Name: Fabricación de micro-tejidos, utilizando los módulos de gel de colágeno las células que contienen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Aprende a fabricar micro-tejidos modulares utilizando geles de colágeno con células endoteliales para ingeniería tisular. Este método permite estudiar interacciones celulares in vitro e in vivo.

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El financiamiento fue proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud (EB 001 013), Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá y los Institutos Canadienses de Investigación en Salud. Agradecemos al Dr. AP McGuigan por su experiencia y ayudar en el desarrollo de los módulos.

1) Preparación del tubo <ol><li> Cortar 2 a 3 m de longitud de tubo de polietileno (0,76 mm de diámetro x 1,22 mm OD). </li><li> Enhebrar una aguja 20 G1 en un extremo de la tubería. </li><li> Bobina de la tubería y el lugar en un convertidor de autocierre bolsa (7 1 / 2 "x 13"). Los dos extremos de la tubería debe ser colocado en el extremo sin sellar de la bolsa y se pega con cinta adhesiva de gas de esterilización. </li><li> Selle la bolsa y el gas esterilizar. </li></ol> 2) La neutralización de colágeno Nota: 1 ml de colágeno se llena de unos 2 m de tubería de polietileno. <ol><li> Coloque la cantidad necesaria de colágeno necesario para la longitud deseada del tubo en un tubo cónico de 15 ml y mantener en hielo. </li><li> Añadir 128 uL de 10x α-MEM por ml de colágeno en el tubo y mezclar varias veces la solución de pipeta. Nota: (1) La solución debe a su vez el amarillo como el α-MEM se mezcla con el colágeno acidificado y (2) tratar de minimizar las burbujas de la mezcla. </li><li> Neutralizar el colágeno mediante la adición de bicarbonato de sodio 0,8 M hasta que el colágeno tiene un pH de 7,4. Para una estimación general de que el bicarbonato de sodio pH añadir hasta que la solución de colágeno amarilla se vuelve de un color rosa claro. Nota: Por lo general toma 30 a 60 l por cada ml de colágeno. </li><li> Mantener el colágeno neutralizado en el hielo hasta que esté listo para su uso como el colágeno se neutraliza si no gel se mantiene a 4 ° C. </li></ol> 3) Incorporación de las células (Opcional) Nota: Dependiendo del tipo de células, las células pueden ser incorporados a una concentración de entre 1 millón de células por ml a 20 millones de células por ml. Utilizar el medio necesario para las células que desea incrustar. <ol><li> Eliminar los medios de comunicación de las células y lavar con 5 ml de PBS. </li><li> Quitar PBS y añadir 3 ml de tripsina-EDTA. </li><li> Se incuban las células en tripsina-EDTA durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Resuspender las células en 7 ml de medio. </li><li> Recuento de células. </li><li> La transferencia de la cantidad necesaria de células para incorporar a un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Que sedimenten las células a 300 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar los medios de comunicación de la pellet de células. </li><li> Resuspender las células en el colágeno neutralizado y mantener en hielo. </li></ol> 4) gelificantes de colágeno <ol><li> En una cabina de seguridad biológica cortar el extremo cerrado de la bolsa que contiene el tubo de polietileno. </li><li> Adjunte una jeringa de 3 ml a la aguja 20G en el extremo del tubo con unas pinzas esterilizadas. Mantener el tubo en la bolsa. </li><li> Inserte el otro extremo de la tubería en el colágeno neutralizado hasta que la punta está en la parte inferior del tubo cónico con unas pinzas esterilizadas. Mantenga el tubo cónico en el hielo. </li><li> Tire del colágeno en la tubería de polietileno de retraer el émbolo de la jeringa lentamente. Nota: Si el colágeno se tira en el tubo de forma rápida luego las burbujas se forman en el colágeno. </li><li> Después de tirar el colágeno a través del tubo, saque la aguja 20G de la tubería y colocar los dos extremos en la bolsa. Cinta de la bolsa cerrada. </li><li> Incubar la bolsa a 37 ° C durante 60 min. Si el colágeno contiene células después poner la bolsa sobre cada 15 minutos. de modo que las células no se depositan en un lado del módulo. </li></ol> 5) El corte de tubo que contiene el colágeno gelificado <ol><li> Encabezados autoclave y la hoja de la herramienta de corte y bandeja para tubos. </li><li> Montar el dispositivo de corte. </li><li> Tubo lugar en una bandeja estéril frente de herramienta de corte y carga del tubo en el dispositivo de corte. </li><li> Establecer un tubo cónico de 50 ml que contienen 25 ml de los medios de comunicación a la salida del dispositivo de corte para recoger los módulos de corte. Nota: Use los medios que contiene FBS, incluso para el colágeno de sólo los módulos que los módulos no se separan de la tubería sin FBS en los medios de comunicación. Si los módulos contienen las células utilizan los medios necesarios para que las células incrustado. Si no hay células incluidas en los módulos de utilizar los medios de comunicación de las células endoteliales. </li><li> Configurar el dispositivo para el corte 2 mm de longitud de la tubería y cortar el tubo. </li><li> Incubar corte módulos a 37 ° C durante 60 minutos en el tubo cónico de 50 ml. </li></ol> 6) Extracción de módulos de colágeno de la tubería <ol><li> Vortex 50 ml tubo cónico que contiene los módulos en el tubo durante 10 segundos. Nota: Tenga cuidado al separar los módulos integrados de alta densidad celular para evitar roturas. </li><li> Deje que los módulos se depositan en el fondo del tubo. Se tarda unos 5 minutos. </li><li> Usando una pipeta de boca ancha 10 ml serológicas de transferencia de los módulos se establecieron en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Repita los pasos 6,1 hasta 6,3 veces. </li><li> Vaya al paso 7 de módulos capa con las células endoteliales o módulos de transferencia de una placa de cultivo de tejidos no tratados. </li></ol> 7) Revestimiento de los módulos con las células endoteliales <ol><li> Resolver los módulos en la parte inferior de un tubo cónico de 15 ml con 5 ml de los medios de comunicación para THe integrado células. </li><li> Retire