Asistida por ordenador a gran escala de visualización y cuantificación de los islotes pancreáticos, distribución de tamaño y arquitectura

El objetivo general de este procedimiento es recopilar datos representativos imparciales dentro de una muestra limitada y analizar con precisión la compleja estructura tridimensional del tejido. Esto se logra capturando primero cortes virtuales de inmunohisto, secciones pancreáticas teñidas químicamente. A continuación, los cortes virtuales se cuantifican con la macro de corte virtual IHC en el software image J, y los datos se analizan con scripts escritos para Mathematica.

A continuación, se realiza una reconstrucción en 3D de los cortes virtuales utilizando la Imagen J. El paso final del procedimiento es capturar una pila de imágenes de islotes individuales utilizando el software del libro de diapositivas y mapear las pilas de imágenes manualmente en tres dimensiones utilizando un investigador estéreo. En última instancia, se puede obtener una arquitectura de ojal precisa con coordenadas 3D para cada celda de ojal a través de un método combinado de imágenes 3D y mapeo manual. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los estudios sobre la obesidad y la diabetes, como la forma fisiológica y la trayectoria de las afecciones fisiológicas afectan al páncreas, la distribución de los ojales de la masa de células beta y la arquitectura.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico o tratamiento de la obesidad y la diabetes melitis, ya que una mejor comprensión de los cambios en la masa de células beta facilitará el desarrollo y la evaluación de intervenciones terapéuticas. Aunque los métodos descritos en el presente estudio proporcionan específicamente información sobre el análisis inmunohistoquímico dinámico del páncreas, también se puede aplicar a una variedad de otros organismos y tejidos. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos del análisis asistido por computadora son difíciles de aprender.

Debido a la complejidad de analizar conjuntos de datos tan grandes en dos y tres dimensiones. Comience este procedimiento colocando un portaobjetos limpio que contenga una sección completa de un páncreas teñido químicamente con inmunohisto, en el soporte de un microscopio fluorescente. Abra el software del investigador estéreo y visualice la muestra haciendo clic en adquisición.

Y luego la imagen en vivo. Determine los niveles de exposición para cada canal utilizando la ventana de histograma de vídeo, que muestra la intensidad de la fluorescencia. En este ejemplo, el canal dos se utiliza para DAP, el canal tres para GFP, el canal cuatro para RFP, el canal cinco para sci cinco y el canal seis para SCI siete.

Con la ventana de configuración de la cámara, ajuste el nivel de exposición para que la intensidad de la fluorescencia disminuya. En el extremo derecho del histograma de vídeo, la imagen se puede enfocar con la rueda de enfoque del microscopio. Antes de crear un corte virtual, contornee la muestra haciendo clic en la pantalla en un punto alejado de la muestra, lo que marcará un punto de referencia.

A continuación, haga clic alrededor del contorno de la muestra cuando el contorno esté completo. Haga clic con el botón secundario y seleccione Cerrar contorno para conectar los puntos inicial y final una vez que se cierre el contorno, capture un corte virtual para la muestra seleccionando adquisición y, a continuación, adquiera un corte virtual. Cuando se abran las opciones de la ventana de corte virtual, seleccione adquisición de alta velocidad, así como deshabilitar manual.

Enfoque desmarcando la casilla junto a manual. Guarde el archivo. Calibre el prefo haciendo clic con el botón derecho y seleccionando agregar a la lista de sitios de enfoque.

Enfoque manual de varias secciones aleatorias en la vista previa del sector virtual Cuando se hayan centrado varios sitios, inicie el corte virtual haciendo clic con el botón derecho y seleccionando. Inicie el corte virtual con prefo una vez que se complete el corte virtual para la primera muestra, cambie al siguiente canal y ajuste la exposición en consecuencia. Este procedimiento se repite para cada canal para realizar la cuantificación de los ojales, procese las imágenes utilizando una macro de imagen J denominada I-H-C-V-S, que primero prepara las imágenes cargadas para el análisis y, a continuación, cuantifica las características de los ojales, como la composición celular.

Las macros I-H-C-V-S dividen la pila en sus respectivos canales de color. En la imagen J convierte cada imagen en una máscara en blanco y negro de ocho bits. Después de la intensidad automática, el umbral y la suma de las imágenes de canal separadas juntas aritméticamente en una máscara compuesta.

El análisis de partículas incorporado de Image J en la imagen compuesta identificará las regiones de interés o el retorno de la inversión, al tiempo que excluirá las partículas más pequeñas que una célula beta. La cuantificación de los ROIs. El uso de la imagen J produce una hoja de cálculo de los parámetros de la celda.

