Un protocolo simple de alta eficiencia para el aislamiento de islotes pancreáticos de ratones
30 de agosto de 2019
Este protocolo de aislamiento de islotes describió una novedosa vía de inyección de colagenasa para digerir el tejido exocrina y un procedimiento de gradiente simplificado para purificar los islotes de ratones. Implica digestión enzimática, separación/purificación de gradientes y selección manual de islos. El aislamiento exitoso puede producir entre 250 y 350 islotes de alta calidad y completamente funcionales por ratón.
Este protocolo requiere el uso de un gradiente de densidad única, lo que lo hace significativamente menos intensivo en mano de obra y más rentable en comparación con los métodos de aislamiento de islotes convencionales más complejos. La principal ventaja de este protocolo es que la enzima se entrega directamente al páncreas, lo que resulta en una mayor digestión tisular y un mayor rendimiento de los islotes. Comience pegando las extremidades del ratón en la posición supina y rociando el cuerpo con 70%etanol.
Usando fórceps de tapa y tijeras quirúrgicas curvas, haz una incisión horizontal de la piel de la piel de aproximadamente tres centímetros y abre la piel para exponer la pared abdominal. Haga una incisión vertical de tres a cuatro centímetros en el peritoneo abdominal para exponer completamente el páncreas y colocar el ratón debajo de un microscopio diseccionado. Empuje el lóbulo hepático superiormente para exponer el conducto biliar que aparece como un tubo de color rosa pálido y mueva suavemente los intestinos de la región lumbar derecha e ilíaca a la derecha de la cavidad abdominal para exponer el conducto biliar y la arteria hepática.
Utilice micro serrefinas Schwartz para sujetar cuidadosamente el conducto biliar común lo más cerca posible del hígado e identificar la ampolla de Vater que se encuentra en la papila duodenal y formada por la unión del conducto pancreático y el conducto biliar común. Usando micro fórceps Adson para tirar del conducto biliar común enseñado, inserte una aguja de media pulgada de calibre 30 unida a una jeringa de tres mililitros que contenga tres mililitros de solución de colágeno P recién preparada en la ampolla de Vater empujando la aguja en el conducto paralelo al recipiente durante aproximadamente un cuarto de la longitud del recipiente. Una vez que la aguja esté en su lugar, estabilice la aguja con micro fórceps Adson e inyecte lentamente y constantemente tres mililitros de solución de colagenasa P en el conducto.
La inyección se considera exitosa si las regiones de la cabeza, el cuello, el cuerpo y la cola del páncreas están completamente infladas. La entrada adecuada en la ampolla y la cánulación del conducto biliar común son fundamentales para una cosecha de digestión exitosa. Perforar las paredes ductales reduce la eficacia del aislamiento.
Usando fórceps curvos y micro Adson, extraiga cuidadosamente el páncreas inflado comenzando en el bazo y continuando hacia el estómago y a lo largo del duodeno. A continuación, coloque el páncreas en un tubo de digestión de 50 mililitros que contenga tres mililitros de solución de colagenasa P helada. Para cosechar los islotes, primero use tijeras quirúrgicas finas para cortar el páncreas durante tres a cinco segundos antes de colocar el tubo en un baño de agua de 37 grados Celsius a 100 a 120 rotaciones por minuto durante 12 a 13 minutos.
Al final de la incubación, agita suavemente el tubo durante unos 30 segundos para interrumpir el tejido hasta que la solución sea homogénea como lo confirman las partículas de tejido pancreático similares a la arena fina. Tan pronto como se digiere el tejido, coloque el tubo sobre hielo y agregue 40 mililitros de solución de parada helada para terminar la reacción enzimática. Después de interrumpir suavemente el pellet, gire hacia abajo el tejido digerido en una centrífuga de cubo oscilante seguida de dos centrifugaciones con 20 mililitros de solución de parada fresca por lavado.
