Aplicación de un ensayo de C. elegans la degeneración neuronal de dopamina para la validación del potencial de la enfermedad de Parkinson genes

En el laboratorio Caldwell, también conocido como el Worm Shack, estudiamos los mecanismos de enfermedades neurológicas en Caenorhabditis elegans. Y tras un largo día de experimentación fructífera, nos recompensamos con alguna actividad recreativa. Hola, soy Adam Knight, estudiante de pregrado del Laboratorio Calwell en el Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Alabama.

Hoy, yo y otros mostraremos cómo realizar un ensayo de degeneración de neuronas dopaminérgicas en C. elegans. Realizaré un cruce entre una cepa de gusanos con neurodegeneración dopaminérgica y cepas transgénicas que sobreexpresan genes candidatos relacionados con enfermedades y neuronas dopaminérgicas. Hola, soy Adam Harrington, estudiante de posgrado en el laboratorio de Caldwell.

Hoy les mostraré cómo preparar los gusanos transgénicos para el análisis de neuronas dopaminérgicas. Hola, soy Shu Amichi y soy estudiante de posgrado. Aquí les mostraré cómo analizar sus neuronas dopaminérgicas de C. elegans, que se denominan ceps y aides.

Generalmente, los gusanos que expresan solo GFP en las neuronas dopaminérgicas no presentan muerte celular. Sin embargo, en presencia de CLE, observará neurodegeneración dependiente de la edad. Mediante este ensayo, se puede coexpresar un transgén en las neuronas dopaminérgicas para determinar si es capaz de potenciar o suprimir la toxicidad inducida por CLE. Así que comencemos.

Antes de llevar a cabo el análisis de neuronas dopaminérgicas, primero debemos cruzar las cepas GaN apropiadas para colocar ocho ejemplares que expresen tanto el nucleo de alfa como GFP bajo el control del promotor específico de neuronas dopaminérgicas dat-1 en una placa de apareamiento. Ahora agregue dos lombrices transgénicas en estadio L4 de Caenorhabditis elegans hermafroditas que exhiban expresión específica de neuronas dopaminérgicas de nuestro gen candidato de interés, así como expresión en células del músculo de la pared corporal del marcador selectivo fluorescente DSRed2. Es importante tener en cuenta que para cada construcción transgénica generamos tres líneas transgénicas estables.

Por lo tanto, este cruce genético debe realizarse individualmente para cada una de las tres líneas estables independientes creadas. Después de dos días, retire y deseche los machos tras un período adicional de dos a tres días. Inspeccione la generación F1.

Hay varios descendientes machos y el apareamiento fue exitoso. A continuación, transfiera individualmente a nuevas placas cinco animales L4 de Afrodita de cada cruzamiento que exhiban tanto el marcador fluorescente GFP heredado del progenitor macho como el marcador rojo DS de dos músculos de la pared corporal fluorescentes heredado del progenitor hamadi. Los animales transferidos deben estar en la etapa L4 para asegurar que aún no hayan experimentado la mitosis.

Con los animales macho presentes en la placa, permita que los animales se autofecunden durante tres a cuatro días para producir descendencia F2. Ahora elimine la descendencia F2 para hacer esto. Transfiera cinco a 10 animales que presenten ambos marcadores cent a placas individuales separadas.

Luego, examine la generación F3 en placas en las que el cien por ciento de los animales expresa GFP en las neuronas dopaminérgicas y en las que algunos de los animales expresan el marcador fluorescente DS Red2 en las células del músculo de la pared corporal. Estos animales serán homocigotos para los genes de la alfa-sinucleína y GFP, y además transmitirán de forma estable el transgén recién creado. Una vez finalizada la selección, estaremos listos para realizar el análisis de las neuronas dopaminérgicas.

Para comenzar el análisis de las neuronas, prepare una placa fresca con los tres animales F identificados en el paso anterior. Prepare una placa para cada una de las tres líneas transgénicas. Además, plaque la cepa que expresa únicamente la alfa-sinucleína GFP como control y permita que los gusanos crezcan hasta la edad adulta.

