Name: Visualización longitudinal estabilizada a nivel celular in vivo del páncreas en un modelo murino con una ventana de imágenes intravitales pancreáticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Aprende a realizar imágenes intravitales longitudinalmente estabilizadas del páncreas a nivel celular en ratones. Este método permite visualizar islotes y células cancerosas durante tres semanas con resolución tridimensional.

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Este estudio fue apoyado por la subvención No. 14-2020-002 del Fondo de Investigación SNUBH y por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno de Corea (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).

Todos los procedimientos descritos en este documento se llevaron a cabo de acuerdo con la8ª edición de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (2011)26 y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Instituto Avanzado de Ciencia y Tecnología de Corea (KAIST) y el Hospital Bundang de la Universidad Nacional de Seúl (SNUBH).
1. Preparación de la ventana y otros materiales
<ol><li>Diseño personalizado de la ventana de imágenes intravitales pancreáticas para separar el páncreas del intestino en la cavidad abdominal18 (Figura 1A,B). Un plano detallado de la ventana se describe en una figura complementaria de un estudio anterior18.</li>
	<li>Use ratones C57BL / 6N, machos de 8 a 12 semanas de edad, para imágenes pancreáticas intravitales. Inyecte anticuerpos anti-CD31 conjugados con un fluoróforo Alexa 647, 2 h antes de la toma de imágenes, con el fin de etiquetar los vasos18.</li>
	<li>Para el estudio de islotes, prepare un modelo de ratón transgénico en el que los islotes se etiqueten con una proteína reportera fluorescente. Aquí, utilizamos MIP-GFP, donde la proteína fluorescente verde se expresó bajo el control del promotor del gen insulina 1 de ratón, que está activo en las células beta de todos los islotes en elratón 24.</li>
	<li>Para el estudio del cáncer de páncreas, prepare células cancerosas transgénicas marcadas con una proteína reportera fluorescente y ratones desnudos BALB / C. En este estudio, se utilizaron los glóbulos rojos PANC-1 NucLight. Las células cancerosasPANC-1 25 fueron etiquetadas con la sonda fluorescente NucLight Red.</li>
	<li>Esterilice todas las herramientas quirúrgicas, cubra el vidrio (con PEG o no) y visualmente las ventanas con un autoclave.</li>
	<li>Aplique el recubrimiento PEG al vidrio de la cubierta para prevenir la respuesta inflamatoria y aumentar la biocompatibilidad, que es adecuada para imágenes a largo plazo.</li>
</ol>2. Cirugía
<ol><li>Preparar una plataforma quirúrgica estéril y esterilizar las superficies con etanol al 70%. NOTA: Para las sesiones de imagen longitudinal, la técnica aséptica es esencial.</li>
	<li>Anestesiar ratones con una mezcla de tiletamina/zolazepam (30 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg). NOTA: Se recomienda el uso de tiletamine/zolazepam en lugar de ketamina debido a su efecto adverso de hiperglucemia. Se debe seleccionar la anestesia óptima para el propósito del experimento9,27.</li>
	<li>Controle la temperatura corporal con una sonda rectal con una almohadilla térmica homeotérmica controlada.</li>
	<li>Afeitar el flanco izquierdo del ratón y aplicar tres rondas de exfoliante alternado a base de alcohol y yodo. NOTA: Si se utiliza crema depilatoria, no dejar más de 1 minuto para evitar quemaduras químicas.</li>
	<li>Haga una incisión de 1,5 cm en el flanco izquierdo del ratón y diseccione la piel y el músculo.</li>
	<li>Realice una sutura de cuerda de bolso con una sutura negra o de nylon 4-0 en el margen de la incisión.</li>
	<li>Use un micro retractor en la incisión y exponga suavemente el bazo.</li>