el medio de las células endoteliales y lavar con 5 ml de PBS. </li><li> Quitar PBS y añadir 3 ml de tripsina-EDTA. </li><li> Se incuban las células en tripsina-EDTA durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Resuspender las células en 7 ml de medio. </li><li> Recuento de células. Necesidad de 5x10 6 células endoteliales por ml de módulos de lleno en la parte inferior del tubo cónico. </li><li> Que sedimenten las células a 300 xg durante 5 minutos y resuspender en 5 ml de medio de las células endoteliales. </li><li> Agregar los 5 ml de los medios de comunicación que contiene las células endoteliales de los módulos. Nota: Esto le da una proporción de 50:50 de los dos tipos de medios que hemos encontrado para trabajar para la supervivencia y la función de ambos tipos celulares. Probar el uso de un medio de co-cultivo formulado para garantizar un mantenimiento adecuado de los fenotipos de los dos tipos de células antes de usarlo. </li><li> Incubar los módulos con las células endoteliales tanto estática como dinámica. </li><li> Para los módulos de incubación estática se mezclan con las células endoteliales de la inversión y colocar el tubo en posición vertical a 37 ° C durante 15 min. Repetir. </li><li> Dinámica de semillas de las células endoteliales agitando suavemente el tubo a 37 ° C durante 60 min. </li><li> Repita dos veces incubación estática. </li><li> Coloque los módulos en una placa de cultivo de tejidos no tratados y se incuba durante la noche a 37 ° C. </li><li> El lugar al día siguiente de los módulos en una placa de cultivo de nuevos tejidos no tratados con medio fresco (mezcla 50:50 si se utiliza el sistema de co-cultivo) para eliminar las células endoteliales sin ataduras. </li><li> Incubar los módulos que están cubiertas con células endoteliales hasta cubrir el 100% de la superficie de los módulos. Esto generalmente toma alrededor de 7 días. </li></ol> 8) Los resultados representativos: Los módulos se verá cilíndrica la primera vez que se retiran del tubo. Si los módulos contienen células integradas y / o están cubiertas con las células endoteliales que se pueden contratar hasta un 50% en volumen y desarrollan una forma oval (Figura 1). Los módulos también se volverá más densa y más opaco cuando es visualizado mediante microscopio de luz (Figura 1). Además, cuando las células endoteliales son confluentes en la superficie de los módulos hay una formación de uniones estrechas que se puede ver por inmunofluorescencia de VE-cadherina (Figura 2). El análisis de transferencia de masa se ​​ha demostrado que los módulos son capaces de soportar altas densidades de células (8x10 7 células / cm 3), sin el desarrollo de un núcleo necrótico debido al transporte inadecuado de oxígeno, que es a menudo problemático en las grandes tejidos (por ejemplo, módulos de gran diámetro, D = 1,4 mm) (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Módulo de fabricación y la contracción. Contracción del módulo durante los tres días siguientes a HUVEC-C (línea de células endoteliales) siembra resultados significativamente menor diámetro y la longitud del módulo (p &lt;0,001) (A). Incorporado las células HepG2 fueron distribuidos de manera uniforme dentro de los módulos en el momento de la fabricación y mantiene una alta viabilidad (B). [En vivo las células verdes, las células muertas de red] [adaptado de Corstorphine 2010] <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: VE-cadherina tinción de inmunofluorescencia de las uniones celulares CE apretado 10 días después de RAEC en cubierta en la superficie de un módulo. Barra de escala = 50 micras. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: tricrómico de Masson de módulos típicos (0,76 mm de diámetro inicial) y los módulos de gran tamaño (1,4 mm de diámetro inicial) demostrar el efecto de las limitaciones de la difusión de oxígeno. Siete días después de la fabricación, un gran número de células muertas se había formado en el núcleo de los módulos de gran tamaño (panel inferior derecho), dejando sólo un delgado borde (~ 200μm de espesor) de células viables. Por el contrario, los pequeños módulos mantenido una distribución uniforme y elevado de células vivas. [Módulos integrados con las células HepG2 y recubierto con las células endoteliales.] [Tomado de Corstorphine 2010] <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: (A) HMEC-1 cabeza de serie en poloxamina - módulos de colágeno. Después de un día de la siembra de los módulos de colágeno poloxamina-mantienen su forma cilíndrica y no se limita propiedades adhesión celular en comparación con los módulos de colágeno solamente. Barra de escala = 200 micras. (B) Luz imagen microscópica de un módulo de colágeno que contiene PLGA basada en microesferas biodegradables. Barra de escala = 500 micras. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5: Ejemplos de ensayos in vitro. (A) ensayo de la angiogénesis: capilar como formaciones en el módulo de sembrado con las células endoteliales puede ser fácilmente detectado y cuantificado después de 5 días de incubación con las células madre derivadas de tejido adiposo. (B) las imágenes de microscopía confocal de un ensayo en vivo / muerto en los módulos donde la sTaining, de células vivas es de color verde y de células muertas es de color rojo. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6: Módulos de colágeno que contiene incrustado células madre mesenquimales y una capa superficial de células endoteliales. Los módulos fueron expuestos a la tensión de corte (~ 0,64 dinas / cm 2) durante 7 días en una cámara de microfluidos y comenzar a mostrar la fusión en los puntos de contacto. Las células endoteliales son teñidas con vWF (marrón) y los núcleos de células madre mesenquimales aparecen de color azul (H &amp; E). Barra de escala = 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7: Cientos de módulos que contienen colágeno derivadas de tejido adiposo-Las células madre (ASC) y recubierto con células endoteliales microvasculares (HMEC) se implantan bajo la piel de ratones para estudiar ASC / HMEC interacción in vivo para las aplicaciones de la regeneración de la grasa.

