Name: Axoplasma de aislamiento de nervio ciático de rata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Aprenda a aislar axoplasma de nervio ciático de rata mediante disección de fascículos e incubación en medio hipotónico. Este protocolo purifica citoplasma axonal para estudios de neurociencia y biología celular.

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Este protocolo permite el aislamiento axoplasma con la minimización de la contaminación de los tejidos gliales y vasculares. El método de producción de aproximadamente 70-100 mg de proteína total por axoplasma un 80-10 semanas de edad, la rata Wistar. 1. Disecar los nervios ciáticos <ol><li> La eutanasia a dos ratas por inhalación de CO 2 seguido por dislocación cervical. Confirmar la muerte mediante la palpación de la falta de ritmo cardíaco antes de la disección principio. </li><li> Limpie el área de disección con etanol al 70%. </li><li> Cortar la piel, los músculos separar y aislar el nervio ciático con tijeras y pinzas con cuidado, sin dañar los vasos sanguíneos. Diseccionar los nervios ciáticos (alrededor de 1,5 cm cada uno) de cada animal y recoger los cuatro nervios en un eppendorf con 500 l de PBS 0,2 X + inhibidores, se mantuvo en hielo. </li><li> La transferencia de los segmentos de los nervios a los platos de plástico que contienen al menos 2 ml de PBS 0,2 X + inhibidores de la proteasa. </li><li> Retire el epineuro de los nervios usando unas pinzas finas en el ámbito binocular. Separar los fascículos con mucho cuidado hasta que se enturbie y comienzan a flotar en la superficie de la solución. Este paso debe ser practicado hasta que pueda llevarse a cabo con rapidez y precisión (no tomar más de 10 minutos por los nervios). </li></ol> 2. Incubación, lavado y elución <ol><li> Transferencia de fascículos separados a un tubo Eppendorf con 500 l de PBS 0,2 X contiene inhibidores de la proteasa para la incubación durante 2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Lavado por lo menos 3 veces con 1 ml del mismo tampón mediante la transferencia de los fascículos del tubo eppendorf al tubo eppendorf y agitar durante 5 min después de la transferencia. </li><li> Para eliminar el exceso de fluido que los fascículos en un nuevo tubo eppendorf vacío y luego transferir los fascículos a un nuevo tubo eppendorf con 300 L de PBS 1X que contiene inhibidor de la proteasa para la incubación durante 20-30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar 10 minutos a 10.000 xga 4 ° C. </li><li> Tomar el sobrenadante y medir la concentración de proteínas. Esta es su preparación axoplasma. </li></ol> 3. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2087/2087fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Axoplasma Western blot comparar aislados por el método de apriete manual con las muestras de axoplasma aislado como se muestra en este protocolo. Tenga en cuenta la reducción de los niveles de albúmina y GFAP, en representación de proteína de la sangre y la contaminación de células gliales, respectivamente. Por el contrario, axonal tubulina b3 se enriquece en esta preparación, lo que indica un alto nivel de proteínas axonal.

<ol><li>Hanz, S., Perlson, E., Willis, D., Zheng, J. Q., Massarwa, R., Huerta, J. J., Koltzenburg, M., Kohler, M., van-Minnen, J., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasmic+importins+enable+retrograde+injury+signaling+in+lesioned+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve.</a> Neuron. 40, 1095-1104 (2003).</li>
<li>Michaelevski, I., Medzihradszky, K. F., Lynn, A., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+proteomics+reveals+mobilization+of+translation+machinery+to+the+lesion+site+in+injured+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Axonal transport proteomics reveals mobilization of translation machinery to the lesion site in injured sciatic nerve.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (5), 976-987 (2010).</li>
<li>Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasm+isolation+from+peripheral+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Axoplasm isolation from peripheral nerve.</a> Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).</li>
<li>Twiss, J. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomes+in+axons--scrounging+from+the+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosomes in axons--scrounging from the neighbors.</a> Trends Cell Biol. 19, 236-243 (2009).</li>
</ol>

