de la Salud Programa de Investigación Intramural.

1. Tejido fetal humano Todas las investigaciones relacionadas con el tejido humano sigue los principios de la Declaración de Helsinki y de la junta de revisión institucional del NIH. Los ojos del feto se obtienen por un proxeneta independiente, recursos avanzados de Bioscience (ABR, Alameda, CA), a partir de donantes escogidos al azar entre las 16 y las 22 semanas de gestación, colocado en medio RPMI-1640 que contienen los tubos (proporcionada por la ABR), lleno de hielo, y entregados por un servicio de prioridad de entrega al día siguiente. Tejidos siguen siendo viables hasta 48 horas después de la enucleación. 2. Medio de cultivo celular MEM-alfa modificado del medio (Sigma-Aldrich) se utiliza como medio base para preparar un 5% y 15% de suero que contienen los medios de comunicación para el cultivo de células del EPR (medio de RPE, Tabla 1). <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Sigma </td><td> Gibco </td><td> Cantidad </td><td> Almacenamiento </td></tr><tr><td> MEM, alfa modificación </td><td> M-4526 </td><td></td><td> 500 ml </td><td> 4 ° C </td></tr><tr><td> N1 suplemento </td><td> N-6530 </td><td></td><td> 5 ml </td><td> 4 ° C </td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td></td><td> 15140-148 </td><td> 5 ml </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> Glutamax - I </td><td></td><td> 35050 </td><td> 5 ml </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> Aminoácidos no esenciales </td><td> M-7145 </td><td></td><td> 5 ml </td><td> 4 ° C </td></tr><tr><td> THT * </td><td></td><td></td><td></td><td> -80 ° C </td></tr><tr><td> Taurina </td><td> T-0625 </td><td></td><td> 125 mg </td><td></td></tr><tr><td> Hidrocortisona </td><td> H-0396 10 </td><td></td><td> 10 mg </td><td></td></tr><tr><td> Triyodo-thyronin </td><td> T-5516 </td><td></td><td> 0,0065 mg </td><td></td></tr><tr><td> Fetal bovino ** suero </td><td></td><td></td><td> 5% o 15% </td><td> -80 ° C </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Componentes de fetos humanos RPE medio de Preparación del medio de 500 ml THT * se obtiene disolviendo la taurina-hidrocortisona-triyodo-thyronin en un 1,5 ml de PBS antes de hacer la media. Alícuotas se realizan múltiples y almacenadas a -80 ° C para simplificar la preparación de cultivo del medio de cultivo. ** Suero bovino fetal no se obtuvieron de Sigma-Aldrich o Gibco. Suero fetal bovino utilizado en la preparación de los medios de comunicación se obtiene de Atlanta Biológicos (Norcross, GA). Cada frasco del suero es inactivado por calor (56 ° C durante 1 hora) antes de su uso. Para asegurar la consistencia de células de cultivo a gran cantidad de suero de un mismo lote se compran y se almacenan a -20 ° C hasta que se utilizan para la preparación de los medios de comunicación. Células escasamente semillas de un lote específico de las células hfRPE se cultivan en 24 - o 12 - y placas para un par de semanas en los medios de comunicación que contiene 20% de SFB de diferentes lotes. Las células de crecimiento más rápido melanated con la morfología RPE más clásico (adoquines), indican una gran cantidad apropiada de suero que se pueden utilizar para el cultivo celular. Medio de cultivo celular también contiene: N1 suplemento (Sigma-Aldrich) 1:100 ml / ml, Glutamax / penicilina-estreptomicina 1:100 ml / ml (Gibco), y la solución de aminoácidos no esenciales (Sigma-Aldrich) 1:100 ml / mL. Además, la hidrocortisona (20 mg / L), taurina (250 mg / L), y triyodo-thyronin (0,013 mg / L) (THT) está preparado con anticipación por la disolución de estos tres componentes en PBS a una concentración final de 1:500 (ml / ml). Alícuotas de THT se almacenan a 80 ° C hasta que añadido al medio de RPE. 3. Cultivo de células En la recepción, globos intactos se lavan en una solución de antibióticos antimicóticos (diluido 10 veces;.. Gato no 15240-096, Invitrogen) y gentamicina (1 mg / ml) durante 3 a 5 minutos (Figura 1). <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Después de los antibióticos de incubación se enjuagan dos veces con medio como HBSS o PBS. Un globo ocular en el momento de la transferencia de 10 cm con una placa de