Aplicación de un ensayo de C. elegans la degeneración neuronal de dopamina para la validación del potencial de la enfermedad de Parkinson genes

Este video muestra cómo utilizar C. elegans para evaluar la neurodegeneración nerviosas dopaminérgicas como un modelo para la enfermedad de Parkinson. Además, las pantallas de genética se utilizan para definir los factores que mejoran la degeneración o neuroprotectoras.

En el Caldwell Lab, también conocido como Worm Shack, estudiamos los mecanismos de las enfermedades neurológicas en la elegancia marina. Y después de un largo día de experimentación fructífera, nos recompensamos con alguna actividad recreativa. Hola, soy Adam Knight, estudiante de pregrado del Laboratorio Calwell en el Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Alabama.

Hoy, yo y otros mostraremos cómo realizar un ensayo de degeneración de neuronas dopaminérgicas en C Elegants. Cruzaré una cepa de gusano neurodegenerativo dopaminérgico con cepas transgénicas que sobreexpresan genes relacionados con enfermedades candidatas y neuronas dopaminérgicas. Hola, soy Adam Harrington, estudiante de posgrado en el Laboratorio Caldwell.

Hoy te mostraré cómo configurar los gusanos transgénicos para el análisis de neuronas dopaminérgicas. Hola, soy Shu Amichi y soy estudiante de posgrado. Aquí te mostraré cómo ensayar entrar en tus neuronas dopaminérgicas de C elegance, que se llaman ceps y ayudas.

En general, los gusanos que expresan solo GFP en las neuronas dopaminérgicas no exhiben muerte celular. Sin embargo, en presencia de CLE, observará éstas y la neurodegeneración dependiente de la edad Utilizando este ensayo, un transgén podría coexpresarse en las neuronas de dopamina para determinar si puede aumentar o suprimir la toxicidad inducida por CLE. Así que comencemos.

Antes de llevar a cabo el análisis de la neurona dopaminérgica, primero debemos cruzar las cepas de GaN apropiadas para comenzar a colocar ocho molinos que expresan tanto el núcleo alfa como la GFP bajo el control del promotor específico de la neurona dopamina en la placa de acoplamiento. Ahora agregue dos afroditas ca-transgénicas de cuatro etapas L que exhiben la expresión específica de la neurona dopaminérgica de nuestro gen candidato de interés, así como la expresión de células musculares de la pared corporal del marcador seleccionable DS rojo dos fluorescentes. Es importante tener en cuenta que para cada construcción de transgén generamos tres líneas transgénicas estables.

Por lo tanto, este cruce genético debe realizarse individualmente para cada una de las tres líneas estables separadas creadas. Después de dos días, retire y deseche los machos después de dos o tres días adicionales. Inspecciona la generación de F1.

Hay varias progenies masculinas y el apareamiento fue exitoso. A continuación, transfiera individualmente a las nuevas placas cinco de Aphrodite L, cuatro animales de cada cruza que exhiban tanto el marcador fluorescente GFP heredado del progenitor masculino como el marcador muscular de la pared corporal fluorescente DS rojo dos heredado del progenitor hamadi. Los animales transferidos deben estar en la etapa L cuatro para asegurarse de que aún no la han M.

Con los animales machos presentes en el plato, permita que los animales se autofertilizen durante tres o cuatro días para producir dos progenies. Ahora limpia la progenie F dos para hacer esto. Transfiera de cinco a 10 animales que exhiban ambos marcadores de centavos a sus propios platos individuales.

A continuación, examina la generación F tres en busca de placas en las que el cien por cien de los animales expresan GFP en las neuronas dopaminérgicas y en las que algunos de los animales expresaban el rojo DS, dos marcadores fluorescentes y células musculares de la pared corporal. Estos animales serán homocigotos para los genes alfa sinucleína y GFP y también transmitirán de manera estable el transgén recién creado. Una vez finalizado el cribado, estamos listos para realizar el análisis de las neuronas dopaminérgicas.

Para comenzar el análisis de neuronas, prepare una placa fresca de los tres animales F identificados en el paso anterior. Coloque un plato para cada una de las tres líneas de transgénicos. Además, la alfa-sinucleína GFP solo cepa como control permite que los gusanos crezcan hasta la edad adulta.

