Axoplasma de aislamiento de nervio ciático de rata
24 de septiembre de 2010
Demostramos un protocolo para el aislamiento de axoplasma del nervio ciático de rata adulta basada en la disección de los fascículos nerviosos y la incubación en un medio hipotónico para liberar la mielina y la lisis no axonal estructuras, seguido de la extracción del resto del axón material enriquecido.
El objetivo general de este procedimiento es aislar el citoplasma axonal puro o ectoplasma del nervio periférico. Esto se logra diseccionando primero el nervio ciático. El segundo paso del procedimiento es extirpar el tejido conectivo del nervio y separar los gles.
El tercer paso del procedimiento es la incubación de segmentos cortos de nervios en medio hipotónico. El paso final del procedimiento es la incubación en solución isotónica, la centrifugación y el opsm milian. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran un alto grado de enriquecimiento de los componentes axonales mediante el análisis de Western blot.
Hola, mi nombre es yo, Elle y puedo Rosenbaum. Somos del laboratorio del Profesor Mike F, Departamento de Trabajo de Química Biológica, con sede en el Instituto de Ciencias. Hoy vamos a representar una nueva técnica de Mesilación Oxy Opat.
La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes como el exprimido manual OIS del nervio periférico. Es decir, que este procedimiento reduce la contaminación sérica y glos llega a los contenidos axonales. Hemos utilizado esta nueva técnica para la metilación de OPLas para explorar la retroseñalización basada en D después de una lesión del nervio ciático.
Así que comencemos. Coloque una de las dos ratas wistar eutanasiadas de ocho a 10 semanas de edad de lado sobre una colchoneta de disección para un acercamiento directo a la parte distal del nervio ciático. Afeitar la piel a la altura de la mitad del muslo y cambiarla bien por etanol al 70%.
Usa unas tijeras para cortar la piel del muslo. Corta con cuidado la grasa y el tejido conectivo entre el bíceps femoral y los músculos glúteos superficiales. Use fórceps para levantar la región expuesta del nervio ciático y extraerla.
La sección eliminada tendrá aproximadamente 1,5 centímetros de largo. Transfiera el nervio a 500 microlitros de PBS 2X helado con inhibidores de la proteasa en un tubo de microcentrífuga. Mantenga el tubo en hielo.
Repita el procedimiento de disección en el otro lado de la rata y en ambos lados de una segunda rata. Rasque el fondo de una placa de Petri con una pipeta pastelera y llénela con dos mililitros de temperatura ambiente. Punto dos X PB s con inhibidores de la proteasa.
Transfiera un solo nervio a la placa bajo el microscopio de disección. Use pinzas finas para extraer el epi nearium del nervio tirando de él y deséchelo, dejando las faciles en el plato. Separe con cuidado las instalaciones entre sí y el fondo del plato.
Las fales individuales se volverán turbias y flotarán en la superficie de la solución. Transfiera inmediatamente los fales separados a un tubo de microcentrífuga que contenga 500 microlitros de 0,2 X PB s con inhibidores de la proteasa. Mantenga las láminas en hielo.
Separe y recoja las correas de la ciática restante en el tubo con práctica. Extirpación del epineuro y separación de los gles. No debe tomar más de 10 minutos por nervio.
Retire el tubo que contiene el SLES separado del hielo. Incubar durante dos horas a temperatura ambiente para liberar mielina y piojos estructuras no axonales. Lave las sles para cada lavado.
Use fórceps para levantar suavemente los dientes y transfiéralos a un tubo nuevo que contenga un mililitro de 2X PB s con inhibidores de la proteasa. Agite el tubo en un balancín durante cinco minutos. Lave el SLES de esta manera tres veces después del lavado.
Transfiera el SLES a un tubo de einor vacío para eliminar el exceso de líquido y luego transfiéralo a un tubo que contenga 300 microlitros de un XPBS con inhibidores de proteus incube a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. Para eluir el opsm, las concentraciones más altas de sal interfieren con otros procedimientos proteómicos. Centrifugar el fascículo a 10.000 queso durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para granular el tejido y los restos celulares pipetear el sobrenadante en un tubo de einor limpio.
El sobrenadante obtenido. Debe quedar claro. Utilice un espectrofotómetro para medir la concentración de proteínas.