<ol><li>Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+vessel+tissue+engineering+driven+by+endothelialized+modules%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules.</a> , (2010).</li>
<li>Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+factor+and+diffusion+limitations+in+collagen+gel+modules+containing+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2010).</li>
<li>Gupta, R., Van Rooijen, N., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+endothelialized+modular+constructs+implanted+in+an+omental+pouch+in+nude+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Fate of endothelialized modular constructs implanted in an omental pouch in nude rats.</a> Tissue Eng. Part A 15, 2875-2887 (2009).</li>
<li>Leung, B. M., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+tissue+engineering+construct+containing+smooth+muscle+cells+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">A modular tissue engineering construct containing smooth muscle cells and endothelial cells.</a> Ann Biomed Eng. 35, 2039-2049 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Leung, B., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+cell-containing+gel+modules+to+assemble+modular+tissue-engineered+constructs+%5Bcorrected%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fabrication of cell-containing gel modules to assemble modular tissue-engineered constructs [corrected].</a> Nat Protoc. 1, 2963-2969 (2006).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+organoid+engineered+by+modular+assembly+enables+blood+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vascularized organoid engineered by modular assembly enables blood perfusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11461-11466 (2006).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+tissue+engineering%3A+fabrication+of+a+gelatin-based+construct%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Modular tissue engineering: fabrication of a gelatin-based construct.</a> J Tissue Eng Regen Med. 1, 136-145 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+sub-mm-sized+modules+containing+encapsulated+cells+for+modular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of sub-mm-sized modules containing encapsulated cells for modular tissue engineering.</a> Tissue Eng. 13, 1069-1078 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+criteria+for+a+modular+tissue-engineered+construct%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Design criteria for a modular tissue-engineered construct.</a> Tissue Eng. 13, 1079-1089 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thrombogenicity+of+human+umbilical+vein+endothelial+cell+seeded+collagen+modules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The thrombogenicity of human umbilical vein endothelial cell seeded collagen modules.</a> Biomaterials. 29, 2453-2463 (2008).</li>
<li>Sosnik, A., Leung, B., McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen%2Fpoloxamine+hydrogels%3A+cytocompatibility+of+embedded+HepG2+cells+and+surface-attached+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Collagen/poloxamine hydrogels: cytocompatibility of embedded HepG2 cells and surface-attached endothelial cells.</a> Tissue Eng. 11, 1807-1816 (2005).</li>
</ol>