	<li>Acondicie cuidadosamente el bazo con forrceps anulares e identifique el páncreas.</li>
	<li>Coloque la ventana en el flanco del mouse y pase el bazo y el páncreas a través del espacio abierto de la ventana. La manipulación del páncreas tiene que ser muy gentil, ya que puede causar sangrado o pancreatitis</li>
	<li>Coloque suavemente el páncreas en la placa de la ventana de imágenes; el bazo se colocará en el espacio abierto de la ventana.</li>
	<li>Para el estudio de células cancerosas, inyecte PANC-1 NucLight Red (1.0 x 106 células) directamente en el páncreas. NOTA: Para obtener imágenes de los xenoinjertos ortotópicos de cáncer de páncreas humano, se podría facilitar la implantación directa de células cancerosas como PANC-1 u otra célula de cáncer de páncreas humano28. Para visualizar con microscopía de fluorescencia intravital, las células PANC-1 fueron transducidas con proteína fluorescente roja utilizando el reactivo lentiviral NucLight Red que marca el núcleo29. Aunque el volumen máximo de inyección es incierto, disminuya el volumen lo más posible para evitar el efecto de presión en el páncreas.</li>
	<li>Aplique gotas de pegamento de N-butil cianoacrilato en el margen de la ventana de imágenes.<ol>
<li>Para minimizar la cantidad de pegamento aplicado, use una aguja de catéter de 31 G para la aplicación. Si la cantidad de la gota es grande, entonces el tejido se adherirá involuntariamente a la ventana o al vidrio de la cubierta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aplique suavemente un vidrio de cubierta redonda de 12 mm en el margen de la ventana de imágenes.</li>
	<li>Tire del lazo de sutura para que quepa en la ranura lateral de la ventana y átelo tres veces.</li>
	<li>Cortar el sitio proximal máximo del nudo para evitar la interrupción de los puntos apretados cuando estos ratones están despiertos.</li>
	<li>Deje que los ratones se recuperen de la anestesia (2-3 horas) e inyecte ketoprofeno (5 mg / kg, subcutáneo en la piel suelta en la base del cuello o la cadera del animal) para aliviar el dolor. Reevalúe los signos de dolor cada 12 horas y el ketoprofeno debe considerarse cada 24 horas durante 1-3 días. NOTA: La analgesia influye en la secreción de insulina en respuesta a la glucosa9. La elección y el momento de la analgesia deben individualizarse para el propósito experimental.</li>
	<li>Acomode al ratón en la jaula con suficiente ropa de cama para evitar el contacto de la ventana con la jaula. Evite alojar la casa con los ratones sin la cirugía de ventana.</li>
</ol>3. Imágenes intravitales
<ol><li>Encienda el microscopio intravital, incluida la potencia del láser.</li>
	<li>Encienda la almohadilla térmica y configure la regulación homeotérmica a 37 °C. NOTA: Alternativamente, use una almohadilla térmica pasiva o una lámpara con control frecuente si no hay regulación homeotérmica.</li>
	<li>Realizar anestesia intramuscular con una mezcla de tiletamina/zolazepam (30 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg). NOTA: Se recomienda el uso de tiletamine/zolazepam en lugar de ketamina debido a su efecto adverso de hiperglucemia. Se debe seleccionar la anestesia óptima para el propósito de los experimentos9,27.</li>
	<li>Inserte un catéter vascular para la inyección.<ol>
<li>Aplique presión en el lado proximal de la cola con el dedo índice y el tercer como alternativa a una aplicación de torniquete. Calienta la cola con una lámpara si es necesario.</li>
		<li>Esteriliza la vena de la cola con un spray de etanol al 70%.</li>
		<li>Inserte un catéter de 30 G en la vena lateral de la cola. La regurgitación de la sangre se visualizará en el tubo PE10.</li>
		<li>Aplique una cinta de seda en el catéter para estabilizarlo.</li>