Guarde los resultados agregados en una hoja de cálculo de Excel. Almacenamiento de datos como la circularidad del perímetro del área, el diámetro del orificio y el centro del ojal para cada ojal, junto con los números correspondientes etiquetados en la imagen. El análisis computacional de estos parámetros se puede realizar como se describe en el protocolo escrito. Para revelar información, incluida la distribución de ojales y el análisis de frecuencia, realice la reconstrucción en 3D de cortes virtuales mediante la ejecución de un script que convierta todas las dos imágenes JP en el directorio en archivos TIF, que es el formato utilizado en la construcción y cuantificación de pilas tridimensionales a partir de los cortes virtuales.

Aquí, se utiliza un script llamado I MJ two two tiff. Copie el script en el directorio que contiene las dos imágenes JP. Ejecute el script con el shell de Linux escribiendo punto barra diagonal I am JP two two TIFF en la consola y luego presionando enter.

Cuando todas las imágenes capturadas se han convertido de JP dos a archivos TIFF, están listas para ser utilizadas para el análisis en la imagen J. Usando la imagen J, abra todas las imágenes de la primera muestra, que en este caso son de un páncreas fetal humano y combínelas como una seleccionando imagen, color, y, a continuación, fusionar canales. Repita este proceso para cada una de las muestras cuando todas las muestras se hayan combinado como imágenes individuales. Limpie las imágenes seleccionando las regiones no deseadas con la herramienta de selección de polígonos.

Rellénelos seleccionando editar y, a continuación, rellenar. Convierte cada imagen en una imagen en color RGB. Finalmente, cree una pila a partir de las imágenes, después de lo cual se pueden alinear aún más con el complemento de registro de pila.

En última instancia, la fusión de los canales y la combinación de las imágenes crea un montaje en 3D de todos los ojales de todo el páncreas. Para recolectar pilas de imágenes, coloque los ojales pancreáticos de toda la montura bajo el microscopio. Aplique agua si usa una lente de objetivo de inmersión en agua.

Abra el software del libro de diapositivas, acceda al control de captura y enfoque pulsando control más shift más E en la ventana de control de enfoque. Ajuste el objetivo a 20 veces o 40 veces dependiendo del tamaño del ojal. Para utilizar el ocular del microscopio para localizar los ojales, establezca el intervalo en dos veces y el conjunto de filtros en el usuario uno.

En la ventana de control de enfoque, la selección de emisión debe establecerse en 100%Eyes en densidad neutra debe configurarse en GFP ey con un solo clic, y luego abrir el piso para visualizar la muestra en el libro de diapositivas, regrese a la ventana de control de enfoque y cambie el filtro configurado para fijar. A continuación, haga clic en G-F-P-D-S. Utilice el joystick para centrar el ojal en la cámara una ventana lo mejor posible.

Enfócate a una profundidad cercana al centro del ojal donde las celdas se puedan discernir fácilmente. En la ventana de control de enfoque, seleccione el zab. Utilice el control de visor para desplazarse hasta la profundidad superior del ojal en la que se puedan distinguir claramente las características y haga clic en establecer techo.

Desplázate hasta la parte inferior del ojal y haz clic en establecer. Abajo, haga clic en ir. Para volver al punto de referencia en la ventana de captura, haga clic en avanzado y, a continuación, en el modo alternativo al canal.

Establezca el factor de ubicación en dos veces y el tipo de captura en 3D en el lado derecho de la ventana, haga clic en usar las posiciones superior e inferior y regrese al volumen central después de la captura. Establezca el tamaño del paso en tres. Establezca el conjunto de filtros para que viva debajo del cuadro del conjunto de filtros.

Seleccione DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-u y SCI five DSU. Para cada uno, haga clic en Buscar mejor en Ajustar exposición. A continuación, haga clic en probar para asegurarse de que la exposición seleccionada es adecuada.

Haga clic en iniciar para comenzar la captura. Cuando se complete la captura, ajuste los niveles según sea necesario y cambie el color mostrado para RFP a blanco. Guarde la diapositiva y vaya a ver la exportación de la serie TIFF.

Escriba el nombre de la diapositiva con un guión al final y guárdelo. Se crean docenas de archivos TIF individuales, por lo que puede ser útil mantener cada pila de imágenes de ojales en una carpeta separada. Para mapear pilas de imágenes, abra el software de investigación estéreo.

Visualice la imagen abriendo las pilas de imágenes en el menú de escala de imágenes. Establezca la distancia entre imágenes en tres micras para corregir la flexión dos veces. En el libro de diapositivas, seleccione invalidar la escala X e Y y use un origen especificado para la escala X e Y.

Ingrese 0.65 para el centro X e Y y acerque la imagen haciendo clic en el botón de zoom, y luego en el medio de los ilis de interés en el mercado de la ventana macro al menos una celda. Con el marcador adecuado, las células beta aparecerán en verde. Las células alfa aparecerán en rojo y las células delta en blanco.