Una vez que los gusanos hayan alcanzado la edad adulta, transfiera de 30 a 40 animales transgénicos de cada línea a una placa fresca. Deje que depositen huevos durante cinco horas a 20 grados Celsius. Después de cinco horas, retire y deseche los animales.

Los adultos permiten que los embriones se desarrollen durante tres o cuatro días a 20 grados Celsius hasta que alcancen la etapa L4. A continuación, seleccione aproximadamente cien animales transgénicos en etapa L4 y colóquelos en una placa que contenga 0,04 miligramos por mililitro de cinco fluorodesoxiuridina.

Este análogo de nucleótido impide el desarrollo de la siguiente generación mediante la inhibición de la síntesis de ADN. Dado que las placas FDUR son sensibles a la luz, protéjalas de la luz manteniéndolas cubiertas y envueltas completamente. Prepare una almohadilla de agar para el análisis de los gusanos.

Estos se utilizan frescos y no se deben dejar secar. Coloque dos portaobjetos con una tira de cinta adhesiva colocada a lo largo de ellos. La cinta sirve como espaciador para obtener almohadillas de espesor equivalente.

Coloque un tercer portaobjetos entre ellos sobre el banco. Están posicionados. Tres alineados.

Coloque una gota de arus fundido en el lado central e inmediatamente coloque otra portaobjetos encima del agros perpendicularmente a las dos y cruzando los tres portaobjetos. Repita el procedimiento para preparar varias almohadillas adicionales, tantas como sean necesarias para el número de muestras que se van a analizar. Una vez que las almohadillas de auger estén listas, coloque una gota de seis microlitros de anestésico de 3 milimolar, 11 millas de sierra, sobre un cubreobjetos de 22 por 30 milímetros.

Coloque 40 animales adultos en la gota y luego invierta el cubreobjetos sobre la almohadilla de agarosa. Repita este procedimiento para cada una de las demás líneas. Evalúe 30 animales por línea para determinar la presencia de cada CEP y de una neurona D.

Utilizando un microscopio compuesto con epifluorescencia y un cubo de filtros que permita la visualización de FITC o GFP, emplearemos un cubo de filtros endo G-F-P-H-Y-Q para registrar los datos en una hoja de puntuación. Los animales de tipo salvaje conservan completamente el GFP en las lecciones de las cuatro neuronas CEP y las dos neuronas ADE. Los animales individuales que presenten pérdida de las neuronas D se clasifican como de tipo salvaje conocido o degenerativos.

Estas neuronas se registran como LG o pérdida de GFP. Asimismo, el grado de degeneración puede calificarse contando el número total de neuronas perdidas en cada animal, además de repetir la población el análisis otras dos veces. Utilizando 30 animales más por línea por ensayo.

Se promedia el número total de gusanos que presentan neuronas dopaminérgicas de tipo silvestre de las tres rondas de análisis. Luego se realiza el análisis estadístico para la neuroprotección utilizando la prueba t de Student con un valor P menor a 0,05. Para comparar los gusanos del control con cepas que sobreexpresan genes candidatos en neuronas dopaminérgicas, realice este análisis en varios días posteriores a la siembra de huevos; los días adecuados para el análisis se determinan empíricamente.

Por ejemplo, hemos determinado que el 77 %, el 87 % y el 90 % de los animales alfa CLE más GFP presentan neuronas dopaminérgicas degeneradas a los seis, siete y diez días posteriores al desarrollo, respectivamente. Por lo tanto, si predecimos que el transgén de interés podría potenciar la neurodegeneración, realizaremos el análisis al sexto día. Asimismo, los transgén que podrían suprimir la neurodegeneración se analizarán al séptimo y décimo día.

Acabamos de mostrarle cómo realizar un ensayo de neurodegeneración dopaminérgica en *C. elegans*. Al llevar a cabo este procedimiento, es importante recordar: primero, utilizar el marcador adecuado para la selección durante los cruces genéticos; segundo, utilizar machos sanos y hembras L4 para los cruces.

Y tres, asegúrese de puntuar cuidadosa y consistentemente las neuronas CEP y DE. Este procedimiento le permitirá analizar rápidamente factores genéticos que podrían potenciar o suprimir la neurodegeneración inducida por CLE alfa alfa. Eso es todo.

Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.