Petri recubiertas con Sylgard-184 (IPM) y se fija con agujas 27G. Usando un cuchillo Corta a puerto lateral (Alcon) se hace una incisión en la esclerótica por debajo del cuerpo ciliar (1 / 3 de la distancia desde el ecuador del ojo de la cara anterior). Esta incisión se utiliza para iniciar un corte circular para la eliminación de la parte anterior del ojo. Este corte se realiza mediante un carburo de tungsteno-tijeras iris curvas recubierto con una hoja de sierra (FST). Antes de la eliminación de la parte anterior del ojo, se hace una incisión a través del cuerpo vítreo de evitar de separar la retina de la RPE en el polo posterior. Después de la parte anterior del ojo es removido, el polo posterior se incuba con dispasa-I solución (2 U / mL, el gato no 04942086001;.. Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) en el 5% de suero que contiene medio durante 40-60 minutos en 37 ° C-CO 2 al 5%. Después del tratamiento dispasa, los polos posterior se transfieren a un HBSS en placas de Petri con silicona relleno (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) y se diseca en cuadrantes o trozos más grandes para aplanar suficientemente los tejidos. A continuación, la retina se quita suavemente con unas pinzas. Una sola célula capas RPE se desprendió en las hojas y se recoge directamente en frío de tripsina-EDTA (Gibco, 25200-056 #) solución. Después de que el EPR se recogen, los tubos con los tejidos de la tripsina-EDTA se cierran y se transfieren a baño maría durante 10-15 minutos a 37 ° C. Después de 10 minutos de incubación, los tubos se agita vigorosamente para separar RPE en pequeños grupos. Si la separación no es completa, los tubos se colocan de nuevo en baño de agua durante otros 5 minutos. Después de tripsina-EDTA de incubación, los tubos son inspeccionados para posibles sin disolver grupos de células mixtas. Cualquier grupos observados se eliminan mediante vidrio de punta fina pipeta Pasteur. Después de girar hacia abajo (1,4 rpm en centrífuga clínica durante 4 minutos), las células hfRPE se volvió a suspender en los medios de comunicación del EPR el 15% y se coloca en frascos de Primaria (ejemplo: cat 08-772-45; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA.. ). Este medio se reemplaza después de un día con el medio de RPE 5% de suero que contienen, y los cambios que se hicieron cada 2 ó 3 días. Después de 3 a 4 semanas, las células se confluentes y pigmentadas de manera uniforme. Luego se trypsinized en el 0,25% de tripsina-EDTA durante 10 a 15 minutos, volvió a suspender en un 15% de suero que contienen células RPE medio de cultivo, y sembradas en claro insertos de cultivo celular de 150 a 200 mil células por pocillo (Transwell, Corning Costar, Corning, NY), con 12 mm de diámetro se inserta, los poros de 0,4 um, las membranas de poliéster (por ejemplo: gato no 07-200-161, Fisher Scientific)... Antes de la siembra, los pozos fueron recubiertos con matriz extracelular humanos (10 mg en 150 HBSS por pocillo, el gato no 354.237,.. BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) y se cura con la luz UV en el capó durante 2 horas. En algunos casos, el procedimiento se repitió tripsinización por segunda vez, para recoger las células que no se haya desprendido después de la tripsina en primer lugar. El mismo protocolo (sin recubrimiento con ECM) se utilizó para cultivo de células en los frascos para generar la población P1 de las células. Estas células fueron utilizados en experimentos cuando tenían una resistencia del tejido total de ≥ 200 Ω • cm 2 y fueron uniformemente pigmentados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/2032fig1full.jpg">Por favor, haga clic aquí para obtener una cifra mayor 1</a> . 