Una vez que los gusanos hayan alcanzado la edad adulta, transfiera de 30 a 40 animales transgénicos de cada línea a un plato nuevo. Déjalos poner huevos durante cinco horas a 20 grados centígrados. Después de cinco horas, retire y deséchelo.

Los adultos permiten que los embriones se desarrollen durante tres o cuatro días a 20 grados centígrados hasta que alcanzan la etapa L cuatro. A continuación, elija alrededor de cien animales transgénicos L 4 en un plato que contenga 0,04 miligramos por mililitro de cinco fluorescentes. Dos uridinas desoxi.

Este análogo de nucleótidos impide el desarrollo de la próxima generación a través de la inhibición de la síntesis de ADN. Dado que las placas FDUR son sensibles a la luz, protéjalas de la luz manteniendo las placas bajo cubierta y envueltas en su totalidad. Haga una almohadilla bruta para el análisis de gusanos.

Estos se usan frescos y no se dejan secar. Coloque dos portaobjetos de microscopio que tengan un trozo de cinta adhesiva a través de ellos. A lo largo. La cinta sirve como espaciador para almohadillas de grosor equivalente.

Coloque un tercer tobogán entre ellos en el banco. Están posicionados. Tres en fila.

Coloque una gota de arus fundido en el lado central y coloque rápidamente otro portaobjetos encima de los agros perpendiculares dos y a través de los tres portaobjetos. Repita para hacer varias almohadillas adicionales, tantas como sean necesarias para el número de muestras que se van a analizar. Una vez que las almohadillas de la barrena estén listas, coloque una gota de seis microlitros de tres milimolares, sierra de 11 millas y anestésico en un cubreobjetos de 22 por 30 milímetros.

Elija 40 animales adultos en la gota y luego invierta el cubreobjetos en la almohadilla agrícola. Repita para cada una de las otras líneas. Puntúa 30 animales por línea para la presencia de cada CEP y una neurona D.

Usando un microscopio compuesto con epifluorescencia en un cubo de filtro que permite la visualización de FITC o GFP, usaremos un cubo de filtro endo G-F-P-H-Y-Q registra los datos en una hoja de puntuación. Los animales de tipo salvaje conservan GFP completa para las lecciones en las cuatro neuronas CEP y dos neuronas A DE. Los animales individuales que exhiben pérdida de neuronas D se califican como de tipo salvaje conocido o degenerados.

Estas neuronas se registran como LG o pérdida de GFP. Del mismo modo, se puede puntuar el grado de degeneración contando el total de neuronas perdidas en cada animal y la población repite el análisis dos veces más. Utilizando 30 animales más por línea por ensayo.

Se promedia el número total de gusanos que exhiben neuronas dopaminérgicas de tipo salvaje de las tres rondas de análisis. A continuación, se realiza un análisis estadístico de la neuroprotección utilizando el valor P de la prueba T del estudiante inferior a 0,05. Para comparar los gusanos de control con las cepas que sobreexpresan genes candidatos en las neuronas dopaminérgicas se lleva a cabo este análisis de varios días después de la línea de huevos, los días apropiados de análisis de determinado empíricamente.

Por ejemplo, hemos determinado que el 77%87% y el 90% de los animales alfa CLE más GFP exhiben neuronas dopaminérgicas degeneradas en los días seis, siete y 10 después del desarrollo, respectivamente. Por lo tanto, si predecimos que el transgén de interés podría potenciar la neurodegeneración, lo analizaremos al sexto día. Del mismo modo, se analizarán los transgenes que podrían suprimir la neurodegeneración a los siete y 10 días.

Acabamos de mostrarte cómo realizar un ensayo de neurodegeneración de dopamina en el mar elegance. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que se debe utilizar un marcador adecuado para la selección durante los cruces genéticos. Dos, usar machos sanos y L cuatro HEDIS para los cruces.

Y tres, asegúrese de puntuar cuidadosa y consistentemente las neuronas CEP y una DE. Este procedimiento le permitirá analizar rápidamente el factor genético que puede mejorar o suprimir la neurodegeneración inducida por alfa alfa CLE. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.