Fabricación de micro-tejidos, utilizando los módulos de gel de colágeno las células que contienen

El objetivo general de este procedimiento es producir microtejidos modulares que puedan utilizarse en experimentos de ingeniería de tejidos. Esto se logra primero introduciendo la solución de colágeno en un tubo de polietileno mediante una jeringa y luego gelificando el colágeno. El segundo paso consiste en cortar el tubo de polietileno en segmentos de dos milímetros para formar los módulos de microtejido.

El tercer paso del procedimiento consiste en separar los módulos del tubo, y finalmente, los módulos se recubren con células endoteliales. En última instancia, los microtejidos resultantes pueden utilizarse en ensayos celulares in vitro para estudiar la interacción de las células mediante una cámara microfluídica. Además, los microtejidos pueden implantarse para generar tejidos y estudiar la interacción y remodelación de los microtejidos in vivo.

Hola, mi nombre es Brendan Long del laboratorio de Sepan en la Universidad de Toronto. Uno de los principales obstáculos para crear sustitutos tisulares tridimensionales de gran tamaño es la falta de vascularización rápida tras la implantación. En este video, les mostraremos cómo crear módulos tisulares recubiertos con células endoteliales para ayudar a superar esta limitación.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Chamberlain, un becario posoperatorio del laboratorio Septin. La cantidad de colágeno a neutralizar dependerá de la longitud del tubo de polietileno. En esta demostración, utilizaremos un tubo de polietileno de dos metros de longitud con un diámetro interno de 0,76 milímetros y un diámetro externo de 1,22 milímetros.

Para preparar el tubo, introduzca una aguja de 20 G en un extremo del tubo y luego coloque el tubo en una bolsa autocurable para esterilización gaseosa. Dado que un mililitro de colágeno llena aproximadamente dos metros de tubo de polietileno, neutralizaremos un mililitro de colágeno. Coloque el colágeno en un tubo cónico de 15 mililitros y mantenga el tubo en hielo.

Añada 128 microlitros de 10 x alfa MEM por mililitro de colágeno al tubo y mezcle pipeteando repetidamente la solución. Con cuidado de minimizar la formación de burbujas, la solución debe volverse amarilla a medida que el alfa MEM se mezcla con el colágeno acidificado. A continuación, neutralice el colágeno añadiendo bicarbonato de sodio 0,8 M. Para una estimación general del pH, añada bicarbonato de sodio hasta que la solución de colágeno amarilla se vuelva de color rosa claro.

Normalmente se necesitan de 30 a 60 microlitros por mililitro de colágeno para alcanzar un pH de 7,4. Para evitar que el colágeno neutralizado forme un gel, manténgalo en hielo hasta que esté listo para su uso. Para comenzar el procedimiento de gelificación del colágeno, tome la bolsa que contiene los tubos de polietileno esterilizados y llévela a una cabina de seguridad biológica, y corte el extremo sellado de la bolsa manteniendo los tubos dentro de ella.

Utilice pinzas esterilizadas para fijar una jeringa de tres mililitros a la aguja de calibre 20 que previamente se insertó en uno de los extremos del tubo. Introduzca el otro extremo del tubo en el colágeno neutralizado hasta que la punta quede en el fondo del tubo cónico, que debe mantenerse sobre hielo. Debe realizar este siguiente paso lentamente; de lo contrario, introducirá burbujas de aire en el colágeno.

Retraiga lentamente el émbolo de la jeringa para aspirar el colágeno hacia el interior del tubo de polietileno. Una vez que el colágeno haya pasado por el tubo, retire la aguja de calibre 20 e introduzca ambos extremos del tubo nuevamente en la bolsa. Después de sellar la bolsa con cinta, incúbela a 37 grados Celsius durante 60 minutos.

Se utilizará un dispositivo de corte preensamblado para cortar el tubo. Para comenzar este procedimiento, coloque el tubo en una bandeja estéril frente al dispositivo de corte y cargue el tubo en el dispositivo de corte en la salida del mismo. Prepare un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de medio para células endoteliales. Para recoger los módulos cortados, configure el dispositivo de corte para que corte segmentos de tubo de dos milímetros de longitud y luego corte el tubo.

Incube los módulos cortados en el tubo cónico de 50 mililitros a 37 grados Celsius durante 60 minutos. Para eliminar los módulos de colágeno del tubo, vortexee el tubo cónico de 50 litros que contiene los módulos a velocidad media. Deje que el módulo sedimente en el fondo del tubo durante 10 segundos, lo que tarda aproximadamente cinco minutos.

Se formará un pellet suelto de módulos en el fondo del tubo, mientras que los tubos formarán una capa en la parte superior del medio. Una vez que los módulos hayan sedimentado, utilice una pipeta serológica de boca ancha de 10 mililitros para transferirlos a un tubo cónico de 15 mililitros. Vortexee el tubo cónico de 15 mililitros y luego permita que los módulos sedimenten otras dos veces más.