		<li>Inyectar dextrano FITC/TMR u otras sondas fluorescentes (25 μg de anti-CD31 conjugado con Alexa 647), según corresponda, según la combinación de sondas fluorescentes18. NOTA: Para sondas fluorescentes de anticuerpos conjugados, inyecte 2 h antes de la sesión de imágenes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfiera el ratón de la plataforma quirúrgica a la etapa de imagen.</li>
	<li>Inserte una sonda rectal para controlar automáticamente la temperatura corporal con el sistema de almohadilla térmica homeotérmica.</li>
	<li>Inserte la ventana de imágenes pancreáticas en el soporte de la ventana preparado durante la configuración de la microscopía intravital (Figura 2). Para un microscopio invertido, es posible que no se requiera un soporte para ventanas.</li>
	<li>Realizar imágenes intravitales.<ol>
<li>Para obtener imágenes del páncreas, comience con una lente de objetivo de bajo aumento (por ejemplo, 4x) para escanear toda la vista del páncreas en la ventana de imágenes pancreáticas (campo de visión recomendado: 2500 x 2500 μm).</li>
		<li>Después de determinar la región de interés, cambie a la lente de objetivo de mayor aumento (20x o 40x) para realizar la imagen a nivel celular (campo de visión recomendado: 500 x 500 μm o 250 x 250 μm). En este experimento, la resolución lateral y axial fue de aproximadamente 0,5 μm y 3 μm, respectivamente.</li>
		<li>Realice imágenes de pila z o de lapso de tiempo para observar la estructura 3D o la dinámica a nivel celular, como la migración celular. NOTA: Para obtener imágenes de las células que expresan proteínas fluorescentes de animales transgénicos (MIP-GFP), 30 s de exposición intermitente al láser de 488 nm con una potencia de hasta 0,43 mW fue tolerable sin fotobleaching notable o daño tisular. Para obtener imágenes de las proteínas fluorescentes etiquetadas con Alexa 647, la potencia del láser de 640 nm de hasta 0,17 mW fue tolerable sin fotobleaching notable o daño tisular. La exposición prolongada al láser de excitación con una potencia superior a esta configuración puede provocar fotoblanqueo o daño tisular por fototoxicidad. Ajuste la ganancia y el poder adecuados para obtener una imagen adecuada de la región de interés. El ajuste detallado de los parámetros en la microscopía intravital debe individualizarse para cada microscopía intravital preparada en el instituto.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+crypt+homeostasis+revealed+at+single-stem-cell+level+by+in+vivo+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging.</a> Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).</li>
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<li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+disturb+pulmonary+microcirculation+in+sepsis-induced+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury.</a> The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786(2019).</li>
<li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+a+pulmonary+endothelial+surface+layer+in+a+murine+sepsis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model.</a> Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).</li>
<li>Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+quantitation+of+injected+circulating+tumor+cells+from+great+saphenous+vein+based+on+video-rate+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito aquí consiste en imágenes intravitales del páncreas utilizando una nueva base de soporte integrada en la ventana de imágenes intravitales pancreáticas modificada desde una ventana de imágenes abdominales. Entre los protocolos descritos anteriormente, el primer paso crítico es la implantación de la ventana de imágenes pancreáticas intravitales en el ratón. Para la aplicación del pegamento en la ventana, es importante aplicar el pegamento entre el margen de la ventana y el vidrio de la cubierta, pero ...

