Fabricación de micro-tejidos, utilizando los módulos de gel de colágeno las células que contienen

El objetivo general de este procedimiento es producir microtejidos modulares que puedan utilizarse para experimentos de ingeniería de tejidos. Esto se logra primero tirando de la solución de colágeno en un tubo de polietileno, usando una jeringa, y luego gelificando el colágeno. El segundo paso es cortar el tubo de polietileno en longitudes de dos milímetros para formar los módulos de microtejido.

El tercer paso del procedimiento es separar los módulos del tubo y, por último, los módulos se recubren con células endoteliales. En última instancia, los microtejidos resultantes se pueden utilizar para ensayos celulares in vitro para estudiar la interacción de las células a través de una cámara microfluídica. Además, los microtejidos se pueden implantar para generar tejidos que permitan estudiar la interacción y remodelación de los microtejidos in vivo.

Hola, mi nombre es Brendan Long y pertenezco al Laboratorio Sepan de la Universidad de Toronto. Uno de los principales obstáculos en la creación de un gran sustituto de tejido 3D es la falta de una vascularización rápida después de la implantación. En este vídeo, te mostraremos cómo crear tejido modular recubierto con células endoteliales para ayudar a superar esta limitación.

El que demuestre el procedimiento será considerado por Chamberlain, un becario postoperatorio del laboratorio de Septin. La cantidad de colágeno a neutralizar dependerá de la longitud del tubo de polietileno. En esta demostración, utilizaremos un tubo de polietileno de dos metros con un diámetro interior de 0,76 milímetros y un diámetro exterior de 1,22 milímetros.

Para preparar el tubo, enhebre una aguja de 20 G en un extremo del tubo y luego coloque el tubo en una bolsa de conversión autorreparable para la esterilización por gas. Dado que un mililitro de colágeno llena unos dos metros de tubo de polietileno, neutralizaremos un mililitro de colágeno. Coloque el colágeno en un tubo cónico de 15 mililitros y mantenga el tubo en hielo.

Añadir 128 microlitros de 10 x alfa, MEM por mililitro de colágeno al tubo y mezclar pipeteando repetidamente la solución. Teniendo cuidado de minimizar la formación de burbujas, la solución debe volverse amarilla a medida que el alfa MEM se mezcla con el colágeno acidificado. A continuación, neutralice el colágeno añadiendo bicarbonato de sodio 0,8 molar Para una estimación general del pH, agregue bicarbonato de sodio hasta que la solución de colágeno amarillo adquiera un color rosa claro.

Por lo general, se necesitan de 30 a 60 microlitros por mililitro de colágeno para lograr un pH de 7,4. Para evitar que el colágeno neutralizado se gelifique, manténgalo en hielo hasta que esté listo para ser utilizado. Para comenzar el procedimiento de gelatinización del colágeno, lleve la bolsa que contiene el tubo de polietileno esterilizado a un gabinete de seguridad biológica y corte el extremo sellado de la bolsa mientras mantiene el tubo en la bolsa.

Use pinzas esterilizadas para conectar una jeringa de tres mililitros a la aguja de calibre 20 que se insertó previamente en un extremo del tubo. Inserte el otro extremo del tubo en el colágeno neutralizado hasta que la punta esté en el fondo del tubo cónico, que se mantiene en hielo. Este siguiente paso hay que hacerlo lentamente, de lo contrario, se introducen burbujas de aire en el colágeno.

Retraiga el émbolo de la jeringa lentamente para introducir el colágeno en el tubo de polietileno. Cuando el colágeno haya pasado a través del tubo, saque la aguja de calibre 20 y vuelva a colocar ambos extremos del tubo en la bolsa. Después de cerrar la bolsa con cinta adhesiva, incubar a 37 grados centígrados durante 60 minutos.

Se utilizará un dispositivo de corte preensamblado para cortar el tubo. Para comenzar este procedimiento, coloque el tubo en una bandeja estéril frente al dispositivo de corte y cargue el tubo en el dispositivo de corte en la salida del dispositivo de corte, configure un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de medios de células endoteliales. Para recoger los módulos de corte, configure el dispositivo de corte para cortar longitudes de dos milímetros de tubería y luego corte la tubería.

Incubar los módulos cortados en el tubo cónico de 50 mililitros a 37 grados centígrados durante 60 minutos. Para eliminar los módulos de colágeno de la tubería, vórtice, el tubo cónico de 50 litros que contiene los módulos a velocidad media. Durante 10 segundos, deje que el módulo se asiente en el fondo del tubo, lo que tarda unos cinco minutos.

Se formará una bolita suelta de módulos en la parte inferior del tubo, mientras que el tubo formará una capa encima del medio. Una vez que los módulos se hayan asentado, use una pipeta serológica de boca ancha de 10 mililitros para transferirlos a un tubo cónico de 15 mililitros. Vortex, el tubo cónico de 15 mililitros, y luego dejar que los módulos se asienten dos veces más.

