PAR-Clip - un método para identificar transcriptoma en todo los sitios de unión de las proteínas de unión a ARN

El objetivo general de este procedimiento es determinar los sitios de unión a todo el transcriptoma de las proteínas de unión al ARN o RVP. Esto se logra utilizando primero análogos de nucleósidos fotorreactivos para el marcaje in vivo de transcripciones nacientes. El segundo paso del procedimiento es entrecruzar el ARN y las proteínas de unión al ARN mediante luz ultravioleta de 365 nanómetros.

El tercer paso del procedimiento es inmunoprecipitar la proteína de unión al ARN investigada y recuperar el enlace cruzado con el ARN. El paso final del procedimiento es convertir el ARN en una biblioteca CD NA y una secuencia profunda. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran los sitios de unión de todo el transcriptoma de los RVP y permiten la definición del elemento de reconocimiento de ARN y sus preferencias de unión.

Hola, mi nombre es Marcus Hoffner y pertenezco al laboratorio de Tom SEL en la Universidad Rockefeller de Nueva York. Hoy mostraremos un método llamado reticulación e inmunoprecipitación mejoradas de análogo de nucleósido de costilla fotoable o labio par. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para identificar en un transcriptoma por su escala los sitios de unión de las proteínas de unión al ARN y sus motivos y preferencias de unión.

Bien, comencemos. La reticulación UV in vivo comienza en una campana de flujo laminar. En este protocolo utilizaremos dos células BP one marcadas con IGF como modelo ejemplar utilizando técnica estéril.

Expandir las células HEK 2 93 que expresan de manera estable IGF marcado con bandera HA dos BP, una bajo el control de un represor de Tet en HEK 2 93 uso del medio de cultivo celular entre 100 y 400 veces 10 a las sextas células y hacerlas crecer hasta aproximadamente el 80% de fluidez cos. A las 14 horas antes de la reticulación, las células tenían el análogo de ribósido fotorreactivo para tio uridina o para SU directamente al medio de cultivo celular. Alternativamente, se puede usar la sexta guina o seis SG después de la adición del ribósido fotorreactivo para inducir la expresión del IGF marcado con bandera HA, dos BP, una por la adición de células de doxiciclina, luego se incuban durante la noche en la incubadora de células.

A continuación, decanta el medio de crecimiento. A continuación, lavar las células una vez con 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato helado por plato. A continuación, retire el PBS por completo mediante decantación.

Coloque las placas descubiertas en una bandeja con hielo e irradie con luz ultravioleta de 365 nanómetros en un straddle linker 2, reticulante de 400 UV o equivalente posterior a la radiación UV, raspe las celdas con un policía de goma en un mililitro de PBS por placa. Transfiera las celdas a tubos de centrifugación de 50 mililitros y centrifugue a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el nombre súper y conserve la bolita de celda.

En este punto, los gránulos de células se pueden congelar rápidamente en nitrógeno líquido y almacenarse a menos 80 durante al menos 12 meses. Para continuar con el procedimiento, suspenda el pellet en tres volúmenes de un tampón de lisis X NP 40 e incube en hielo durante 10 minutos. Aclarar el lisado celular por centrifugación a 13.000 g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.

Después de la centrifugación, limpie aún más el lisado filtrándolo a través de un filtro de jeringa de membrana de cinco micras. Por último, añadir los ARNs T one hasta una concentración final de una unidad por microlitro e incubar en un baño de agua a 22 grados centígrados durante 15 minutos. Posteriormente, enfríe la reacción en hielo durante cinco minutos.

Siguiendo la reticulación UV in vivo. Prepare las perlas magnéticas para la inmunoprecipitación. Transfiera 10 microlitros de partículas magnéticas de proteína G de perlas de dina por cada milésima de pulgada de lisado celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

A continuación, coloque el tubo que contiene las cuentas en un soporte magnético durante uno o dos minutos. Retire el sobrenadante y agregue un mililitro de tampón de fosfato de citrato al tubo mientras está en el separador magnético. A continuación, tape el tubo y agite la muestra para volver a suspender las perlas.

Centrifuga brevemente para recoger las perlas que queden en la tapa del tubo. Repita este lavado con un mililitro adicional de tampón de fosfato de citrato. Después del lavado resus, suspenda las perlas y el tampón de fosfato de citrato a un volumen dos veces el volumen original de la suspensión de remolacha.

A continuación, añada 0,25 miligramos de anticuerpo monoclonal Anti-Flag M dos por cada mililitro de suspensión de batido. Incubar la suspensión en una rueda giratoria durante 40 minutos a temperatura ambiente después de la incubación, lavar las perlas dos veces en un mililitro de tampón de fosfato de citrato como se ha descrito anteriormente, este lavado sirve para eliminar cualquier anticuerpo no unido después del lavado Resus, suspender las perlas y el tampón de fosfato de citrato como antes de cuatro. Para comenzar la inmunoprecipitación, agregue las perlas magnéticas conjugadas de anticuerpos recién preparadas a los ARN T one tratados con lisado de células.

Transfiera la mezcla a tubos de centrifugación de 15 mililitros y gire durante una hora a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, recoja las perlas magnéticas, deseche las perlas de resuspensión sobrenadante en un mililitro de tampón de lavado IP y transfiéralas a tubos de centrífuga de 1,5 mililitros. Lave las perlas como se describió anteriormente dos veces en un mililitro de tampón de lavado IP.

