Modelos experimentales para el estudio de la fisiología epiteliales del pigmento retiniano y fisiopatología
6 de noviembre de 2010
Ofrecemos un método reproducible para el cultivo de las monocapas confluentes de células fetales humanas del epitelio pigmentario de la retina (hfRPE) las células que presentan la morfología, la fisiología, la polaridad, y la proteína y los patrones de expresión génica del tejido nativo adulto. Este trabajo se ha extendido a un modelo animal de enfermedades de los ojos de varios.
El objetivo general de este procedimiento es generar cultivos de epitelio pigmentario retiniano, o RPE, fetal humano que puedan utilizarse como modelo. En investigaciones sobre enfermedades oculares humanas, los tejidos se reciben de donantes en forma de globos oculares intactos. El primer paso del procedimiento consiste en eliminar el músculo y el tejido conectivo adicional, y luego abrir el ojo extrayendo la córnea y el cristalino.
El ojo se trata con dispa y se aplana, y luego se separa la monocapa de epitelio pigmentario de la retina (RPE) del coroides. Se diseca. Las células RPE se siembran en frascos y se cultivan durante varias semanas hasta que alcanzan monocapas confluentes y desarrollan pigmento. Los cultivos celulares se utilizan en experimentos funcionales in vitro.
Los experimentos in vitro exitosos se repiten en modelos animales de ensayos preclínicos, donde las respuestas del epitelio pigmentario retiniano pueden evaluarse mejor en entornos de señalización más complejos. El modelo mostrado aquí conducirá a una mejor comprensión de la fisiología del epitelio pigmentario retiniano y a nuevas intervenciones terapéuticas para tratar enfermedades oculares. Hola, mi nombre es Sheldon Miller.
Mi laboratorio se encuentra en el Instituto Nacional del Ojo, que forma parte de los Institutos Nacionales de la Salud en el campus de Bethesda, Maryland. Hola, soy Arki del Laboratorio Miller. Hoy les mostraremos un procedimiento para preparar cultivos primarios de células epiteliales del pigmento retiniano fetal humano.
Estas células se prepararán como monocapas confluentes que pueden montarse en cámaras Ussing modificadas. También utilizaremos estas células RPE humanas aisladas para estudios en bioquímica y genética. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para establecer cultivos primarios de células epiteliales con el fin de estudiar la función y regulación de procesos fisiológicos y fisiopatológicos, y desarrollar modelos animales clínicos de enfermedades.
Nos centramos en el epitelio pigmentario de la retina o RPE, que se encuentra en la parte posterior del ojo, separando la retina neural del suministro sanguíneo coroideo. Este diagrama esquemático del ojo muestra la ubicación de la lámina de RPE en la parte posterior del ojo, justo adyacente a los fotorreceptores. El recuadro muestra las células de la retina con los fotorreceptores a la derecha y las células ganglionares a la izquierda.
Este epitelio es extremadamente activo metabólicamente. Fagocita continuamente los fotorreceptores sobre una base diurna, y almacena, modifica y transporta el pigmento visual vitamina A hacia los fotorreceptores. En el ciclo visual, actúa de manera homeostática para mantener la composición química y el volumen de los espacios extracelulares circundantes.
Una propiedad fundamental del epitelio es su polaridad. La entrega asimétrica continua de proteínas a las membranas apical y basal lateral es un proceso regulado que permite al epitelio realizar el tráfico vectorial de metabolitos, iones y fluidos desde un espacio extracelular hacia otro. Esta actividad ayuda al epitelio a mantener la salud e integridad de la retina neural.
La preparación in vitro que describimos aquí permite el análisis de proteínas de transporte, receptores y vías de señalización que determinan la polaridad y función epitelial antes de comenzar la disección. Prepare una placa de 12 pocillos en una cabina de flujo laminar con soluciones a temperatura ambiente. Cada ojo requiere un pocillo de solución antibiótico antimicótico 10x, dos pocillos de XPBS y un pocillo de dos unidades por mililitro de espacio discal diluidas en medio RPE al 5 % con suero. Llene un platillo de disección con revestimiento de silicona con X-H-B-S-S, drene el líquido y transfiera cada ojo a un pocillo de solución antibiótico antimicótico.
Incube de tres a cinco minutos a temperatura ambiente. Evite aplicar cualquier presión excesiva sobre el globo ocular. Enjuague el ojo en dos pozos sucesivos de un XPBS para eliminar el antibiótico en exceso.