4. Paso a paso los procedimientos <ol><li> Prepare 12 y placa con múltiples soluciones (para cada ojo cuatro pozos necesarios): <ol class="lalpha"><li> añadir 10x solución de antibióticos antimicóticos - 1 y / ojo </li><li> añadir PBS / HBSS solución de enjuague - 2 pozos / ojo </li><li> agregar la solución de dispasa - 1 y / ojo </li></ol></li><li> Prepare la disección de una placa de Petri de desembalaje 5 agujas de fijación y llenado con HBSS </li><li> Desempaquetar los ojos y los situará en antibiótico-antimicótico solución durante 3-5 minutos (preparado en el paso 1) </li><li> Lavar los ojos en dos pozos (preparado en el paso 1) con PBS / HBSS, y luego los transferirá a la disección plato. </li><li> Recorte excesivo del músculo y los tejidos conectivos que rodean el ojo </li><li> Usando agujas 27G de seguridad (pin de silicio hasta la base) los ojos en la disección de la alineación de los platos de una manera en la córnea hacia arriba. </li><li> Usando un cuchillo puerto lateral hacer incisión por debajo de la córnea, donde corte circular se iniciará </li><li> El uso de tijeras iris que cortar alrededor de los ojos, y luego con unas tijeras misma corte a través del vítreo y levantar la parte anterior del ojo de distancia. Nota: en los pasos 3-8 evitar cualquier exceso de presión mecánica a cara. </li><li> La transferencia de los ojos abiertos en la solución dispasa (preparado en el paso 1) </li><li> Incubar ocular durante 40-60 minutos a 37 º C con CO2 al 5% </li><li> Reemplace la solución HBSS en la disección de plato con uno nuevo. </li><li> La transferencia de los ojos de la solución a dispasa plato de disección. </li><li> La posición del ojo en una placa Petri (taza del globo ocular hacia arriba) y seguro con dos agujas de 27G. </li><li> Con cuidado, levante la retina separado parcialmente y con unas tijeras corte la retina retina se desprenda de el nervio óptico. Deseche retina. </li><li> El uso de tijeras iris hacer una incisión de la periferia del ojo hacia el nervio óptico. </li><li> Usando los cinco agujas 27G aplanar los ojos lo que la capa de RPE bien estirado. </li><li> Con la tijera que corta la retina circular alrededor del nervio óptico que separa la capa de RPE del apego al nervio óptico. Nota: los pasos 13-17 se puede hacer con o sin aumento bajo microscopio estereoscópico </li><li> Ajuste estereomicroscopio a la ampliación de 250xo más y encontrar el borde de la hoja de RPE cerca del nervio óptico a lo largo del corte realizado con tijeras iris. </li><li> El uso de dos pinzas de membrana separado RPE-Bruch de la capa de tejido coroideo. Se puede requerir varios intentos para encontrar la zona a lo largo de la orilla, donde la conexión del EPR y la coroides es más débil. </li><li> Hojas de RPE en lugar frío tripsina-EDTA solución en el tubo de 15 ml </li><li> Después de que el EPR se recogen, los tubos de tapa y transfiera con los tejidos de la tripsina-EDTA en baño de agua durante 15 minutos de 10 a 37 ° C. </li><li> Después de 10 minutos de incubación, agite vigorosamente tubos de 15 ml para separar RPE en pequeños grupos. Si la separación no es completa, coloque los tubos de nuevo en baño de agua durante otros 5 minutos. </li><li> Inspeccionar los tubos para posibles sin disolver grupos de células mixtas. Cualquier grupos observados se deben eliminar con punta fina pipeta Pasteur de vidrio. </li><li> Girar hacia abajo (1,4 rpm en centrífuga clínica de 4 minutos), las células hfRPE, eliminar el sobrenadante y resuspender las células en un 15% los medios de comunicación del EPR (9 ml en total) </li><li> Colocar 3 ml de suspensión celular en frascos Primaria agregar 2 ml de agua dulce un 15% los medios de comunicación del EPR, un frasco lugar en la incubadora hasta el día siguiente (37 ° C, 5% de CO 2) </li></ol> 5. Resultados representante Validación funcional de cultivo celular hfRPE En experimentos anteriores que han utilizado estos cultivos primarios para determinar la expresión, la polarización y la función de las proteínas plasmáticas de transporte de membrana e identificar las vías de señalización específicas que regulan la función del EPR 1.11 Estas características a medida que se acumulan proporcionar un conjunto de validación de las propiedades que se pueden aplicar a cada generación de células. Los experimentos se resumen a continuación identificar las proteínas que determinan el transporte de fluidos transepitelial y la integridad de la vía paracelular. Estos experimentos in vitro han sido validados en un modelo animal de la retina de nuevo reinserción 6. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Localización de CFTR en las células hfRPE panel superior izquierdo:. CFTR se detectó en las células utilizando hfRPE enriquecido membrana extractos. M, marcador de peso molecular, carril 1, mayor madurez (banda C) e inmaduros (bandas A y B) del panel inferior central: la localización de inmunofluorescencia de CFTR (etiqueta verde) El panel superior derecho: vista ampliada sección transversal a través del plano z muestra.. de máxima intensidad de proyección a través del eje z. ZO-1 (etiquetado como rojo) sirve como un marcador apretado nudo de delinear las partes apical y basolateral de la RPE. DAPI (azul) etiquetas de los núcleos situados cerca de la membrana basal. ZO-1 aparece como amarillo / naranja, ya que la fluorescencia se superpone con etiqueta roja verde de CFTR. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. IFN-inducida por los cambios fisiológicos en hfRPE A:. Adición de IFN al baño basal aumentado el transporte de fluidos transepitelial (J v) a través de la monocapa de células primarias, hfRPE cultivadas J v se representa como una función del tiempo en el seguimiento de la parte superior y de líquido. absorción (apical de baño basal) se indica con valores positivos, de potencial transepitelial (TEP) y la resistencia del tejido total (R T) se representa como una función del tiempo en las huellas del fondo. B: La adición de CFTRinh-172 (5 M) en el baño basal inhibe el IFN-estimulado J aumento v. A continuación se muestra un ejemplo de experimentos realizados con modelos animales que confirma hfRPE hallazgos in vitro. En este experimento, el desprendimiento de retina artificial creada se redujo significativamente después de la adición de IFNg a la superficie del ojo exterior (Figura 4 A, B). Este efecto puede ser parcialmente bloqueada por: (1) Además de bloqueador de AMPc (Figura 4), ​​(2) completamente bloqueada después de la adición de bloqueadores de JAK AMPc +. Las imágenes a continuación se han obtenido utilizando escáner octubre <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. En experimentos in vivo desprendimiento de retina. Los procedimientos de estos experimentos in vivo han sido descritas previamente en detalle 6. En estos experimentos, los desprendimientos de retina se han creado en los ojos de ratas mediante la inyección de 0,5 a 3 l de solución de PBS modificado en el espacio subretinal (SRS), solo o con una combinación de JAK-STAT y los inhibidores de la PKA. Cada experimento tuvo un período de control inicial de 40-70 minutos después de la creación del desprendimiento de retina. Durante este tiempo, la tasa de variación del volumen de la ampolla se midió para asegurar la estabilidad de la ampolla. Tomografía de coherencia óptica de imagen (Instituto de Física Aplicada de la Academia Rusa de Ciencias, Nizhniy Novgorod, Rusia) se utilizó para medir la evolución en el tiempo del cambio de volumen en el SRS. El tiempo de la re-unión volcambio de volumen se midió por tomografía de coherencia óptica (OCT). Octubre las imágenes de cuatro experimentos diferentes (paneles de la izquierda, AD), que muestran un cambio en el tamaño de desprendimiento (flechas en A, B y D) después de la adición de IFN a la superficie anterior de 40 a 70 min. Los grupos A y B muestran que IFN Jv mayor de su tipo de control (≈ 2 l • cm 2 • h -1) a 14 y de 12 l • cm 2 • h-1, respectivamente. Tras la adición de JAK-STAT y los inhibidores de PKA (C y D), el IFN - las tasas de absorción inducido se redujo significativamente de 0,2 y 7,9 l • cm 2 • h-1, respectivamente. Las flechas indican el límite de la ampolla para la comparación con el área comprendida dentro de la línea de puntos, (volumen inicial). Lado derecho de la figura: top-panel de resumen de medir las tasas de Jv de varios experimentos, panel central, la película ( <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/Bleb%205.wmv">clic aquí</a> ), el panel inferior-3D secciones del experimento se resumen en B. Pseudocolor en azul indica la extensión espacial de la separación en t = 0 y 40 minutos después de la adición de INFγ. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología declaración. El protocolo fue aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo de los Institutos Nacionales de Salud.