El páncreas es un órgano abdominal con una función exocrina en el tracto digestivo y una función endocrina de secretar hormonas en el torrente sanguíneo. Las imágenes celulares de alta resolución del páncreas podrían revelar la fisiopatología de diversas enfermedades que involucran el páncreas, incluida la pancreatitis, el cáncer de páncreas y la diabetes mellitus1. Las herramientas de diagnóstico por imágenes convencionales, como la tomografía computarizada, las imágenes de resolución magnética y la ecografía, están ampliamente disponibles en el campo clínico1,2. Sin embargo, estas modalidades de imagen se limitan a visualizar solo cambios estructurales o anatómicos, mientras que las alteraciones a nivel celular o molecular no se pueden determinar. Dado que los cambios moleculares en la diabetes mellitus o el cáncer de páncreas en humanos pueden iniciarse más de 10 años antes del diagnóstico3,4,la detección de enfermedades pancreáticas a partir de su transición molecular durante el período latente tiene el potencial de proporcionar un diagnóstico temprano y una intervención oportuna. Por lo tanto, las imágenes que superarán las limitaciones de resolución y proporcionarán información valiosa sobre la función ganarán notablemente atención al proporcionar un diagnóstico temprano del cáncer de páncreas o la identificación avanzada de la alteración de los islotes durante la progresión de la diabetes mellitus5.
En particular con los islotes, la imagen nuclear, la imagen de bioluminiscencia y la tomografía de coherencia óptica se han sugerido como técnicas no invasivas de imagen de islotes6. Sin embargo, la resolución de estos métodos es sustancialmente baja, con valores típicos que van desde varias decenas hasta cientos de micrómetros, ofreciendo una capacidad limitada para detectar cambios a nivel celular en los islotes. Por otro lado, se realizaron estudios previos de alta resolución de islotes bajo condiciones ex vivo7,8 (por ejemplo, corte o digestión del páncreas), nofisiológicas 9 (por ejemplo, exteriorización del páncreas) y heterotópicas10,11,12 (por ejemplo, implantación debajo de la cápsula renal, dentro del hígado y en la cámara anterior del ojo), lo que restringe su interpretación e implicaciones clínicas. Si se puede establecer un modelo in vivo,fisiológico y ortotópico de imágenes de alta resolución, será una plataforma crítica para la investigación de los islotes pancreáticos.
Las imágenes intravitales, que revelan la fisiopatología a un nivel de resolución microscópica en un animal vivo, han recibido recientemente gran atención13. De los métodos de imagen in vivo, el desarrollo de una ventana de imagen abdominal14,que implanta una ventana en el abdomen de un ratón, ha permitido el descubrimiento de nuevos hallazgos (es decir, una etapa de pre-micrometástasis de metástasis hepática temprana15 y mecanismo de mantenimiento de células madre en el epitelio intestinal16). Aunque la ventana de imágenes abdominales proporciona resultados valiosos, las aplicaciones de esta ventana para el páncreas y la investigación de imágenes intravitales resultante basada en enfermedades que involucran el páncreas, no se han investigado ampliamente.
A diferencia de las características bien definidas de los órganos sólidos del páncreas humano, el páncreas de un ratón es una estructura similar a un tejido blando distribuida difusamente17. Por lo tanto, se ve afectado incesantemente por movimientos fisiológicos que incluyen peristalsis y respiración. Un estudio previo sobre la aplicación de una ventana de imagen abdominal para el páncreas demostró que la deambulación se produjo debido a artefactos de movimiento inducidos por los movimientos intestinales18. Se observó un desenfoque severo en la imagen promediada resultante, lo que impidió la visualización e identificación de las estructuras a microescala.
Aquí, describimos el uso de una nueva base de soporte integrada en la ventana de imágenes intravitales pancreáticas combinada con microscopía intravital19,20 para investigar los eventos a nivel celular longitudinal en enfermedades que involucran el páncreas. Además de una descripción detallada de la metodología en el estudio anterior18,en este trabajo se abordará la aplicación extendida de la ventana de imágenes pancreáticas para diversas enfermedades que involucran el páncreas. En este protocolo, se utilizó un sistema de microscopía confocal de escaneo láser de velocidad de video personalizado como un sistema de microscopía intravital. Se utilizaron cuatro módulos láser (longitudes de onda a 405, 488, 561 y 640 nm) como fuente de excitación, y se detectaron cuatro canales de señales de emisión mediante tubos fotomultiplicadores (PMT) a través de filtros de paso de banda (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). El escaneo láser consistió en un espejo poligonal giratorio (eje X) y un espejo de escaneo galvanómetro (eje Y) que permitió el escaneo de velocidad de video (30 cuadros por segundo). La información detallada sobre la microscopía intravital ha sido descrita en los estudios previos10,18,19,20,21,22,23.