Hemos fabricado varias diferentes micro-tejidos con módulos integrados con diferentes tipos de células 1.11. Hemos incorporado con éxito los cardiomiocitos primarios, islotes, las células adiposas madre mesenquimales y las células del estroma, así como varias líneas celulares HepG2 incluyendo, NIH 3T3 y clonar las células del hígado 9. Hemos revestido los módulos con varios tipos de células incluyendo las células endoteliales de aorta de rata endoteliales, las células endoteliales de vena umbilical y las célu...

<table><tbody><tr><td>Tubo Intramedic PE60</td><td>BD Biosciences</td><td>427416</td><td>Se puede usar tubo de distinto diámetro para cambiar el diámetro de los módulos</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno ácido Purcol, 3 mg/mL</td><td>Cedarlane Labs</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 20G</td><td>BD Biosciences</td><td>305175</td><td>El diámetro de la aguja debe ser similar al diámetro del tubo</td></tr><tr><td>Jeringa de 3 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 15 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 50 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Bolsa autocierre Convertors 7 1/2&amp;#8221; x 13&amp;#8221;</td><td>Cardinal Health</td><td>92713</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica de punta ancha de 10 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>357504</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica de 10 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica de 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>357543</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricación de micro-tejidos, utilizando los módulos de gel de colágeno las células que contienen

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

Este protocolo describe la fabricación de un tipo de micro-tejidos llamados módulos. El concepto de módulo genera tejidos uniforme, escalable y vascularizado. Los módulos pueden ser hechos de colágeno, así como otros materiales gelable o reticulables. Son aproximadamente 2 mm de longitud y 0,7 mm de diámetro en la fabricación, pero disminuye de tamaño con las células incrustado o cuando los módulos están cubiertos con las células endoteliales. Los módulos individuales son tan pequeñas que las células están incrustadas dentro del límite de la difusión de oxígeno y otros nutrientes, pero los módulos se pueden agruparse para formar los tejidos que son más grandes perfusable. Estos tejidos son modulares en la construcción debido a los diferentes tipos de células pueden ser integrados en cubierta o en los módulos antes de que se empaquetan para formar tejidos complejos. Existen tres pasos principales para hacer los módulos de: (1) neutralizar el colágeno y la incrustación de células en el mismo, (2) gelificantes el colágeno en el tubo y corte de los módulos y (3) revestimiento de los módulos con las células endoteliales.

Creación de micro-tejidos, utilizando geles de colágeno cilíndricos, llamados módulos, que contienen células incluidas y que la superficie está recubierta de células endoteliales.

