Axoplasma de aislamiento de nervio ciático de rata
24 de septiembre de 2010
Demostramos un protocolo para el aislamiento de axoplasma del nervio ciático de rata adulta basada en la disección de los fascículos nerviosos y la incubación en un medio hipotónico para liberar la mielina y la lisis no axonal estructuras, seguido de la extracción del resto del axón material enriquecido.
El objetivo general de este procedimiento es aislar citoplasma axonal puro o ectoplasma del nervio periférico. Esto se logra primero mediante la disección del nervio ciático. El segundo paso del procedimiento consiste en eliminar el tejido conectivo del nervio y separar los fascículos.
El tercer paso del procedimiento es la incubación de segmentos cortos de láminas nerviosas en medio hipotónico. El paso final del procedimiento es la incubación en solución isotónica, centrifugación y opsm milian. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran un alto grado de enriquecimiento de componentes axonales mediante análisis por inmunotransferencia (western blot).
Hola, mi nombre es I, Elle And I may Rosenbaum. Somos del laboratorio del profesor Mike F Labor, Departamento de Química Biológica del Instituto de Ciencias. Hoy vamos a presentar una nueva técnica de metilación Oxi Opat.
La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la extrusión manual de OIS de nervio periférico, es que este procedimiento reduce la contaminación por suero y glóbulos y alcanza contenidos axonales. Hemos utilizado esta nueva técnica para el análisis de metilación de PLAs con el fin de explorar la señalización retrógrada dependiente de D tras una lesión del nervio ciático.
Entonces, comencemos. Coloque uno de los dos ratas Wistar sacrificadas de ocho a 10 semanas de edad sobre su costado en una bandeja de disección para acceder directamente a la parte distal del nervio ciático. Afeite la piel en la mitad del muslo y limpie a fondo con etanol al 70%.
Utilice tijeras para cortar y retirar la piel del muslo. Corte cuidadosamente a través de la grasa y del tejido conectivo entre los músculos bíceps femoral y glúteo superficial. Utilice pinzas para levantar la región expuesta del nervio ciático y extráigalo.
La sección eliminada tendrá aproximadamente 1,5 centímetros de longitud. Transfiera el nervio a 500 µL de PBS 2X frío con inhibidores de proteasas en un tubo de microcentrífuga. Mantenga el tubo en hielo.
Repita el procedimiento de disección en el otro lado de la rata y en ambos lados de una segunda rata. Rasque el fondo de una placa de Petri con una pipeta Pasteur y llénela con dos mililitros de PBS 0,2 X a temperatura ambiente con inhibidores de proteasas.
Transfiera un solo nervio al recipiente bajo el microscopio estereoscópico. Utilice pinzas finas para eliminar el epineuro del nervio tirando de él y deseche esta parte, dejando los fascículos en el recipiente. Separe cuidadosamente los fascículos entre sí y del fondo del recipiente.
Las fálulas individuales se volverán turbias y flotarán en la superficie de la solución. Transfiera inmediatamente las fálulas separadas a un tubo de microcentrífuga que contenga 500 microlitros de PB 0,2 X con inhibidores de proteasas. Mantenga los tubos en hielo.
Separar y recolectar los SLES del nervio ciático restante en el tubo con práctica. La eliminación del epineuro y la separación de los SLES no debe llevar más de 10 minutos por nervio.
Retire el tubo que contiene el SLES separado del hielo. Incube durante dos horas a temperatura ambiente para liberar la mielina y las estructuras no axonales. Lave el SLES en cada lavado.
Utilice pinzas para levantar suavemente los SLES y transfiéralos a un tubo nuevo que contenga un mililitro de PBS 2X con inhibidores de proteasas. Agite el tubo en un agitador rotatorio durante cinco minutos. Lave los SLES de esta manera tres veces después del lavado.
Transfiera el SLES a un tubo eppendorf nuevo y vacío para eliminar el exceso de líquido y luego transfiéralo a un tubo que contenga 300 microlitros de un XPBS con inhibidores de proteasas; incube a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. Para eluir el opsm, concentraciones más altas de sal interfieren con procedimientos posteriores de proteómica. Centrifugue el fascículo a 10.000 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius para sedimentar el tejido y los restos celulares; retire el sobrenadante con una pipeta y colóquelo en un tubo eppendorf limpio.
Se obtuvo el sobrenadante. Debe estar claro. Utilice un espectrofotómetro para medir la concentración de proteína.
Se debería obtener un rendimiento de 200 a 250 microgramos de proteína. Almacene la preparación del plásmido op en alícuotas a menos 80 grados Celsius durante hasta seis meses. Evite los ciclos de descongelación y congelación.