En nuestro estudio anterior de islotes18,tomamos imágenes exitosas y estables de los islotes en ratones vivos utilizando un modelo de ratón transgénico (MIP-GFP)24 en el que los islotes fueron etiquetados con GFP. El método permitió la visualización de alta resolución de los cambios en los islotes durante un período de 1 semana. También facilitó la obtención de imágenes de los mismos islotes durante un máximo de 3 semanas, lo que sugiere la viabilidad de estudios a largo plazo de los islotes pancreáticos para el seguimiento o monitoreo funcional durante la patogénesis de la diabetes mellitus18. Además, desarrollamos un modelo de cáncer de páncreas ortotópico en el que las células fluorescentes de cáncer de páncreas (PANC-1 NucLight Red)25 se implantaron directamente en el páncreas del ratón. Con la aplicación de la ventana de imágenes intravitales pancreáticas, este modelo podría utilizarse como una plataforma para investigar la fisiopatología celular y molecular en el microambiente tumoral del cáncer de páncreas y para el monitoreo terapéutico de nuevos candidatos a fármacos.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 Ésteres de succinimidilo (ésteres del NHS)</td><td>Invitrogen</td><td>A20006</td><td>Sonda fluorescente para conjugado con anticuerpo</td></tr><tr><td>BALB/C Nude</td><td></td><td>OrientBio BALB/C Nude BALB</td><td>/C Nude Tubo de</td></tr><tr><td>polietileno BD Intramedic</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td>PE10 Catéter para conexión con aguja</td></tr><tr><td>C57BL/6N</td><td>OrientBio</td><td>C57BL/</td><td>6N C57BL/6N</td></tr><tr><td>Cubreobjetos circulares</td><td>Marienfeld</td><td>0111520</td><td>Cubreobjetos para ventana de imagen pancreática</td></tr><tr><td>FITC Dextran 2MDa</td><td>Merck (antes Sigma Aldrich)</td><td>FD200S</td><td>Para la identificación de recipientes</td></tr><tr><td>IMARIS 8.1</td><td>Bitplane</td><td>IMARIS</td><td>Procesamiento de imágenes</td></tr><tr><td>Microscopía intravital</td><td>IVIM tech</td><td>IVM-C</td><td>Microscopía intravital</td></tr><tr><td>IRIS Tijera</td><td>JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD</td><td>S-1107-10</td><td>Este producto puede ser reemplazado con el producto de otra empresa</td></tr><tr><td>Loctite 401</td><td>Henkel</td><td>401</td><td>N-butil cianoacrilato pegamento</td></tr><tr><td>Micro Needle holder</td><td>JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD</td><td>H-1126-10</td><td>Este producto puede ser reemplazado con el producto de otra empresa</td></tr><tr><td>Micro retractor</td><td>JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD</td><td>17004-03</td><td>Este producto puede ser reemplazado por el producto de otra empresa</td></tr><tr><td>Microfórceps</td><td>JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD</td><td>F-1034</td><td>Este producto puede ser reemplazado por el producto de otra empresa</td></tr><tr><td>MIP-GFP</td><td>The Jackson Laboratory</td><td></td><td>006864 B6. Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J</td></tr><tr><td>Nylon 4-0</td><td>AILEE</td><td>NB434</td><td>Sutura No Reabsorbible</td></tr><tr><td>Omnican N 100 30G</td><td>B BRAUN</td><td></td> FT9172220S <td>Para catéter vascular, uso exclusivo Pieza de aguja</td></tr><tr><td>PANC-1 NucLightRed</td><td>Hecho a medida</td><td>Hecho a medida</td><td>Hecho en laboratorio</td></tr><tr><td>Ventana de imagen pancreática</td><td>Geumto</td><td>Engineering Pedido personalizado</td><td>Ventana de imagen pancreática - pedido personalizado</td></tr><tr><td>Physiosuite</td><td>Kent Scientific</td><td>PS-02 Controlador de</td><td>temperatura homeotérmico</td></tr><tr><td>NA/LE Rata purificada Anti-Ratón CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553708</td><td>Anticuerpo para el etiquetado de vasos in vivo</td></tr><tr><td>Pinzas de anillo</td><td>JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD</td><td>F-1090-3</td><td>Este producto puede ser reemplazado por el producto de otra compañía</td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Bayer</td><td>Rompun Agente</td><td>anestésico</td></tr><tr><td>TMR Dextran 65-85kDa</td><td>Merck (Former Sigma Aldrich)</td><td>T1162</td><td>Para la identificación de recipientes</td></tr><tr><td>Soporte para ventanas</td><td>Geumto Engineering</td><td>Pedido personalizado</td><td>Soporte para ventanas - pedido personalizado</td></tr><tr><td>Zoletil</td><td>Virbac</td><td>Zoletil 100</td><td>Agente anestésico</td></tr></tbody></table>