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</ol>

En los experimentos actuales, se describen las modificaciones adicionales de nuestras técnicas previamente publicado 3 diseñado para agilizar los pasos necesarios para producir múltiples culturas consistente hfRPE primaria con un número mayor de células disponibles en cada ojo. Cada cambio en el procedimiento original fue rigurosamente probado en la fisiología de múltiples experimentos de biología molecular para asegurar que los cambios no introducir artefactos y ser probado continuamente por muchos otros laboratorios con estas células. Por último, otros experimentos se llevaron a cabo para comparar los resultados in vitro a las perturbaciones similares en modelos animales.

Instrumentos necesarios para el protocolo de disección <ol><li> Stereo Microscope - disponible con cualquier x250 magnificación de trabajo necesario para la disección </li><li> Plato de disección - por ejemplo, Kimble 100 x 20 mm # 23062 (uno por disección) de cualquier fuente </li><li> Sylgard 184 - Cat WPI. # SYLG184 * * Para preparar el plato de la disección de seguir Sylgard 184 incluye las instrucciones de mezclado, se vierte elastómero líquido mezclado en una placa de Petri para formar 5-8mm capa. Elastómero para permitir la curación de al menos 24 horas. Plato con elastómero curado pueden ser esterilizados con etanol al 70% y volver a utilizar varias veces (~ 100 veces) </li><li> 27 G agujas de BD PrecissionGlide una longitud de ¼ (5 por disección) de cualquier fuente </li><li> 1X HBSS solución que contiene calcio y sales de Mg - Cat # 14025 GIBCO 500ml (bueno para las disecciones múltiples). </li><li> Tijeras iris de carburo dentada hoja, curva - FST Cat. # 14559 a 11 (uno). </li><li> Tijeras de la retina - Katena Cat. # K4-5300 (uno). </li><li> Pinzas - por ejemplo, pinzas Dumont n º 5 con puntas pulidas de Cat WPI # 500085 (2 piezas). </li><li> Cuchillo de puerto lateral - Alcon, clareo de 1 mm, bisel doble, Cat ángulo # 8065921540. </li><li> Centrífuga 15ml tubo - (una por cada ojo) de cualquier fuente </li><li> Pipeta Pasteur - (uno por disección) de cualquier fuente </li><li> Placa de 12 pocillos (uno por disección) de cualquier fuente </li><li> Primaria 25 cm 2 frasco - (02.03 por cada ojo) de cualquier fuente </li></ol>

modelos experimentales para el estudio de la fisiología epiteliales del pigmento retiniano y fisiopatología

 Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

Hemos desarrollado un método de cultivo de células que pueden producir grandes cantidades de monocapas confluentes de primaria de fetos humanos epitelio pigmentario de la retina (hfRPE) los cultivos con características morfológicas, fisiológicas y genéticas de RPE humana nativa. Estos cultivos celulares hfRPE presentan pigmentación pesados, y la microscopía electrónica muestra amplia microvellosidades membrana apical. Los complejos de unión se identificaron con el etiquetado de inmunofluorescencia de varias proteínas de las uniones estrechas. Polaridad epitelial y función de estos cultivos primarios de fácil reproducción se asemejan estudiado previamente los modelos de mamíferos de RPE nativo, incluidos los humanos. Estos resultados se extendieron por el desarrollo de intervenciones terapéuticas en modelos animales de enfermedad de los ojos humanos. Nos hemos centrado en las estrategias para la eliminación de la acumulación anormal de líquido en la retina o en el espacio subretiniano. El espacio subretiniano extracelular separa los segmentos de los fotorreceptores y externa de la membrana apical del EPR y es fundamental para el mantenimiento de los archivos adjuntos de retina y una gran cantidad de interacciones RPE / retina.