Los módulos sedimentados del segundo y tercer vórtice también se transfieren al tubo de 15 mililitros. Una vez que todos los módulos han sido retirados del tubo y reunidos, aforar el volumen del medio en el tubo hasta cinco mililitros. Los módulos ya están listos para ser recubiertos con células endoteliales, lo cual se mostrará a continuación para preparar las células endoteliales para recubrir los módulos.

Primero, retire el medio de las células y lave con PBS. Después de eliminar el PBS, agregue tres mililitros de tripsina-EDTA e incube durante cinco minutos a 37 grados Celsius. A continuación, resuspenda las células en siete mililitros de medio y transfiera a un tubo de 15 mililitros.

Cuente las células utilizando un hemocitómetro; necesitará cinco veces 10 a la sexta células endoteliales por mililitro de módulos empaquetados en el fondo del tubo cónico. Pelote las células a 300 G durante cinco minutos. Re suspenda el sedimento celular en cinco mililitros de medio para células endoteliales.

Ahora agregue cinco mililitros de medio que contenga células endoteliales a los módulos. Incube los módulos con las células endoteliales, tanto estática como dinámicamente; para la incubación estática, mezcle los módulos con las células endoteliales mediante inversión, luego coloque el tubo en posición vertical a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Después de 15 minutos, invierta nuevamente el tubo e incube a 37 grados Celsius durante otros 15 minutos.

Para incubar los módulos con las células endoteliales de forma dinámica, agite suavemente el tubo de 15 mililitros a 37 grados Celsius durante 60 minutos. Una vez finalizada la incubación con las células endoteliales, transfiera los módulos a una placa no tratada para cultivo de tejidos e incube durante la noche a 37 grados Celsius. Al día siguiente, coloque los módulos en una nueva placa no tratada para cultivo de tejidos con medio fresco para eliminar las células endoteliales no adheridas. Incube los módulos recubiertos con células endoteliales a 37 grados Celsius hasta que las células cubran el 100 % de la superficie de los módulos.

Esto generalmente tarda alrededor de siete días. Los módulos tendrán forma cilíndrica cuando se retiren por primera vez del tubo. Si están recubiertos con células endoteliales, pueden contraerse hasta en un 50 % en volumen y desarrollar una forma ovalada, además de volverse más densos y opacos cuando se observan mediante microscopía óptica.

En estas imágenes, el diámetro y la longitud de los módulos se indican con d y l, respectivamente. Esta siguiente imagen muestra células Hep G2 embebidas distribuidas uniformemente dentro de los módulos al momento de su fabricación. Las células mantuvieron una viabilidad alta, como lo indica el color verde de las células vivas.

Las células muertas tendrían un color rojo cuando las células endoteliales sean confluentes. En la superficie de los módulos, se forma una unión estrecha, que puede observarse mediante inmunofluorescencia. La tinción de la transferencia de masa de cadherina VE ha demostrado que los módulos son capaces de soportar altas densidades celulares sin desarrollar un núcleo necrótico debido al transporte inadecuado de oxígeno, lo cual es frecuentemente problemático en tejidos más grandes.

En este ejemplo, la tinción con tri-cromato de masen en módulos pequeños típicos muestra que los módulos conservaron una distribución uniforme y alta de células vivas siete días después de su fabricación. En contraste, un gran número de células muertas se había formado en el núcleo de los módulos grandes, dejando solo un delgado borde de células viables. También se han producido módulos con una mezcla de colágeno y un polímero a ine o que contienen microesferas elutoras de fármacos.

Aquí, cuando las células EC hm se siembran sobre módulos de colágeno con palin, los módulos conservan su forma cilíndrica y presentan propiedades limitadas de adhesión celular en comparación con los módulos de colágeno únicamente. Se muestra aquí una imagen de microscopio óptico de un módulo de colágeno que contiene microesferas biodegradables basadas en PLGA. Varios ensayos in vitro han demostrado ser compatibles con estos módulos.

Por ejemplo, en un ensayo de angiogénesis, las formaciones similares a capilares en un módulo sembrado con células endoteliales pueden detectarse y cuantificarse fácilmente tras cinco días de incubación con células madre derivadas del tejido adiposo. En otro ejemplo, imágenes de microscopía confocal de un ensayo de viabilidad celular en módulos muestran células vivas teñidas en verde y células muertas teñidas en rojo. Finalmente, los módulos también se han utilizado en cámaras de microfluídica e implantados en ratones y ratas para estudiar la interacción entre diferentes tipos celulares y cómo los microtejidos son remodelados por la respuesta del huésped.

Después del procedimiento, los módulos pueden cultivarse en una placa de Petri u otros recipientes, como un biorreactor o un dispositivo microfluídico. Este método también puede adaptarse para crear diferentes tejidos utilizando diversas combinaciones de tipos celulares o tubos con distintos diámetros. Gracias por ver.