Detección por inmunofluorescencia de dos análogos de la timidina (CldU y UDI) en los tejidos de Primaria
7 de diciembre de 2010
Hemos derivado una estrategia para detectar la incorporación secuencial de los análogos de la timidina (CldU y UDI) en los tejidos de ratones adultos para cuantificar dos rondas sucesivas de la división celular. Esta estrategia es útil para detectar la renovación celular de larga duración, los tejidos, la transformación oncogénica, o células de amplificación de tránsito.
Hola y bienvenidos al protocolo de tinción Calor D-U-I-D-U. Hoy nuestro video comenzará con el paso tres: rehidratación, permeabilización y recuperación de antígenos. Comience cargando sus portaobjetos en el portador.
Una vez que sus portaobjetos estén cargados, colóquelos en un baño de xileno durante cinco minutos. A continuación, realice un segundo baño de xileno, también durante cinco minutos.
Continúe rehidratando sus portaobjetos trasladándolos a una solución de etanol, comenzando con la solución al 100 % y finalizando en el 50 %. Luego, complete la rehidratación de los portaobjetos colocándolos durante cinco minutos en una solución de XPBS para permeabilizar las membranas celulares. Sumerja sus portaobjetos en una solución al 0,2 % de Triton X durante cinco minutos. Prepare sus portaobjetos para la recuperación de antígenos tisulares mediante microondas colocándolos en un recipiente de vidrio con un volumen suficiente de tampón de citrato de sodio 0,01 molar, de modo que la solución cubra cinco centímetros por encima de la parte superior de los portaobjetos.
Para compensar la pérdida por evaporación, caliente las laminillas en el microondas hasta que la solución entre en ebullición. Esto debería tardar entre tres y diez minutos a potencia máxima. Verifique que las laminillas estén hirviendo.
Reduzca la potencia del microondas entre 10 y 80 % y continúe hirviendo lentamente las laminillas durante 20 minutos adicionales. Después de hervir, coloque el vaso de precipitados que contiene las laminillas sobre la superficie de la mesa para permitir que se enfríen lentamente durante aproximadamente dos horas hasta que alcancen la temperatura ambiente. Confirme que las laminillas estén a temperatura ambiente.
Sumerja los portaobjetos en ácido clorhídrico natural 1,5 durante 40 minutos a temperatura ambiente. Retire los portaobjetos del ácido clorhídrico y colóquelos durante cinco minutos en un lavado con XPBS. A continuación, realice un segundo lavado con XPBS.
Retire sus portaobjetos de la solución de PBS 1X utilizando un lápiz de cera bloqueadora de líquidos. Delinee cada sección de tejido y regrese el portaobjetos al PBS. Prepare una cámara de incubación húmeda colocando una toalla de papel húmeda en el fondo de un recipiente hermético.
Prepare una solución bloqueadora con 10 % de suero de acoplamiento diluido en un XPBS. Es importante cubrir completamente cada sección de tejido con la solución, especialmente para muestras de tejido típicas de aproximadamente uno por 1,5 centímetros. Un volumen de 50 microlitros de solución bloqueadora es suficiente.
Prepare el anticuerpo primario IDU diluyendo sueros anti-BRDU de ratón en suero de asno al 5 %. Añada una concentración de uno a 250. Aplique la solución primaria mediante pipeta sobre cada sección del portaobjetos.
Coloque sus portaobjetos en un refrigerador a cuatro grados Celsius. Para una incubación nocturna, prepare un lavado de alta rigurosidad. El TBST funciona bien.
Coloque las laminillas de vidrio una frente a la otra. Coloque las laminillas en aproximadamente 35 a 40 mililitros de solución TBST. Coloque los tubos en un incubador de cultivo bacteriano con agitación a 37 grados Celsius.
Déjelos agitar durante 20 minutos a 225 RPM. Ahora cargue sus portaobjetos en un portaportas. Coloque sus portaobjetos en un XPBS para un lavado con PBS de cinco minutos.