Marque las células en el centro de su núcleo, que aparecerá en azul si la muestra se ha teñido con DPI, use el marcador dos para marcar las células beta. Marcador cinco para marcar las células alfa y marcador seis para marcar las células delta. Una vez que se haya marcado al menos una celda, muestre la vista ortogonal usando el icono en el menú superior, marque Filtro Z y simétrico.

El intervalo debe establecerse en 15,00. A partir de la Z 0.0.Desplácese por los ojales con la rueda del ratón y marque cada celda con el marcador adecuado, marque cada celda solo una vez en el centro de su profundidad. Al terminar de marcar cada uno de los niveles Z, se puede desmarcar la casilla de verificación Filtro Z.

Esto mostrará todos los marcadores de todos los niveles Z. Cuando se hayan marcado todas las celdas, guarde el archivo como un archivo DAT. A continuación, vaya a Seguimiento de exportación de archivos.

Guarde el calco como un archivo TXT. Por último, haga clic en nuevo archivo de datos para borrar el espacio de trabajo antes de intentar asignar nuevos ojales. La preparación de cortes virtuales a partir de una muestra de páncreas teñida con inmunohistoquímica permite el examen de las células endocrinas alfa, beta y delta en todo el páncreas juntas, ya que la tinción inmunohistoquímica de los islotes para la insulina se puede ver en verde, el glucagón en rojo, la somatostatina en blanco y el dap en azul.

A continuación, las imágenes se convierten a la máscara de ocho bits después del umbral automático. Aquí se muestra la imagen compuesta de combinación. Sin embargo, la distribución de ojales mediante corte virtual también permite el análisis individual en canales separados.

Aquí, se muestran las vistas de cada canal para revelar las células delta, las células beta y las células alfa. El análisis de partículas se realiza sobre una máscara compuesta que muestra cada estructura de ojal numerada y resaltada en azul. El análisis de partículas de las máscaras compuestas se genera como una tabla de datos que contiene parámetros como la circularidad del perímetro del área de Islas y los diversos diámetros de cada ojal detectado, que tienen identificadores que corresponden a las etiquetas numeradas de la máscara compuesta.

El análisis a gran escala de estas imágenes da como resultado la producción de histogramas de distribución de tamaño y número total de ojales, así como comparaciones detalladas de las áreas de células alfa, beta y delta. El mapeo de ojales y el análisis matemático de la composición y arquitectura celular pueden revelar un solo plano focal a partir de una pila de imágenes reconstruidas en 3D de un ojal humano cargadas en un investigador estéreo. Aquí, las células beta están en verde, las células alfa en rojo, las células delta en blanco y los núcleos en azul.

Después de la captura de ojales distintos, las células alfa, beta y delta se marcan en varios hidroaviones, aquí se muestran imágenes fluorescentes y los datos de mapas correspondientes para tres planos focales diferentes en un intervalo de 10 micras. Una vez que las células alfa, beta y delta se han marcado en varios planos, el ojal se puede visualizar en 3D. Aquí se muestra una reconstrucción en 3D del ojal cortado en un cuarto basado en las coordenadas obtenidas por el mapeo de ojales.

Además, el análisis matemático automatizado de los ojales mapeados puede mostrar la composición y la arquitectura celular. Aquí, se muestra la frecuencia relativa de las distancias de las celdas entre dos celdas en una sola población de celdas. También se muestra la frecuencia relativa de las distancias entre dos poblaciones celulares diferentes.

También se muestran las probabilidades acumulativas de las distribuciones de distancia de célula a célula para las células alfa a alfa, beta a beta y delta a delta. Sobre estas probabilidades se puede realizar la prueba de Cole, OV, Smirnov o KS para obtener las distancias KS correspondientes. Una vez dominado, las imágenes y el análisis a gran escala de una sección completa de tejido se pueden realizar en cuatro horas.

La reconstrucción 3D de un bloque de tejido se puede realizar en 30 minutos. Por último, las imágenes 3D y el mapeo manual pueden completarse en cuatro horas si se realizan correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante comenzar con una tinción inmunohistoquímica de alta calidad de las secciones.

La precisión del análisis posterior dependerá de los datos brutos. Además, asegúrese de que sus computadoras tengan al menos ocho gigabytes de RAM para procesar dicho análisis a gran escala después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para los investigadores, no solo en el campo de la obesidad y la diabetes, sino ampliamente en muchos otros campos que utilizan el análisis patológico estándar.

Puede ser particularmente útil cuando la disponibilidad de muestras es limitada. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo recopilar datos representativos imparciales dentro de un tamaño de muestra limitado utilizando técnicas estándar. Seleccionar solo una región específica puede no ser representativo de todo el pancreas, como hemos demostrado utilizando nuestro estudio de distribución de ojales pancreáticos.