Luego, use pinzas para transferirlo a la placa de disección llenada con una X-H-B-S-S bajo un microscopio estereoscópico de disección. Utilice tijeras de iris para eliminar el músculo excesivo y el tejido conectivo alrededor del ojo. Alinee el ojo de modo que la córnea quede orientada hacia arriba.
Utilice dos agujas estériles de calibre 27 para fijar el ojo por el tejido conectivo sin dañar la esclerótica a la almohadilla de silicona. En esta orientación, utilice un bisturí de puerto lateral para hacer una incisión a través de la esclerótica. El corte debe estar a un tercio de la distancia desde el ecuador del ojo hasta la superficie anterior.
Utilice tijeras de iris para continuar el corte circularmente alrededor del ojo con el fin de evitar dañar el epitelio pigmentario de la retina, abreviado como RPE por atracción de la retina vítreo. Utilice las mismas tijeras para cortar a través del cuerpo vítreo y separar la solapa anterior del ojo de la copa ocular.
Levante la porción anterior del IOA y deséchela. Utilice pinzas para transferir el ojo abierto al pocillo de la placa. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en el ojo.Cup.
Incubar de 40 a 60 minutos a 37 grados Celsius con 5 % de dióxido de carbono. Transfiera el ojo desde el espacio de disección de vuelta al recipiente para disección, que ha sido llenado con H-B-S-S al 1 X a temperatura ambiente fresca. Coloque el ojo con la cavidad hacia arriba y sujételo con dos agujas de calibre 27.
Bajo el microscopio de disección, use pinzas finas para levantar suavemente la retina parcialmente separada con tijeras para retina. Corte la retina del nervio óptico. Deseche la retina con las tijeras para iris.
Realice una incisión desde la periferia del ojo hasta el nervio óptico. Fije el ojo con 5 agujas de calibre 27. Para estirar la capa de epitelio pigmentario retiniano (RPE), use tijeras retinianas para hacer un corte circular alrededor del nervio óptico.
Separar la capa de epitelio pigmentario de la retina (RPE) cambiando a un aumento de 250x o mayor. Localice el borde de la lámina de RPE a lo largo del corte realizado con las tijeras de iris y cerca del nervio óptico. Utilice dos pares de pinzas para separar el RPE y la membrana de Bruch de la capa de tejido coroideo.
Pruebe varias áreas a lo largo del borde de corte para encontrar dónde la conexión entre el epitelio pigmentario de la retina (RPE) y la coroides es más débil. Pela suavemente la membrana hacia atrás para eliminarla por completo. Coloque las láminas de RPE en un tubo cónico de 15 mililitros lleno con tripsina a temperatura ambiente en EDTA.
Una vez recolectadas todas las láminas, tape el tubo e incube los tubos en un baño de agua durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Agite el tubo vigorosamente para separar el epitelio pigmentario retiniano (RPE) en pequeños grupos. La ausencia de grumos oscuros de células indica que la separación está completa.
Devuelva el tubo al baño de agua durante otros cinco minutos. Utilice un aplicador, pipeta y succión suave para eliminar los restos de tejido no digerido. Centrifugue las células en una centrífuga a 280 ×g durante cuatro minutos.
Elimine el sobrenadante. Ajuste el volumen final a nueve mililitros con medio RPE al 15 % mediante pipeta para resuspender. Transfiera tres mililitros de la suspensión celular a un matraz de 25 centímetros cuadrados mediante pipeta.
Añada dos mililitros de medio de cultivo fresco con temperatura ambiente y 15 % de RPE. Incube las células durante la noche a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. A medida que los cultivos maduren, su pigmentación aumentará tras tres o cuatro semanas.
Los cultivos exitosos serán confluentes y estarán uniformemente pigmentados de manera intensa. Acabamos de mostrarle cómo preparar cultivos primarios de RP fetal humano. Eso es todo.
Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.
Resumen
Este artículo presenta un método reproducible para el cultivo de células epiteliales pigmentarias retinianas fetales humanas (hfRPE) que imitan las características del tejido nativo adulto. Las células cultivadas se utilizan en estudios relacionados con diversas enfermedades oculares.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Oftalmología
Antecedentes
- El epitelio pigmentario retiniano (RPE) fetal humano desempeña un papel fundamental en la salud ocular.
- Las células del RPE participan en el ciclo visual y en el mantenimiento de la integridad retiniana.