Después del lavado final, vuelva a suspender las perlas en el volumen de perlas original del tampón de lavado IP. A continuación, añada RNAT uno hasta una concentración final de 100 unidades por microlitro. Incube la suspensión de perlas en un baño de agua a 22 grados centígrados durante 15 minutos.

Posteriormente, enfríe la suspensión sobre hielo durante cinco minutos. A continuación, lave las perlas tres veces en un mililitro de tampón de lavado con alto contenido de sal. A continuación, vuelva a suspender las perlas en un volumen de perlas original de tampón de desfosforilación.

Añadir fosfatasa alcalina intestinal de ternera hasta una concentración final de 0,5 unidades por microlitro e incubar la suspensión durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Lave las perlas dos veces en un mililitro de tampón de lavado de fosfatasa y luego dos veces más en tampón de polinucleótido quinasa o PNK sin DTT. Por último, vuelva a suspender las cuentas en un volumen de cuentas original del búfer PNK.

Para comenzar el marcaje radioeléctrico del ARN reticulado. Añada gamma 32 PATP y T four PNK a un volumen de perla original de la suspensión de perlas recién preparada. Incubar la suspensión durante 30 minutos a 37 grados centígrados.

A continuación, agregue un TP no radiactivo a la suspensión e incube durante otros cinco minutos a 37 grados centígrados. A continuación, lavar las perlas magnéticas cinco veces con 800 microlitros de tampón PNK sin TDT. Por último, vuelva a suspender las cuentas en 70 microlitros de hoja SDS.

El tampón de carga incuba la suspensión de radioetiquetas durante cinco minutos en un bloque de calor a 95 grados centígrados para desnaturalizar y liberar las proteínas de unión al ARN inmunoprecipitado con el ARN reticulado. A continuación, retire las perlas magnéticas del separador y transfiera la super natin a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mililitros; Cargue 40 microlitros de suade por pocillo de un gel de poliacrilamida prefabricado novox bis triss cuatro al 12%; y haga funcionar el gel durante 55 minutos a 200 voltios. Una vez que el gel se haya agotado, desmonte la cámara de gel y desmonte las placas, dejando el gel montado en una placa para facilitar la alineación del gel con la impresión del papel del generador de imágenes de fósforo.

Implante tres pequeñas piezas de gel radiactivo de forma asimétrica en las esquinas del gel. Envuelva el gel en una película de plástico como la envoltura de Saran para evitar la contaminación. Exponga el gel a una pantalla de generador de imágenes de fósforo en blanco durante una hora y lo coloque en un generador de imágenes de fósforo.

A continuación, alinee el gel en la parte superior de la impresión del generador de imágenes de fósforo utilizando las piezas de gel implantadas para orientarse. Corte las bandas que corresponden al tamaño esperado de la proteína de unión al ARN o RBP. Transfiera las bandas a un tubo MIDI de dializador dtu y agregue 800 microlitros de un electroeluto de tampón de ejecución XSDS.

El complejo R-N-A-R-B-P reticulado a 100 voltios durante dos horas según las instrucciones del fabricante. Posterior a la electroelución. Agregue el tampón de proteinasa K y la proteinasa K e incube la solución durante 30 minutos a 55 grados centígrados.

Recuperar el ARN mediante extracción de fenol ácido cloroformo isoamílico extracción con alcohol, seguida de una extracción con cloroformo. A continuación, se añade un microlitro de glucógeno y se precipita el ARN añadiendo tres volúmenes de etanol. Finalmente disuelva el pellet resultante en 10,5 microlitros de agua.

Una vez que se haya recuperado el ARN, llévelo a través de un protocolo estándar de preparación de bibliotecas CDNA y realice un análisis bioinformático cuidadoso de las lecturas de secuencias. Se muestran resultados representativos para un clip par realizado con células HK 2 93 que expresan IGF marcado con bandera H ha, dos BP uno, con los análogos de nucleósidos fotorreactivos cuatro SU y seis SG, la eficiencia de reticulación del ribósido fotoreactivo alternativo seis SG es generalmente menor que para cuatro su. La menor eficiencia de reticulación podría dar lugar a un mayor fondo de secuencias derivadas de fragmentos de ARN celular abundantes y, por lo tanto, se deberían utilizar inicialmente más células para el experimento.

Se comparan diferentes análogos de uridina fotorreactivos par clip con la reticulación tradicional UV 2 de 54 nanómetros o clip, como se ve aquí. La reticulación de proteínas de ARN UV 2 de 54 nanómetros tiene una eficiencia de reticulación limitada. La intensidad de la banda radiactiva del tamaño adecuado indica si el experimento de clip par ha funcionado y si se ha aislado suficiente ARN para llevar a cabo un pequeño protocolo de secuenciación de ARN.

Las frecuencias de mutaciones características en las lecturas secuenciadas después del análisis bioinformático son indicativas de secuencias reticuladas exitosas. Estas mutaciones son transiciones T dos C cuando se usan cuatro SU y G dos transiciones A cuando se usa el éxito. G.La característica definitoria del labio de parque es la posibilidad de derivar la ubicación del enlace cruzado mediante la puntuación de una mutación característica que reside en las bibliotecas de CD NA preparadas a partir de los ARN recuperados.

Esto permite la fácil separación de la señal derivada de ARN específicamente unidos, del ruido de las secuencias derivadas de fragmentos coaislados de abundantes ARN celulares. Así que hoy te hemos mostrado cómo aislar segmentos de ARN, específicamente reconocidos por las proteínas de unión al ARN. Al realizar este procedimiento.

Es importante trabajar sin ARN. Así que eso fue todo. Gracias por mirar y buena suerte con los experimentos.