Los análisis bioquímicos y proteómica han confirmado que este procedimiento reduce la contaminación de células gliales en suero y 3 en comparación con los métodos descritos anteriormente para el aislamiento de axoplasma por presión mecánica 1. Hemos utilizado este protocolo de aislamiento para explorar axoplasma dineína basado en la señalización retrógrada después de la lesión del nervio ciático 2, y esperamos que tenga utilidad en la exploración de muchos otros procesos en los nervios p...

<ul><li> Ratas Wistar macho (8-10 semanas de edad) </li><li> PBS 0,2 X y PBS 1X soluciones que contienen inhibidores de la proteasa (Roshe) 2 comprimidos por 50 ml </li><li> Eppendorfs de 1,5 ml </li><li> Esterilizados platos de plástico de 35 mm </li><li> Herramientas de disección como: tijeras y unas pinzas finas </li><li> Binocular y mesa de luz </li></ul> Anticuerpos Mouse anti-GFAP clon GA-5 fue de Sigma (G6171). Conejo anti-albúmina fue de Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-tubulina β3 y de conejo anti-Gerk fueron de Sigma (T2200 y M5670, respectivamente).

axoplasma de aislamiento de nervio ciático de rata

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

El aislamiento de citoplasma pura axonal (axoplasma) de los nervios periféricos es crucial para los estudios bioquímicos de muchos procesos biológicos. En este artículo, demostrar y describir un protocolo para el aislamiento de axoplasma del nervio ciático de rata adulta sobre la base de los siguientes pasos: (1) la disección de los fascículos nerviosos y la separación del tejido conectivo, (2) la incubación de segmentos cortos de fascículos nerviosos en medio hipotónico para liberar la mielina y la lisis no axonal estructuras, y (3) la extracción del resto del axón material enriquecido. Caracterización proteómica y bioquímica de esta preparación ha confirmado un alto grado de enriquecimiento para los componentes axonal.

Demostramos un protocolo para el aislamiento de axoplasma del nervio ciático de rata adulta basada en la disección de los fascículos nerviosos y la incubación en un medio hipotónico para liberar la mielina y la lisis no axonal estructuras, seguido de la extracción del resto del axón material enriquecido.

Axoplasma de aislamiento de nervio ciático de rata

El aislamiento de citoplasma axonal puro (axoplasma) a partir de nervios periféricos es fundamental para los estudios bioquímicos de numerosos procesos biológicos. En este artículo, nosotros...

El objetivo general de este procedimiento es aislar citoplasma axonal puro o ectoplasma del nervio periférico. Esto se logra primero mediante la disección del nervio ciático. El segundo paso del procedimiento consiste en eliminar el tejido conectivo del nervio y separar los fascículos.El tercer paso del procedimiento es la incubación de segmentos cortos de láminas nerviosas en medio hipotónico. El paso final del procedimiento es la incubación en solución isotónica, centrifugación y opsm milian. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran un alto grado de enriquecimiento de componentes axonales mediante análisis por inmunotransferencia (western blot).Hola, mi nombre es I, Elle And I may Rosenbaum. Somos del laboratorio del profesor Mike F Labor, Departamento de Química Biológica del Instituto de Ciencias. Hoy vamos a presentar una nueva técnica de metilación Oxi Opat.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la extrusión manual de OIS de nervio periférico, es que este procedimiento reduce la contaminación por suero y glóbulos y alcanza contenidos axonales. Hemos utilizado esta nueva técnica para el análisis de metilación de PLAs co

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Debido a la simplicidad de la cirugía y el resultado del comportamiento robusto, constricción crónica del nervio ciático es uno de los modelos animales de pre-eminentes de dolor neuropático. Dentro de las 24 horas siguientes a la cirugía, la hipersensibilidad del dolor se establece y se puede medir cuantitativamente utilizando una de von Frey aesthesiometer (ensayos mecánicos) y el medidor de la analgesia plantar (ensayo térmico).