Se debe obtener un rendimiento de 200 a 250 microgramos de proteína. Almacene la preparación de plasma óptico en alícuotas a menos 80 grados Celsius durante un máximo de seis meses. Evite los ciclos de descongelación y congelación.
A continuación se muestra un bloque occidental que compara el plasma op aislado por el método de compresión manual con muestras de opsm aisladas como se muestra en este protocolo. Obsérvese los niveles reducidos de albúmina y GFAP, que representan las contaminaciones de las proteínas sanguíneas y las células gliales, respectivamente. Por el contrario, la tubulina axonal beta tres está enriquecida en esta preparación, lo que indica un alto nivel de proteínas axonales.
Después de ver todo este video, deberías tener una buena comprensión de cómo diseccionar el nervio sático y cómo separar a Paco correctamente. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.
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Visión general
Este artículo presenta un protocolo detallado para aislar el axoplasma del nervio ciático de rata adulta. El método implica la disección de fascículos nerviosos y la incubación en un medio hipotónico para liberar eficazmente la mielina y lisar estructuras no axonales, lo que conduce a la extracción de material enriquecido en axones.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Investigación axonal
Antecedentes
- El aislamiento del citoplasma axonal es crucial para estudiar la función neuronal.
- El nervio ciático sirve como modelo para estudios de nervios periféricos.
- Comprender los componentes axonales puede ayudar en la investigación neurológica.
- Los métodos anteriores pueden no producir material axonal puro.
Propósito del estudio
- Desarrollar un protocolo confiable para el aislamiento de axoplasma.
- Mejorar la pureza del citoplasma axonal para un análisis adicional.
- Facilitar el estudio de los componentes axonales utilizando técnicas bioquímicas.
Métodos utilizados
- Disección del nervio ciático para acceder a los fascículos nerviosos.
- Remoción del tejido conectivo que rodea el nervio.
- Incubación de segmentos nerviosos en un medio hipotónico.
- Centrifugación y posterior incubación en solución isotónica.
Principales resultados
- El protocolo aísla con éxito el citoplasma axonal.
- El análisis de Western blot confirma un alto enriquecimiento de componentes axonales.
- Los resultados demuestran la efectividad del método.
- Se destacan las posibles aplicaciones en el estudio de la biología axonal.
Conclusiones
- Este método proporciona un enfoque robusto para el aislamiento de axoplasma.
- Puede ser utilizado en varios estudios relacionados con la función neuronal.
- Los hallazgos contribuyen a la comprensión de la estructura y función axonal.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Isolation of pure axonal cytoplasm enables mechanistic de-risking in target validation for neurodegenerative disease programs. This protocol supports predictive confidence by reducing biological noise from non-axonal contaminants in peripheral nerve models. It provides a disease-relevant system for studying axonal signaling pathways relevant to neurotherapeutic discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of axonal protein composition to clarify therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Reduces glial and serum contamination that obscures target engagement signals.
- Predictive Value: Supports functional target validation through enrichment of axonal components like tubulin beta three.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized axon-enriched lysates suitable for biochemical screening.
- Quantitative Output: Permits spectrophotometric protein concentration measurement for normalization.
- Reproducibility: Consistent yield of 200-250 micrograms supports reliable compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models peripheral nerve injury and retrograde signaling after sciatic nerve trauma.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation of axonal biology targets.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates go/no-go decisions based on axonal target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation of axonal modulators.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating axonal cytoplasm for proteomic profiling.
- Screening: Enables preparation of standardized lysates for compound effect assessment.
- Analytics: Western blot analysis provides quantitative readouts for axonal enrichment.
- Translational Research: Connects to retrograde signaling studies relevant to nerve injury models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for peripheral nerve target de-risking.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through high enrichment of axonal components and reduced contaminant signals.
- Operational Value: Standardized dissection and incubation steps ensure reproducibility across labs.
- Strategic Value: Better target prioritization by minimizing false positives from glial or blood proteins.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted advancement of neurotherapeutic candidates based on clean axonal readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in peripheral nerve dissection and sterile technique.
- Needs centrifuge, spectrophotometer, and protease inhibitor infrastructure.
- Demands standardization of hypotonic incubation timing across operators.
- Adaptation considerations for other nerve types or species beyond rat sciatic nerve.
- Practical limitation: Procedure duration limits high-throughput application without automation.
