Edición génica mediada por transposones PiggyBac en iPSC humanas: un procedimiento para integrar genes de interés en iPSC humanas utilizando el sistema de transposones PiggyBac

Enjuague el cultivo de iPSC humano con PBS libre de calcio y magnesio, antes de tratar las células con reactivo de disociación celular durante 5 a 10 minutos a 37 grados Celsius. Cuando las células hayan comenzado a desprenderse del recipiente de cultivo, utilice una pipeta P1000 para disociar manualmente las células de 3 a 4 veces.

Transfiera las células a un tubo de 15 mililitros y eleve el volumen final a 10 mililitros con PBS fresco sin calcio ni magnesio, para contar. Recoja 1 x 10⁶ celdas por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros de tampón R del kit de electroporación.

Agregue 4,5 microgramos de ADN plasmídico vectorial transponible y 0,5 microgramos de ADN plasmídico transposasa PiggyBac para la transfección. Transfectar con el sistema de electroporación de celda según las instrucciones del fabricante, con los parámetros indicados. Entonces. Siembre las células en medio iPSC humano suplementado con 10 micromolares inhibidor de ROCK Y-27632 en un plato recubierto de matriz de 6 milímetros.