Esto se realizará mediante un segundo lavado con XPBS durante cinco minutos. Prepare la solución de anticuerpo primario CLDU diluyendo el anticuerpo rat anti BRDU en suero de asno al 5%. Añada una concentración de uno a 250 en portaobjetos colocados sobre una toalla de papel y luego delimite con un lápiz de cera.
Utilice una pipeta para cubrir cada sección de tejido con la solución primaria de CLDU. Use aproximadamente 50 microlitros de solución para asegurarse de que cada sección de tejido quede completamente cubierta. Coloque sus portaobjetos en un refrigerador a cuatro grados Celsius para una incubación nocturna.
Coloque sus portaobjetos en un portador y luego colóquelos en un lavado con XPBS 1X durante cinco minutos. Coloque sus portaobjetos en un segundo lavado con XPBS 1X durante cinco minutos. Prepare los anticuerpos secundarios diluyendo los anticuerpos CY two donkey anti RAD y PS five donkey anti muse en suero de asno al 5 %; DPI también se utilizará para la tinción nuclear. Cubra completamente las secciones de tejido con los anticuerpos secundarios.
50 microlitros de solución deben ser suficientes para cubrir completamente su tejido. Coloque la cámara de rehidratación en un lugar oscuro a temperatura ambiente durante una incubación de una hora. Coloque sus portaobjetos en un portador y luego colóquelos en un lavado con XPBS 1X durante cinco minutos.
Coloque sus portaobjetos en un segundo lavado con PBS 1X durante cinco minutos. Elimine el exceso de solución de PBS golpeando suavemente sobre una toalla de papel. Luego, tome el medio de montaje con oro antidesvanecimiento de larga duración y coloque una pequeña gota sobre cada sección de tejido.
Tome un cubreobjetos y colóquelo suavemente sobre las secciones del portaobjetos. Utilice la toalla de papel como prensa para eliminar cualquier burbuja de aire atrapada entre las secciones del portaobjetos y el cubreobjetos. Finalmente, use la punta de una pipeta para expulsar cualquier burbuja de aire residual. Observe su tejido de interés mediante un microscopio fluorescente equipado con una fuente de luz de alta energía y múltiples canales fluorescentes para cuantificar los resultados.
Comience contando el número de células positivas para Dabi. Cuente el número de células positivas para CLDU utilizando la imagen de dos canales SI. Cuente el número de células positivas para IDU utilizando la imagen de cinco canales SCI.
Finalmente, cuente las células doblemente marcadas positivamente alternando entre el archivo de imagen del canal SCI dos y el canal SCI cinco.
Descripción general
Este artículo presenta un método para detectar la incorporación secuencial de análogos de timidina (CldU e IdU) en tejidos de ratón adulto, lo que permite cuantificar dos rondas sucesivas de división celular. Esta técnica es útil para estudiar la renovación celular en tejidos de larga duración, la transformación oncogénica y las células amplificadoras de tránsito.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Neurociencia
- Oncología
Antecedentes
- Los análogos de timidina se utilizan para marcar células en división.
- Comprender la división celular es fundamental para estudiar la regeneración de tejidos.
- La renovación celular es importante tanto en la fisiología normal como en los estados patológicos.
- El marcado secuencial puede proporcionar información sobre la dinámica de las poblaciones celulares.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para cuantificar la división celular en tejidos.
- Evaluar las implicaciones del recambio celular en diversos contextos biológicos.
- Mejorar la comprensión de los procesos oncogénicos mediante el análisis de la división celular.
Métodos Utilizados
- Incorporación secuencial de CldU e IdU en tejidos de ratón.
- Microscopía fluorescente para la visualización de células marcadas.
- Cuantificación de células positivas para DAB, CldU e IdU.
- Uso de anticuerpos específicos para la detección de análogos de timidina.