Ofrecemos un método reproducible para el cultivo de las monocapas confluentes de células fetales humanas del epitelio pigmentario de la retina (hfRPE) las células que presentan la morfología, la fisiología, la polaridad, y la proteína y los patrones de expresión génica del tejido nativo adulto. Este trabajo se ha extendido a un modelo animal de enfermedades de los ojos de varios.

Modelos experimentales para el estudio de la fisiología epiteliales del pigmento retiniano y fisiopatología

Hemos desarrollado un procedimiento de cultivo celular capaz de producir grandes cantidades de monocapas confluentes de epitelio pigmentario retinal fetal humano primario...

El objetivo general de este procedimiento es generar cultivos de epitelio pigmentario retiniano, o RPE, fetal humano que puedan utilizarse como modelo. En investigaciones sobre enfermedades oculares humanas, los tejidos se reciben de donantes en forma de globos oculares intactos. El primer paso del procedimiento consiste en eliminar el músculo y el tejido conectivo adicional, y luego abrir el ojo extrayendo la córnea y el cristalino.El ojo se trata con dispa y se aplana, luego se separa la monocapa de epitelio pigmentario retiniano (EPR) del coroides. Se diseca. Las células de EPR se siembran en frascos y se cultivan durante varias semanas hasta que alcanzan monocapas confluentes y desarrollan pigmento. Los cultivos celulares se utilizan en experimentos funcionales in vitro.Los experimentos in vitro exitosos se repiten en modelos animales de ensayos preclínicos, donde las respuestas del epitelio pigmentario retiniano pueden evaluarse mejor en entornos de señalización más complejos. El modelo mostrado aquí conducirá a una mejor comprensión de la fisiología del epitelio pigmentario retiniano y a nuevas intervenciones terapéuticas para tratar enfermedades oculares. Hola, mi nombre es Sheldon Miller.Mi laboratorio está ubicado en el Instituto Nacional del Ojo, que forma parte de los Institutos Nacionales de la Salud en el campus de Bethesda, Maryland. Hola, soy Arki del Laboratorio Miller. Hoy les mostraremos un procedimiento para preparar cultivos primarios de células epiteliales pigmentarias retinianas fetales humanas.Estas células se prepararán como monocapas confluentes que pueden montarse en cámaras Ussing modificadas. También utilizaremos estas células de epitelio pigmentario retiniano humano aisladas para estudios en bioquímica y genética. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para establecer cultivos primarios de células epiteliales con el fin de estudiar la función y regulación de procesos fisiológicos y fisiopatológicos, y desarrollar modelos animales clínicos de enfermedades.Nos centramos en el epitelio pigmentario retiniano o RPE, que se encuentra en la parte posterior del ojo, separando la retina neural del suministro sanguíneo coroideo. Este diagrama esquemático del ojo muestra la ubicación de la lámina de RPE en la parte posterior del ojo, justo adyacente a los fotorreceptores. El recuadro muestra las células de la retina con los fotorreceptores a la derecha y las células ganglionares a la izquierda.Este epitelio es extremadamente activo metabólicamente. Fagocita continuamente los fotorreceptores sobre una base diurna, y almacena, modifica y transporta el pigmento visual vitamina A hacia los fotorreceptores. En el ciclo visual, actúa de manera homeostática para mantener la composición química y el volumen de los espacios extracelulares circundantes.Una propiedad fundamental de los epitelios es su polaridad. La entrega asimétrica continua de proteínas a las membranas apical y basolateral es un proceso regulado que permite al epitelio realizar el tráfico vectorial de metabolitos, iones y fluidos desde un espacio extracelular hacia otro. Esta actividad ayuda al epitelio a mantener la salud e integridad de la retina neural.La preparación in vitro que describimos aquí permite el análisis de proteínas de transporte, receptores y vías de señalización que determinan la polaridad y función epitelial antes de comenzar la disección. Prepare una placa de 12 pocillos en una cabina de flujo laminar con soluciones a temperatura ambiente. Cada ojo requiere un pocillo de solución antibiótico antimicótico 10x, dos pocillos de XPBS uno y un pocillo de dos unidades por mililitro de espacio del disco diluidas en medio RPE al 5 % con suero. Llene un recipiente de disección con revestimiento de silicona con X-H-B-S-S 1x, drene el líquido y transfiera cada ojo a un pocillo de solución antibiótico antimicótico.Incube