Fabricación de micro-tejidos, utilizando los módulos de gel de colágeno las células que contienen

Este protocolo describe la fabricación de un tipo de microtejidos denominados módulos. El enfoque de módulos genera estructuras uniformes, escalables y vascularizadas...

El objetivo general de este procedimiento es producir microtejidos modulares que puedan utilizarse en experimentos de ingeniería de tejidos. Esto se logra primero introduciendo la solución de colágeno en un tubo de polietileno mediante una jeringa y luego gelificando el colágeno. El segundo paso consiste en cortar el tubo de polietileno en segmentos de dos milímetros para formar los módulos de microtejido.El tercer paso del procedimiento consiste en separar los módulos del tubo, y finalmente, los módulos se recubren con células endoteliales. En última instancia, los microtejidos resultantes pueden utilizarse en ensayos celulares in vitro para estudiar la interacción de las células mediante una cámara microfluídica. Además, los microtejidos pueden implantarse para generar tejidos y estudiar la interacción y remodelación de los microtejidos in vivo.Hola, mi nombre es Brendan Long del Laboratorio Sepan en la Universidad de Toronto. Uno de los principales obstáculos para crear sustitutos de tejidos tridimensionales grandes es la falta de vascularización rápida tras la implantación. En este video, les mostraremos cómo crear módulos de tejido recubiertos con células endoteliales para ayudar a superar esta limitación.La demostración del procedimiento estará a cargo de Deem Chamberlain, un becario posoperatorio del laboratorio Septin. La cantidad de colágeno a neutralizar dependerá de la longitud del tubo de polietileno. En esta demostración, utilizaremos un tubo de polietileno de dos metros de longitud con un diámetro interno de 0,76 milímetros y un diámetro externo de 1,22 milímetros.Para preparar el tubo, introduzca una aguja de 20 G en un extremo del tubo y luego coloque el tubo en una bolsa autocurable para esterilización gaseosa. Dado que un mililitro de colágeno llena aproximadamente dos metros de tubo de polietileno, neutralizaremos un mililitro de colágeno. Coloque el colágeno en un tubo cónico de 15 mililitros y mantenga el tubo en hielo.Añada 128 microlitros de MEM alfa 10 x por mililitro de colágeno al tubo y mezcle pipeteando repetidamente la solución. Tenga cuidado para minimizar la formación de burbujas; la solución debe volverse amarilla a medida que el MEM alfa se mezcla con el colágeno acidificado. A continuación, neutralice el colágeno añadiendo bicarbonato de sodio 0,8 molar. Para una estimación general del pH, añada bicarbonato de sodio hasta que la solución de colágeno amarilla se vuelva de color rosa claro.Normalmente se necesitan de 30 a 60 microlitros por mililitro de colágeno para alcanzar un pH de 7,4. Para evitar que el colágeno neutralizado forme un gel, manténgalo en hielo hasta que esté listo para su uso. Para comenzar el procedimiento de gelificación del colágeno, tome la bolsa que contiene los tubos de polietileno esterilizados y llévela a una cabina de seguridad biológica, y corte el extremo sellado de la bolsa manteniendo los tubos dentro de ella.Utilice pinzas esterilizadas para colocar una jeringa de tres mililitros en la aguja de calibre 20 que previamente se insertó en uno de los extremos del tubo. Introduzca el otro extremo del tubo en el colágeno neutralizado hasta que la punta esté en el fondo del tubo cónico, que debe mantenerse sobre hielo. Este siguiente paso debe realizarse lentamente; de lo contrario, se introducirán burbujas de aire en el colágeno.Retraiga lentamente el émbolo de la jeringa para aspirar el colágeno hacia el interior del tubo de polietileno. Una vez que el colágeno haya pasado por el tubo, retire la aguja de calibre 20 e introduzca ambos extremos del tubo nuevamente en la bolsa. Después de sellar la bolsa con cinta, incúbela a 37 grados Celsius durante 60 minutos.Se utilizará un dispositivo de corte preensamblado para cortar el tubo. Para comenzar este procedimiento, coloque el tubo en una bandeja estéril frente al dispositivo de corte y cargue el tubo en el dispositivo de corte por la salida del mismo. Prepare un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de medio para células endoteliales. Para recoger los módulos cortados, configure el dispositivo de corte para que corte segmentos de tubo de dos milímetros de longitud y luego corte el tubo.Incube los módulos cortados en el tubo cónico de 50 mililitros a 37 grados Celsius durante 60 minutos. Para eliminar los módulos de colágeno del tubo, vortexee el tubo cónico de 50 litros que contiene los módulos a velocidad media. Deje que el módulo sedimente en el fondo del tubo durante 10 segundos, lo cual tarda aproximadamente cinco minutos.Se formará un precipitado suelto de módulos en el fondo del tubo, mientras que los tubos formarán una capa en la parte superior del medio. Una vez que los módulos hayan sedimentado, utilice una pipeta serológica de 10 mililitros con boca ancha para transferirlos a un tubo cónico de 15 mililitros. Vortexee el tubo cónico de 15 mililitros y luego permita que los módulos sedimenten otras dos