Aquí se muestra un bloqueo occidental que compara el plásmido op aislado mediante el método manual de compresión con muestras de opsm aisladas según se indica en este protocolo. Obsérvense los niveles reducidos de albúmina y GFAP, que representan contaminaciones por proteínas sanguíneas y células gliales, respectivamente. En contraste, la tubulina axonal beta tres está enriquecida en esta preparación, lo que indica un alto nivel de proteínas axonales.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseccionar el nervio ciático y cómo separar Paco adecuadamente. Eso es todo. Gracias por verlo y buena suerte con sus experimentos.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo detallado para aislar axoplasma del nervio ciático de rata adulta. El método implica la disección de fascículos nerviosos y la incubación en un medio hipotónico para liberar eficazmente la mielina y lisar estructuras no axónicas, lo que permite la extracción de material enriquecido en axones.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Celular
- Investigación Axonal
Antecedentes
- El aislamiento del citoplasma axonal es fundamental para estudiar la función neuronal.
- El nervio ciático sirve como modelo para estudios de nervios periféricos.
- Comprender los componentes axonales puede contribuir a la investigación neurológica.
- Los métodos anteriores podrían no producir material axonal puro.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo confiable para el aislamiento de axoplasma.
- Mejorar la pureza del citoplasma axonal para su posterior análisis.
- Facilitar el estudio de los componentes axonales mediante técnicas bioquímicas.
Métodos Utilizados
- Diseción del nervio ciático para acceder a los fascículos nerviosos.
- Eliminación del tejido conectivo que rodea el nervio.
- Incubación de segmentos nerviosos en un medio hipotónico.
- Posterior centrifugación e incubación en solución isotónica.
Resultados principales
- El protocolo aísla con éxito el citoplasma axonal.
- El análisis mediante inmunotransferencia confirma un alto enriquecimiento de componentes axonales.
- Los resultados demuestran la eficacia del método.
- Se destacan aplicaciones potenciales en el estudio de la biología axonal.
Conclusiones
- Este método proporciona un enfoque robusto para el aislamiento de axoplasma.
- Puede utilizarse en diversos estudios relacionados con la función neuronal.
- Los hallazgos contribuyen a la comprensión de la estructura y función axonal.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento del citoplasma axonal puro permite la reducción mecanicista de riesgos en la validación de dianas para programas de enfermedades neurodegenerativas. Este protocolo favorece la confianza predictiva al reducir el ruido biológico proveniente de contaminantes no axonales en modelos de nervios periféricos. Proporciona un sistema relevante para la enfermedad, útil para estudiar vías de señalización axonal relacionadas con el descubrimiento de neuroterapéuticos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la composición proteica axonal para aclarar hipótesis terapéuticas.
- Valor operativo: Reduce la contaminación por glía y suero que oscurece las señales de interacción con el blanco.
- Valor predictivo: Apoya la validación funcional del blanco mediante el enriquecimiento de componentes axonales como la tubulina beta tres.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Listos para ensayo: Produce lisados enriquecidos en axones estandarizados adecuados para cribado bioquímico.
- Resultado cuantitativo: Permite la medición espectrofotométrica de la concentración de proteína para normalización.
- Reproducibilidad: Rendimiento constante de 200-250 microgramos que respalda un cribado confiable de compuestos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela la lesión del nervio periférico y la señalización retrógrada tras un trauma del nervio ciático.
- Continuidad traslacional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica de dianas en la biología axonal.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Facilita las decisiones de continuar o no continuar basadas en la modulación de dianas axonales.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la validación preclínica de moduladores axonales.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la aclaración de vías mediante el aislamiento del citoplasma axonal para el perfilado proteómico.
- Cribado: Permite la preparación de lisados estandarizados para la evaluación del efecto de compuestos.
- Análisis: El análisis por inmunotransferencia (Western blot) proporciona lecturas cuantitativas para el enriquecimiento axonal.
- Investigación Traducional: Se relaciona con estudios de señalización retrógrada relevantes para modelos de lesión nerviosa.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la reducción de riesgos en dianas de nervios periféricos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva mediante un alto enriquecimiento de componentes axonales y una reducción de señales de contaminantes.
- Valor operativo: Pasos estandarizados de disección e incubación garantizan la reproducibilidad entre laboratorios.
- Valor estratégico: Mejor priorización de objetivos al minimizar los falsos positivos procedentes de proteínas gliales o sanguíneas.
- Impacto en la cartera: Avance ajustado al riesgo de candidatos neuroterapéuticos basado en lecturas axonales limpias.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la disección de nervios periféricos y en técnicas estériles.
- Necesita disponer de infraestructura con centrífuga, espectrofotómetro e inhibidores de proteasas.
- Exige la estandarización del tiempo de incubación hipotónica entre diferentes operadores.
- Consideraciones para la adaptación a otros tipos de nervios o especies distintas del nervio ciático de rata.
- Limitación práctica: la duración del procedimiento limita su aplicación de alto rendimiento sin automatización.