de tres a cinco minutos a temperatura ambiente. Evite aplicar cualquier presión excesiva sobre el globo ocular. Enjuague el ojo en dos pozos sucesivos de un XPBS para eliminar el antibiótico en exceso.Luego, use pinzas para transferirlo al recipiente de disección lleno con una X-H-B-S-S bajo un microscopio estéreo de disección. Utilice tijeras de iris para eliminar el músculo y el tejido conectivo excesivo alrededor del ojo. Alinee el ojo de modo que la córnea quede orientada hacia arriba.Utilice dos agujas estériles de calibre 27 para fijar el ojo mediante el tejido conectivo sin dañar la esclerótica a la almohadilla de silicona. En esta orientación, utilice un bisturí de puerto lateral para realizar una incisión a través de la esclerótica. El corte debe estar a un tercio de la distancia desde el ecuador del ojo hasta la superficie anterior.Utilice tijeras de iris para continuar el corte circularmente alrededor del ojo para evitar dañar el epitelio pigmentario de la retina, abreviado como RPE por atracción del vítreo hacia la retina. Utilice las mismas tijeras para cortar a través del cuerpo vítreo y separar la porción anterior del ojo de la copa ocular.Levante la porción anterior del IOA y deséchela. Utilice pinzas para transferir el ojo abierto al pocillo de la placa de disociación. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en el ojo.Cup.Incubar de 40 a 60 minutos a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Transfiera el ojo desde el espacio de disección de vuelta al recipiente para disección, que ha sido llenado con solución H-B-S-S al 1X a temperatura ambiente fresca. Coloque el ojo con la copa hacia arriba y sujételo con 2 agujas de calibre 27.Bajo el microscopio estereoscópico, use pinzas finas para levantar suavemente la retina parcialmente separada con tijeras para retina. Corte la retina del nervio óptico. Deseche la retina con las tijeras para iris.Realice una incisión desde la periferia del ojo hasta el nervio óptico. Fije el ojo con 5 agujas de calibre 27. Para estirar la capa de epitelio pigmentario de la retina (RPE), use tijeras retinianas para hacer un corte circular alrededor del nervio óptico.Separar la capa de epitelio pigmentario de la retina (RPE) cambiando a un aumento de 250x o más. Localice el borde de la lámina de RPE a lo largo del corte realizado con las tijeras de iris y cerca del nervio óptico. Utilice dos pares de pinzas para separar el RPE y la membrana de Bruch de la capa de tejido coroideo.Pruebe varias áreas a lo largo del borde de corte para encontrar dónde la conexión entre el epitelio pigmentario de la retina (RPE) y la coroides es más débil. Pela suavemente la membrana hacia atrás para eliminarla por completo. Coloque las láminas de RPE en un tubo cónico de 15 mililitros lleno con tripsina a temperatura ambiente en EDTA.Una vez recolectadas todas las láminas, tape el tubo e incube los tubos en un baño de agua durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Agite el tubo vigorosamente para separar el epitelio pigmentario retiniano (RPE) en pequeños grupos. La ausencia de grumos oscuros indica que la separación está completa.Devuelva el tubo al baño de agua durante otros cinco minutos. Utilice un aplicador, una pipeta y succión suave para eliminar los restos de tejido no digerido. Centrifugue las células en una centrífuga a 280 ×g durante cuatro minutos.Elimine el sobrenadante. Ajuste el volumen final a nueve mililitros con medio RPE al 15 % mediante pipeta para resuspender. Transfiera tres mililitros de la suspensión celular a un matraz de 25 centímetros cuadrados mediante pipeta.Añada dos mililitros de medio de cultivo fresco con temperatura ambiente y 15 % de RPE. Incube las células durante la noche a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. A medida que los cultivos maduren, su pigmentación aumentará tras tres o cuatro semanas.Los cultivos exitosos serán confluentes y estarán uniformemente pigmentados de manera intensa. Acabamos de mostrarle cómo preparar cultivos primarios de RP fetal humano. Eso es todo.Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Aquí presentamos un protocolo para diferenciar células del pigmento retiniano epitelio (RPE) de las células de vástago pluripotent humana teniendo mutaciones derivados del paciente. Las líneas celulares mutantes pueden utilizarse para el análisis funcionales como immunoblotting, inmunofluorescencia, abrazadera del remiendo. Este enfoque de la enfermedad en plato evita la dificultad de obtención de células de EPR humanas nativas.