visualización longitudinal estabilizada a nivel celular in vivo del páncreas en un modelo murino con una ventana de imágenes intravitales pancreáticas

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Las imágenes directas de resolución celular in vivo del páncreas en un modelo de animal pequeño vivo han sido técnicamente desafiantes. Un reciente estudio de imagen intravital, con una ventana de imagen abdominal, permitió la visualización de la dinámica celular en los órganos abdominales in vivo. Sin embargo, debido a la arquitectura blanda en forma de lámina del páncreas del ratón que puede ser fácilmente influenciada por el movimiento fisiológico (por ejemplo, peristalsis y respiración), fue difícil realizar imágenes longitudinales estabilizadas in vivo durante varias semanas a nivel celular para identificar, rastrear y cuantificar islotes o células cancerosas en el páncreas del ratón. Aquí, describimos un método para implantar una nueva base de soporte, una ventana de imágenes intravitales pancreáticas integradas, que puede separar espacialmente el páncreas del intestino para obtener imágenes intravitales longitudinales de lapso de tiempo de la microestructura del páncreas. La obtención de imágenes longitudinales in vivo con la ventana de imágenes permite una visualización estable, lo que permite el seguimiento de los islotes durante un período de 3 semanas y la obtención de imágenes tridimensionales de alta resolución de la microestructura, como se evidencia aquí en un modelo de cáncer de páncreas ortotópico. Con nuestro método, otros estudios de imágenes intravitales pueden dilucidar la fisiopatología de diversas enfermedades que involucran el páncreas a nivel celular.