La constricción crónica del nervio ciático y pruebas de hipersensibilidad dolor en ratas

Este video describe el aislamiento y cultivo de células de Schwann de raíces espinales de ratón. A continuación, las células aisladas se cultivan en medios específicos. Las células de Schwann se aíslan mediante digestión diferencial y adherencia. Posteriormente se transfieren a cubreobjetos recubiertos de matriz extracelular para su fijación y proliferación.

Aislamiento de células de Schwann de raíces espinales de ratón

Este video muestra un método para aislar células de Schwann de fibras del nervio ciático de ratón.

Separación magnética de las células de Schwann de los nervios ciáticos de ratón

Este video muestra una grabación de una sola fibra de la conducción nerviosa de la fibra C en ratas. Se incide una incisión en una rata anestesiada para exponer el nervio ciático, que proporciona suministro sensorial y motor a las extremidades inferiores. A continuación, se exponen las fibras C individuales. La estimulación eléctrica se proporciona mediante electrodos de estímulo implantados en el pie, y se registra una respuesta a partir de una sola fibra nerviosa.

Registro in vivo de fibras C del nervio ciático en ratas

Aquí, presentamos una técnica in vivo para la transferencia de genes a células de Schwann (SC) en el nervio ciático de roedores. Esta sencilla técnica es útil para investigar los mecanismos de señalización implicados en el desarrollo y mantenimiento de las SC mielinizantes.

En Vivo Transferencia de genes a células de Schwann en el nervio ciático de roedores mediante electroporación

Aquí, presentamos un protocolo para la extrusión hidráulica de la médula espinal, así como la identificación y el aislamiento de ganglios específicos de la raíz dorsal (DRG) en el mismo roedor. En comparación con los métodos estándar de aislamiento de la médula espinal, este método es significativamente más rápido y reduce el riesgo de daño tisular.

Extrusión hidráulica de la médula espinal y aislamiento de los ganglios de la raíz dorsal en roedores

La grabación de una sola fibra es una técnica electrofisiológica eficaz que es aplicable a los sistemas nerviosos central y periférico. Junto con la preparación de DRG intacto con el nervio ciático adjunto, se examina el mecanismo de falla de conducción. Ambos protocolos mejoran la comprensión de la relación del sistema nervioso periférico con el dolor.

Uso de la grabación de una sola fibra In Vivo y el ganglio de raíz dorsal intacto con nervio ciático adjunto para examinar el mecanismo de falla de conducción

Este método permite el registro de la fuerza de contracciones de contracción y tetánicas y potencial de acción en tres tipos de unidades motoras en el músculo gastrocnemius medial de rata. El aislamiento funcional de una sola unidad de motor es inducido por la estimulación eléctrica del axón.

Aislamiento funcional de unidades de motor único de Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Este protocolo describe la preparación de tejido nervioso ciático entero de rata para la estimulación electrofisiológica ex vivo y el registro en un baño salino perfundido de dos compartimentos, regulado ambientalmente.

Preparación del nervio ciático de rata para neurofisiología ex vivo

En el sistema de cocultivo de los ganglios de la raíz dorsal y las células de Schwann, se puede estudiar la mielinización del sistema nervioso periférico. Este modelo proporciona oportunidades experimentales para observar y cuantificar la mielinización periférica y estudiar los efectos de compuestos de interés en la vaina de mielina.

Mielinización in vitro de axones periféricos en un cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal de rata y células de Schwann

Aprenda a aislar axoplasma de nervio ciático de rata mediante disección de fascículos e incubación en medio hipotónico. Este protocolo purifica citoplasma axonal para estudios de neurociencia y biología celular.

Axoplasma de aislamiento de nervio ciático de rata

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