Diferenciación, mantenimiento y análisis de células del epitelio pigmentario de la retina humana: un modelo de enfermedad en un plato para las mutaciones BEST1

Aquí, presentamos un método para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio pigmentario de la retina (RPE) en ratones utilizando una técnica conocida como DC-ERGs descrita por primera vez por Marmorstein, Peachey y sus colegas a principios de la década de 2000.

Electroretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG) para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio del pigmento retinivo del ratón

Este protocolo, que fue reportado originalmente por Fernandez-Godino et al. en 20161,describe un método para aislar eficientemente y cultivo de células RPE del ratón, que forman una monocapa RPE funcional y polarizada dentro de una semana en las placas Transwell. El procedimiento dura aproximadamente 3 horas.

Disección eficiente y cultivo de células epiteliales de pigmento retiniano de ratón primario

Este protocolo presenta y describe los pasos para el aislamiento, disección, cultivo y tinción de explantes de retina obtenidos de un ratón adulto. Este método es beneficioso como modelo ex vivo para estudiar diferentes enfermedades neurovasculares de la retina como la retinopatía diabética.

Explante retiniano de la retina de ratón adulto como modelo ex vivo para el estudio de enfermedades neurovasculares retinianas

Describimos un método para separar eficientemente el epitelio pigmentario de la retina (EPR) de la retina en los ojos humanos y generar montones planos completos de EPR / coroides para análisis histológicos y morfométricos del EPR.

Generación eficiente y consistente de epitelio pigmentario retiniano/cordoides de montaje plano a partir de ojos humanos para análisis histológico

Describimos un método simple y eficiente para aislar células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) de los ojos de conejillos de indias pigmentados jóvenes. Este procedimiento permite realizar estudios de biología molecular de seguimiento en el EPR aislado, incluidos los análisis de expresión génica.

Aislamiento de células epiteliales pigmentarias de la retina de ojos de conejillo de indias

Los modelos de ratón pueden ser herramientas útiles para investigar la biología del epitelio pigmentado de la retina (EPR). Se ha establecido que los ratones pueden desarrollar una serie de patologías del EPR. Aquí, describimos un protocolo de fenotipado para dilucidar y cuantificar patologías de EPR en ratones utilizando luz, electrones de transmisión y microscopía confocal.

Un protocolo para evaluar y cuantificar patologías del epitelio pigmentado retiniano en modelos murinos de degeneración macular relacionada con la edad

Las enfermedades oculares degenerativas que afectan la capa del epitelio pigmentario de la retina del ojo tienen orígenes monogénicos y poligénicos. Se han desarrollado varios modelos de enfermedades y una aplicación de software, LipidUNet, para estudiar los mecanismos de la enfermedad, así como posibles intervenciones terapéuticas.

LipidUNet-Machine Learning Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

Este protocolo describe el procedimiento para obtener y cultivar células epiteliales pigmentarias primarias de la retina (EPR) a partir de ojos porcinos de origen local. Estas células sirven como una alternativa de alta calidad a las células madre y son adecuadas para la investigación in vitro de la retina.

Aislamiento de células epiteliales pigmentarias primarias de la retina porcina para modelado in vitro

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) actúa como una barrera crucial entre la coroides y la retina, promoviendo la salud y la función de los tipos de células de la retina, como los fotorreceptores. En este trabajo se describe un protocolo sencillo y eficaz para el aislamiento y cultivo de EPR murino adulto.

Un método simplificado para el aislamiento y cultivo de células epiteliales pigmentarias de la retina de ratones adultos

Aprende a cultivar células epiteliales de pigmento retiniano humano fetal para crear modelos de enfermedades oculares. Este método permite estudiar la fisiología del RPE y desarrollar intervenciones terapéuticas.

Modelos experimentales para el estudio de la fisiología epiteliales del pigmento retiniano y fisiopatología

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