La microscopía intravital combinada con la ventana de imágenes intravitales pancreáticas integradas en la base de soporte permite obtener imágenes longitudinales a nivel celular del páncreas en un ratón. Este protocolo con la ventana de imágenes intravitales pancreáticas proporciona estabilidad tisular a largo plazo que permite la adquisición de imágenes de alta resolución para rastrear islotes individuales durante un máximo de 3 semanas. Como resultado, se pueden lograr imágenes de mosaico para un campo de visión extend...

Las imágenes in vivo de alta resolución del páncreas se facilitaron con la ventana de imágenes intravitales pancreáticas.

Visualización longitudinal estabilizada a nivel celular in vivo del páncreas en un modelo murino con una ventana de imágenes intravitales pancreáticas

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

Este protocolo describe imágenes in vivo estabilizadas y repetitivas a nivel celular del páncreas con una nueva ventana de imágenes intravitales pancreáticas. La principal ventaja de esta técnica es que es posible realizar imágenes tridimensionales inmóviles con resolución hasta el nivel celular durante tres semanas en el páncreas de un ratón vivo. Comience por preparar la plataforma quirúrgica y desinfectar las superficies con etanol al 70%.Después de la anestesia, use una sonda rectal con una almohadilla térmica homeotérmica controlada para controlar la temperatura corporal. Retire el vello del flanco izquierdo del ratón y aplique alcohol y yodo alternativamente, girando desde el sitio de la incisión hasta la superficie externa, nunca volviendo al sitio de la incisión y terminando con yodo. Luego, haga una incisión de 1,5 centímetros en el flanco izquierdo del ratón, diseccionando la piel y el músculo.Use una sutura negra o de nylon 4-0 para realizar una sutura de cuerda de bolso en el margen de la incisión. Tire del bazo con cuidado con las pórceps anulares e identifique el páncreas. Colocando la ventana en el flanco del ratón, pase el bazo y el páncreas a través del espacio abierto de la ventana.Luego, coloque suavemente el páncreas en la placa de la ventana de imágenes mientras coloca el bazo en el espacio abierto de la ventana. Inyecte PANC-1 nuclite rojo directamente en el páncreas. Use una aguja de catéter de calibre 31 para aplicar gotas de pegamento de cianoacrilato de n-butilo en el margen de la ventana de imágenes, asegurando que se aplique una cantidad mínima de pegamento.Aplique suavemente un vidrio de cubierta redonda de 12 milímetros en el margen de la ventana de imágenes. Luego, sostenga el lazo de sutura para que quepa en la ranura lateral de la ventana y átelo tres veces. Finalmente, para evitar la interrupción de estos puntos apretados cuando los ratones están despiertos, corte el sitio proximal máximo de la corbata.Comience encendiendo el microscopio intravital, incluida la potencia del láser. Para insertar un catéter vascular, aplique presión en el lado proximal de la cola con el dedo índice y el tercero. Si es necesario, caliente la cola con una lámpara.Desinfecte la vena de la cola con un aerosol de etanol al 70%, luego inserte un catéter de calibre 30 en la vena lateral de la cola y visualice la regurgitación de sangre en el tubo DE PE-10. Aplique cinta de seda en el catéter para estabilizarlo. Inyecte dextrano FITC y dextrano TMR, u otras sondas fluorescentes según corresponda, de acuerdo con la combinación de sondas fluorescentes.Inserte una sonda rectal para controlar automáticamente la temperatura corporal con un sistema de almohadilla térmica homeotérmica. Luego, inserte la ventana de imágenes pancreáticas preparada durante la configuración de la microscopía intravital en el soporte de la ventana. Transfiera el ratón de la plataforma quirúrgica a la etapa de imagen.Para realizar imágenes intravitales, comience con imágenes del páncreas a un aumento bajo, como cuatro veces, para escanear toda la vista del páncreas en la ventana de imágenes pancreáticas. Una vez que se haya determinado la región de interés, cambie a una lente de objetivo de aumento más alto, como 20 veces o 40 veces, para realizar imágenes a nivel celular con resolución lateral y axial de aproximadamente 0,5 micrómetros y 3 micrómetros respectivamente. Realice imágenes de pila Z o de lapso de tiempo para observar la estructura 3D o la dinámica a nivel celular, como la migración celular.La microscopía intravital combinada con la ventana de imágenes intravitales pancreáticas proporciona estabilidad tisular a largo plazo que permite la adquisición de imágenes de alta resolución para rastrear islotes individuales durante un máximo de tres semanas. La ventana implantada en un ratón C57 negro 6 N con anticuerpo anti-CD31 inyectado por vía intravenosa, conjugado con un fluoróforo Alexa 647, facilitó la obtención de imágenes de área amplia y magnificó las imágenes 3D del páncreas. Las células acinares se identificaron en las imágenes promediadas de tejido pancreático en la vasculatura adyacente, visualizadas utilizando autofluorescencia y anticuerpo anti-CD31 respectivamente.Utilizando el método de imágenes en mosaico, que combina una vista de campo amplio con imágenes de alta resolución, se visualizaron aproximadamente de 40 a 50 islotes con la vasculatura adyacente en un ratón MIP-GFP. Un estudio anterior mostró que los islotes se pueden rastrear durante hasta tres semanas utilizando este método de imagen estable. Para visualizar las células cancerosas, los glóbulos rojos de nuclita PANC-1 se implantaron directamente en el páncreas del ratón durante la cirugía y los vasos cercanos se tiñeron con anti-CD31 conjugado con Alexa 647.Usando este protocolo, se generaron imágenes de campo amplio de cáncer de páncreas. Esto ayudó a delinear el margen del tumor, así como a lograr imágenes 3D de alta resolución a nivel de una sola célula. El paso más crítico en este método es la hábil implantación de la ventana de imágenes pancreáticas en el ratón.Usando otras combinaciones de células de ratón fluorescentes y sondas de anticuerpos, se pudo identificar la interacción dinámica de las células cercanas con los islotes o las células de cancelación. Este método puede ser ampliamente aplicado por aquellos que exploran el cambio del islote en diversas condiciones fisiopatológicas y microambientes del cáncer de páncreas in situ.

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Investigación

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Medicine

Medicina

Aquí se describe un método para el aislamiento, cultivo y manipulación de páncreas de ratón embrionario. Esto representa un...