- Comprender la fisiología del RPE es esencial para desarrollar intervenciones terapéuticas para enfermedades oculares.
- Los métodos actuales para estudiar el RPE están limitados por la disponibilidad de modelos adecuados.
Objetivo del estudio
- Establecer un método de cultivo confiable para células hfRPE.
- Crear un modelo para investigar enfermedades oculares humanas.
- Facilitar estudios in vitro y preclínicos sobre la función y la patología del epitelio pigmentario retiniano (RPE).
Métodos Utilizados
- Diseción de globos oculares humanos para aislar células del epitelio pigmentario de la retina (RPE).
- Cultivo de células RPE para formar monocapas confluentes.
- Uso de experimentos funcionales in vitro para evaluar la fisiología del RPE.
- Ensayos preclínicos en modelos animales para evaluar las respuestas del RPE.
Resultados principales
- Células hfRPE cultivadas con éxito que exhiben características similares a las adultas.
- Se demostró el potencial de estos cultivos para su uso en la modelización de enfermedades.
- Se obtuvieron conocimientos sobre la función de las células del epitelio pigmentario retiniano y las vías de señalización.
- Se estableció una base para futuras investigaciones terapéuticas dirigidas a enfermedades oculares.
Conclusiones
- El método descrito permite el estudio efectivo de la fisiología del epitelio pigmentario retiniano (RPE).
- Estas culturas pueden mejorar la comprensión de las enfermedades retinianas.
- La investigación futura puede basarse en este modelo para desarrollar nuevos tratamientos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los modelos in vitro robustos del epitelio pigmentario retiniano humano (RPE) son esenciales para reducir los riesgos en las primeras etapas del descubrimiento de fármacos oftálmicos y permitir la evaluación predictiva de hipótesis terapéuticas. El sistema de cultivo primario de hfRPE descrito proporciona una plataforma fisiológicamente relevante para investigar la función del RPE, los mecanismos de la enfermedad y las estrategias de intervención antes de los estudios en animales. Esta capacidad favorece la continuidad traslacional y la selección de carteras en las líneas de desarrollo de fármacos oculares.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la investigación mecanicista de vías específicas del epitelio pigmentario retiniano implicadas en enfermedades retinianas.
- Apoya la validación funcional de dianas al reproducir la polaridad y la actividad de transporte propias del epitelio pigmentario retiniano.
- Facilita la reducción de riesgos biológicos antes de avanzar a modelos animales.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Proporciona una fuente reproducible y escalable de monocapas de RPE humano para ensayos cuantitativos in vitro.
- Permite la estandarización de lecturas funcionales y genéticas relevantes para la salud retiniana.
- Facilita el desarrollo de ensayos para la selección de compuestos dirigidos a procesos mediados por el RPE.
Investigación Translacional y Preclínica
- Conecta hallazgos in vitro con modelos animales preclínicos para estudios de intervención terapéutica.
- Relaciona fenotipos celulares relevantes para la enfermedad con estrategias traslacionales de biomarcadores.
- Mejora la confianza predictiva para el avance de candidatos farmacéuticos oculares.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método de cultivo primario de hfRPE se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, permitiendo la comprobación de hipótesis, el desarrollo de ensayos y la validación traslacional para programas de enfermedades retinianas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la aclaración de vías y la reducción de riesgos mecanicistas de dianas relacionadas con el EPR.
- Cribado: Proporciona resultados cuantitativos estandarizados para la evaluación de compuestos en sistemas de EPR.
- Analítica: Ofrece mediciones morfológicas, fisiológicas y genéticas para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Garantiza la continuidad desde la validación in vitro hasta los modelos animales en estudios de enfermedades oculares.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para diversas necesidades de investigación y cribado centradas en el EPR.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos retinianos.
- Valor operativo: Permite flujos de trabajo estandarizados, reproducibles y escalables para el cultivo de epitelio pigmentario retiniano (RPE).
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital en carteras oftálmicas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de programas terapéuticos oculares.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en aislamiento de células primarias y técnicas de cultivo epitelial.
- Exige acceso a infraestructura especializada para disección, cultivo y obtención de imágenes.
- Necesita estandarización entre equipos para ensayos funcionales y genéticos.
- Puede requerir adaptación para diferentes fuentes de donantes o modelos de enfermedad.
- Depende de la disponibilidad de tejido fetal humano y del cumplimiento de las directrices éticas.