veces.Los módulos sedimentados del segundo y tercer vórtice también se transfieren al tubo de 15 mililitros. Después de que todos los módulos se han retirado del tubo y se han reunido, aforar el volumen del medio en el tubo hasta cinco mililitros. Los módulos ya están listos para ser recubiertos con células endoteliales, lo cual se mostrará a continuación para preparar las células endoteliales para recubrir los módulos.Primero, retire el medio de las células y lave con PBS. Después de eliminar el PBS, agregue tres mililitros de tripsina-EDTA e incube durante cinco minutos a 37 grados Celsius. A continuación, resuspenda las células en siete mililitros de medio y transfiera a un tubo de 15 mililitros.Cuente las células utilizando un hemocitómetro; necesitará cinco veces 10 a la sexta células endoteliales por mililitro de módulos empaquetados en el fondo del tubo cónico. Pellete las células a 300 G durante cinco minutos. Reuspenda el sedimento celular en cinco mililitros de medio para células endoteliales.Ahora agregue cinco mililitros de medio que contenga células endoteliales a los módulos. Incube los módulos con las células endoteliales, tanto estática como dinámicamente; para la incubación estática, mezcle los módulos con las células endoteliales mediante inversión, luego coloque el tubo en posición vertical a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Después de 15 minutos, invierta nuevamente el tubo e incube a 37 grados Celsius durante otros 15 minutos.Para incubar los módulos con las células endoteliales de forma dinámica, agite suavemente el tubo de 15 mililitros a 37 grados Celsius durante 60 minutos. Una vez finalizada la incubación con las células endoteliales, transfiera los módulos a una placa no tratada para cultivo de tejidos e incube durante la noche a 37 grados Celsius. Al día siguiente, coloque los módulos en una nueva placa no tratada para cultivo de tejidos con medio fresco para eliminar las células endoteliales no adheridas. Incube los módulos recubiertos con células endoteliales a 37 grados Celsius hasta que las células cubran el 100 % de la superficie de los módulos.Esto generalmente tarda alrededor de siete días. Los módulos tendrán forma cilíndrica cuando se retiren por primera vez del tubo. Si están recubiertos con células endoteliales, pueden contraerse hasta en un 50 % en volumen y desarrollar una forma ovalada, además de volverse más densos y opacos cuando se observan mediante microscopía óptica.En estas imágenes, el diámetro y la longitud de los módulos se indican mediante d y l, respectivamente. Esta siguiente imagen muestra células Hep G2 incrustadas distribuidas uniformemente dentro de los módulos al momento de su fabricación. Las células conservaron una viabilidad alta, como lo indica el color verde de las células vivas.Las células muertas serían de color rojo cuando las células endoteliales sean confluentes. En la superficie de los módulos, se forma una unión estrecha, que puede observarse mediante inmunofluorescencia. La tinción de la transferencia de masa de cadherina VE ha demostrado que los módulos son capaces de soportar altas densidades celulares sin desarrollar un núcleo necrótico debido al transporte inadecuado de oxígeno, lo cual es frecuentemente problemático en tejidos más grandes.En este ejemplo, la tinción con tri-cromato de masen en módulos pequeños típicos muestra que los módulos conservaron una distribución uniforme y alta de células vivas siete días después de su fabricación. En contraste, un gran número de células muertas se había formado en el núcleo de los módulos grandes, dejando solo un delgado borde de células viables. También se han producido módulos con una mezcla de colágeno y un polímero a ine o que contienen microesferas elutoras de fármacos.Aquí, cuando las células EC hm se adhieren a módulos de colágeno con palin, los módulos conservan su forma cilíndrica y presentan propiedades de adhesión celular limitadas en comparación con los módulos de colágeno únicamente. Se muestra aquí una imagen de microscopio óptico de un módulo de colágeno que contiene microesferas biodegradables basadas en PLGA. Varios ensayos in vitro han demostrado ser compatibles con estos módulos.Por ejemplo, en un ensayo de angiogénesis, las formaciones similares a capilares en un módulo sembrado con células endoteliales pueden detectarse y cuantificarse fácilmente tras cinco días de incubación con células madre derivadas del tejido adiposo. En otro ejemplo, imágenes de microscopía confocal de un ensayo de viabilidad celular en módulos muestran células vivas teñidas en verde y células muertas teñidas en rojo. Finalmente, los módulos también se han utilizado en cámaras de microfluídica e implantados en ratones y ratas para estudiar la interacción entre diferentes tipos celulares y cómo los microtejidos son remodelados por la respuesta del huésped.Después del procedimiento, los módulos pueden cultivarse en una placa de Petri u otros recipientes, como un biorreactor o un dispositivo microfluídico. Este método también puede adaptarse para crear diferentes tejidos utilizando diversas combinaciones de tipos celulares o tubos con distintos diámetros. Gracias por ver.