Resultados principales
- Detección exitosa de la división celular secuencial en muestras de tejido.
- Análisis cuantitativo de las tasas de renovación celular.
- Identificación de posibles marcadores de transformación oncogénica.
- Conocimientos sobre el comportamiento de las células de amplificación transitoria.
Conclusiones
- El método desarrollado proporciona un enfoque robusto para estudiar la división celular.
- Los hallazgos contribuyen a la comprensión de la dinámica de los tejidos en la salud y la enfermedad.
- Esta técnica puede aplicarse a diversas áreas de investigación, incluyendo oncología y medicina regenerativa.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación precisa de la división celular secuencial permite reducir riesgos mecanicistas en la validación de dianas al aclarar la dinámica proliferativa en sistemas relevantes para la enfermedad. Este enfoque respalda la confianza predictiva en modelos preclínicos al distinguir respuestas proliferativas transitorias de las sostenidas, lo que orienta la identificación de compuestos prometedores y la selección de carteras. La aplicabilidad del método a tejidos de larga duración mejora el descubrimiento de biomarcadores traslacionales en oncología y medicina regenerativa.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la medición de dos rondas sucesivas de división celular en tejido primario.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de objetivos a través de la visualización directa de la cinética proliferativa en modelos de enfermedad.
- Valor predictivo: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al cuantificar tasas de renovación celular que informan sobre la confianza en el objetivo y la modulación de vías.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para la evaluación de compuestos mediante protocolos estandarizados de inmunotinción.
- Resultado cuantitativo: Genera recuentos medibles de células positivas para DAB, CldU e IdU como puntos finales de cribado reproducibles.
- Escalabilidad: Optimizado para la administración de análogos de timidina a bajas dosis mediante agua de bebida, lo que permite estudios de dosificación crónica en modelos preclínicos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Aplicado para identificar la transformación oncogénica y evaluar las contribuciones de las células de amplificación transitoria al crecimiento tisular.
- Continuidad traslacional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al proporcionar datos cuantitativos de proliferación en diferentes tipos de tejidos.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Orienta las estrategias de avance al aclarar si el crecimiento observado se origina en la actividad de células madre o en la expansión de células de amplificación transitoria.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y la eficacia preclínica, proporcionando métricas de proliferación que respaldan las decisiones de continuar o descartar en cada etapa.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la cuantificación de la síntesis secuencial de ADN en respuesta a perturbaciones farmacológicas o genéticas.
- Cribado: Proporciona secciones de tejido listas para ensayos con detección estandarizada de la incorporación de análogos de timidina para el cribado de compuestos.
- Análisis: Permite la comparación de índices proliferativos entre diferentes condiciones mediante la separación de canales fluorescentes y la cuantificación de células doble positivas.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento inicial con la validación preclínica mediante el seguimiento de la dinámica de linaje celular en tejidos relevantes para enfermedades humanas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para estudios longitudinales de proliferación en múltiples áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos al proporcionar evidencia directa de la historia de la división celular.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante protocolos estandarizados de permeabilización, recuperación de antígenos y tinción inmunológica múltiple.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la eliminación temprana de riesgos en objetivos basándose en la responsabilidad proliferativa.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al distinguir los efectos terapéuticos sobre los compartimentos de células madre frente a células progenitoras.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en inmunohistoquímica y microscopía fluorescente para la detección múltiple.
- Depende del acceso a infraestructura para la recuperación de antígenos (microondas, tampón citrato) y capacidad de incubación secuencial de anticuerpos.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de bloqueo, lavado y montaje para minimizar los efectos por lotes.
- La adaptación a distintos sistemas modelo requiere la validación de la especificidad de los anticuerpos y la permeabilidad del tejido en cada contexto.
- Las limitaciones prácticas incluyen el enmascaramiento potencial de epítopos y la necesidad de optimizar los esquemas de dosificación análogos para evitar la toxicidad.