Los módulos sedimentados del segundo y tercer vórtice también se transfieren al tubo de 15 mililitros. Después de que todos los módulos se hayan retirado del tubo y se hayan agrupado, lleve el volumen de medios en el tubo a cinco mililitros. Los módulos ya están listos para ser recubiertos con células endoteliales, que se mostrarán a continuación para preparar las células endoteliales para el recubrimiento de los módulos.

Primero, retire los medios de las celdas y lave con PBS. Después de eliminar el PBS, agregue tres mililitros de tripsina EDTA e incube durante cinco minutos a 37 grados centígrados. A continuación, resus, suspenda las células en siete mililitros de medio y transfiéralas a un tubo de 15 mililitros.

Cuente las células con un hemocímetro, necesitará cinco veces 10 a la sexta célula endotelial por mililitro de módulos empaquetados en la parte inferior del tubo cónico. Granular las células a 300 G durante cinco minutos. Vuelva a suspender el pellet de célula en cinco mililitros de medio de células endoteliales.

Ahora agregue cinco mililitros de medios que contengan células endoteliales a los módulos. Los módulos se incuban con las células endoteliales, tanto estática como dinámicamente para la incubación estática, se mezclan módulos con células endoteliales por inversión y luego se coloca el tubo en posición vertical a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Después de 15 minutos, invierta el tubo nuevamente e incube a 37 grados centígrados durante otros 15 minutos.

Para incubar los módulos con las células endoteliales de forma dinámica, balancee suavemente el tubo de 15 mililitros a 37 grados centígrados durante 60 minutos. Una vez completada la incubación con las células endoteliales, transfiera los módulos a una placa tratada con cultivo de tejidos y cocine durante la noche a 37 grados centígrados al día siguiente, coloque los módulos en una nueva placa tratada con cultivo de tejidos con medios frescos para eliminar las células endoteliales no adheridas. Incubar módulos que están recubiertos con células endoteliales a 37 grados centígrados hasta que las células cubran el 100% de la superficie de los módulos.

Esto suele tardar unos siete días. Los módulos se verán cilíndricos cuando se retiren del tubo por primera vez. Si están recubiertos con células endoteliales, pueden contraerse hasta un 50% en volumen y desarrollar una forma ovalada, además de volverse más densos y opacos cuando se observan mediante microscopía óptica.

En estas imágenes, el diámetro y la longitud de los módulos se indican con d y l respectivamente. La siguiente imagen muestra dos células Hep G incrustadas distribuidas uniformemente dentro de los módulos en el momento de la fabricación. Las células conservaron una alta viabilidad, como lo indica el color verde de las células vivas.

Las células muertas serían de color rojo cuando las células endoteliales son confluentes. En la superficie de los módulos, hay una formación de uniones estrechas, que se pueden ver por inmunofluorescencia. La tinción del análisis de transferencia de masa de cadherina VE ha demostrado que los módulos son capaces de soportar altas densidades celulares sin desarrollar un núcleo necrótico debido a un transporte de oxígeno inadecuado, que a menudo es problemático en tejidos más grandes.

En este ejemplo, la tinción masiva de módulos pequeños típicos muestra que los módulos mantuvieron una distribución uniforme y alta de células vivas siete días después de la fabricación. En contraste, se había formado un gran número de células muertas dentro del núcleo de los grandes módulos, dejando solo un borde delgado de células viables. También se han fabricado módulos con una mezcla de colágeno y un polímero de ína o que contienen microesferas liberadoras de fármacos.

Aquí, cuando las células h hm EC one están asentadas en módulos de colágeno palin, los módulos conservan su forma cilíndrica y las propiedades de unión celular son limitadas en comparación con los módulos de colágeno solamente. Aquí se muestra una imagen de microscopio óptico de un módulo de colágeno que contiene microesferas biodegradables basadas en PLGA. Se ha demostrado que varios ensayos in vitro son compatibles con los módulos.

Por ejemplo, en un ensayo de angiogénesis, las formaciones capilares en un módulo asentado con células endoteliales se pueden detectar y cuantificar fácilmente después de cinco días de incubación con células madre derivadas del tejido adiposo. En otro ejemplo, las imágenes de microscopía confocal de un ensayo de muertos vivos en módulos muestran células vivas teñidas de verde y células muertas teñidas de rojo. Por último, también se han utilizado módulos en cámaras microfluídicas y se han implantado en ratones y ratas para estudiar la interacción entre diferentes tipos de células y cómo los microtejidos se remodelan por la respuesta del huésped.

Siguiendo el procedimiento, los módulos se pueden cultivar en una placa de Petri u otros recipientes como un biorreactor o un dispositivo microfluídico. Este método también se puede adaptar para crear diferentes tejidos mediante el uso de varias combinaciones de tipos de células o el uso de tubos con diferentes diámetros. Gracias por mirar.