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Research

Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

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Se describe un método para la preparación de una matriz de tres dimensiones que consiste en colágeno tipo I y fibroblastos primarios humanos. Este gel organotípicos sirve como un sustrato útil para evaluar la migración de células invasivas debido a que imita las características básicas del estroma y se presta a muchas formas de microscopía.

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Este sistema modelo se inicia a partir de un gel de fibrina-miofibroblastos poblado que se puede utilizar para estudiar colágeno endógeno (re) organización en tiempo real de una manera no destructiva. El modelo de sistema es muy sintonizable, ya que se puede utilizar con diferentes fuentes de células, aditivos de medio, y se puede adaptar fácilmente a las necesidades específicas.

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En este trabajo, presentamos una técnica para la fabricación rápida de tejidos vasculares vivos mediante el cultivo directo de colágeno, células musculares lisas y células endoteliales. Además, se describe un nuevo protocolo para la caracterización mecánica de tejidos vasculares artificiales.

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La ingeniería de tejidos incluye a menudo la expansión in vitro con el fin de crear autoinjertos para la regeneración de tejidos. En este estudio se desarrolló un método para la expansión del tejido, la regeneración, y la reconstrucción in vivo con el fin de reducir al mínimo el procesamiento de células y materiales biológicos fuera del cuerpo.

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La creación de microtejidos funcionales dentro de dispositivos microfluídicos requiere la estabilización de los fenotipos celulares mediante la adaptación de las técnicas tradicionales de cultivo celular a las limitadas dimensiones espaciales de los microdispositivos. La modificación del colágeno permite la deposición capa por capa de ensamblajes de colágeno ultrafinos que pueden estabilizar las células primarias, como los hepatocitos, como modelos de tejido microfluídico.

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El colágeno es un componente central de la ECM, y proporciona indicaciones esenciales para varios procesos celulares que van desde la migración a la diferenciación y la proliferación. Aquí se incluye es un protocolo para la incorporación de las células dentro de los hidrogeles de colágeno en 3D, y una técnica más avanzada para la generación de matrices de colágeno aleatorios o alineados utilizando PDMS microcanales.

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Este protocolo demuestra el uso de un canal microfluídico con geometría cambiante a lo largo de la dirección del flujo de fluido para generar tensión extensional (estiramiento) para alinear fibras en un hidrogel de colágeno 3D (&lt;250 μm de espesor). La alineación resultante se extiende a lo largo de varios milímetros y está influenciada por la velocidad de deformación extensional.

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El siguiente protocolo presenta un método de extrusión basado en cizallamiento para la fabricación de hidrogeles de colágeno con fibrillas con patrones a nanoescala, que se puede aplicar a una amplia gama de aplicaciones de ingeniería de tejidos.

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