Un sistema para la<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultivo de páncreas embrionario

Este video muestra el procedimiento para implantar una ventana de imagen pancreática para separar el páncreas de los intestinos para obtener imágenes longitudinales de alta resolución de la microestructura del páncreas.

Instalación de una ventana de imagen pancreática intravital en un modelo de ratón: una ventana de imagen pancreática integrada para la obtención de imágenes in vivo de lapso de tiempo de la microestructura del páncreas murino

En este video, describimos la imagen intravital de un páncreas de ratón a través de una ventana estabilizada para la visualización a largo plazo de la dinámica celular.

Imágenes intravitales: un método para la observación a nivel celular del páncreas de ratón a través de una ventana de imagen estabilizada

El objetivo de este protocolo es monitorear continuamente la dinámica del proceso de injerto de islotes pancreáticos humanos y el huésped contribuyente frente a las células del donante. Esto se logra trasplantando islotes humanos en la cámara anterior del ojo (ACE) de un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receptor del ratón seguido de imágenes repetidas de 2 fotones.

Longitudinal en Imágenes Vivos y Cuantificación del Injerto de Islotes Pancreáticos Humanos y Células Huésped Contribuyentes en la Cámara Ocular Anterior

Aquí se presenta un enfoque para imágenes intravitales a largo plazo utilizando ventanas de silicona ópticamente transparentes que se pueden pegar directamente al tejido / órgano de interés y la piel. Estas ventanas son más baratas y versátiles que otras utilizadas actualmente en el campo, y la inserción quirúrgica causa inflamación y angustia limitadas a los animales.

Imágenes intravitales longitudinales a través de ventanas de silicona transparente

Presentamos un protocolo para la implantación quirúrgica de una ventana óptica permanente estabilizada para la obtención de imágenes de resolución subcelular del páncreas murino, que permite realizar estudios seriados y longitudinales del páncreas sano y enfermo.

Ventana estabilizada para la obtención de imágenes intravitales del páncreas murino

Mediante la combinación de un pulido y reforzado delgada cráneo (puertos) craneal ventana y glioblastoma (GBM) la inyección de células, se puede observar la iniciación glioma y el crecimiento de las células de GBM inyectados en el cerebro de un ratón vivo longitudinalmente.

Imágenes Glioma Iniciación<em&gt; En Vivo</em&gt; A través de un pulido y reforzado fina calavera ventana craneal

Se describe un modelo de implantación de un stent en la arteria carótida del ratón. En comparación con otros métodos similares, este procedimiento es muy rápido, simple y accesible, que ofrece la posibilidad de estudiar de una manera conveniente la reacción de la pared vascular a diferentes stents liberadores de fármacos y los mecanismos moleculares de la restenosis.

Un modelo murino de la implantación de un stent en la arteria carótida para el Estudio de la reestenosis

Aquí, describimos un enfoque de microscopía óptica semi-invasiva para la inducción de un coágulo fototrombótico de Bengala Rosa en la corteza somatosensorial de un ratón in vivo.  Se describen los aspectos técnicos del procedimiento de imagen, desde la inducción de un evento fototrombótico hasta la aplicación y la recopilación de datos.

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Este manuscrito describe un procedimiento para realizar un seguimiento de la remodelación de la vasculatura cerebral durante la acumulación de placa amiloide in vivo usando longitudinal microscopía de dos fotones. Una preparación-cráneo adelgazada permite la visualización de los tintes fluorescentes para evaluar la progresión del daño cerebrovascular en un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer.

Longitudinal<em&gt; En Vivo</em&gt; Obtención de imágenes de la vasculatura cerebral: Importancia de las enfermedades del sistema nervioso central

Aprende a realizar imágenes intravitales longitudinalmente estabilizadas del páncreas a nivel celular en ratones. Este método permite visualizar islotes y células cancerosas durante tres semanas con resolución tridimensional.

Visualización longitudinal estabilizada a nivel celular in vivo del páncreas en un modelo murino con una ventana de imágenes intravitales pancreáticas (Video) | JoVE Journal

Visualización longitudinal estabilizada a nivel celular in vivo del páncreas en un modelo murino con una ventana de imágenes intravitales pancreáticas

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