Después del último lavado, resuspender el pellet en 40 mililitros de HBSS helado para tres lavados adicionales, resuspendiendo el pellet en cinco mililitros de solución de gradiente de densidad de temperatura ambiente después del último lavado. Vórtice el tubo brevemente a baja velocidad hasta que la solución se homogeneice antes de añadir otros cinco mililitros de gradiente de densidad de temperatura ambiente al tubo. Ahora utilice una pipeta de 10 mililitros para agregar suavemente y lentamente 10 mililitros de HBSS de temperatura ambiente al tubo de una manera gota para permitir la formación de un gradiente y utilizar una centrífuga de cubo oscilante para aislar las poblaciones celulares por separación de gradiente de densidad.
Al final de la centrifugación, utilice una pipeta de 10 mililitros pre-húmeda con HBSS frío para recoger de cinco a 10 mililitros de la capa de islote entre el gradiente de densidad y el HBSS. Transfiera los islotes a un nuevo tubo de 50 mililitros que contenga 20 mililitros de HBSS frío fresco y recoja las células por centrifugación en una centrífuga de cubo oscilante. Aspirar cuidadosamente todos menos los últimos tres mililitros del sobrenadante sin alterar el pellet y lavar los islotes al menos tres veces más con 20 mililitros de HBSS fresco por lavado.
Después del último lavado, reemplace el sobrenadante con cuatro mililitros de 37 grados Celsius RMPI 1640 medio y gire suavemente el tubo para desalojar el pellet. Inmediatamente verter los islotes en un plato Petri de 100 milímetros y lavar el tubo con cinco mililitros de nuevo RPMI 1640 medio para recoger los islotes restantes que se acumulen el lavado con los otros islotes. A continuación, utilice un microscopio de disección y una punta de pipeta de 20 microlitros para recoger islotes esféricos sanos u oblongos dorados con una superficie lisa de la placa Petri para transferirlos a un nuevo plato Petri que contenga 10 mililitros de RPMI 1640 medio completo.
Cuando se hayan recogido todos los islotes, coloque los islotes en una incubadora estéril a 37 grados centígrados y un 5% de dióxido de carbono en el aire humidificado durante la noche. Los buenos islotes sanos parecen tener una forma redonda lisa, mientras que los islotes dañados mal exhiben bordes ásperos. El tejido exocrino no digerido es de aspecto translúcido y demuestra una forma irregular.
Una cannulación y distribución adecuadas de la enzima colagenasa P puede ser confirmada por una inflación de la porción esplénica del páncreas. La incubación nocturna en medios bajos de glucosa puede preparar los islotes para un ensayo de secreción de insulina estimulado por glucosa al día siguiente, lo que permite conocer la capacidad secretora de insulina de los islotes.
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Resumen
Este artículo presenta un nuevo protocolo de aislamiento de islotes que utiliza la inyección de colagenasa para mejorar la digestión del tejido y el rendimiento de islotes. El método simplifica el proceso de separación en gradiente, permitiendo el aislamiento exitoso de 250–350 islotes de alta calidad por ratón.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Técnicas de aislamiento de islotes
Antecedentes
- El aislamiento de islotes es crucial para la investigación sobre la diabetes.
- Los métodos convencionales pueden ser intensivos en mano de obra y costosos.
- Las técnicas mejoradas pueden aumentar el rendimiento y la funcionalidad de los islotes.
- La inyección de colagenasa tiene como blanco directo el páncreas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo de aislamiento de islotes menos intensivo en mano de obra.
- Aumentar el rendimiento de islotes funcionales a partir del páncreas de ratón.
- Simplificar el procedimiento manteniendo la calidad de los islotes.
Métodos Utilizados
- Gradiente de densidad simple para la purificación de islotes.
- Digestión enzimática del tejido exocrino.
- Selección manual de islotes aislados.
- Uso de técnicas quirúrgicas para exponer el páncreas.
Resultados principales
- Una digestión tisular mejorada conduce a un mayor rendimiento de islotes.
- El protocolo proporciona entre 250 y 350 islotes de alta calidad por ratón.
- Requiere menos trabajo en comparación con los métodos convencionales.
- Un enfoque rentable para el aislamiento de islotes.
Conclusiones
- El nuevo protocolo mejora significativamente la eficiencia del aislamiento de islotes.
- La administración directa de enzimas mejora el rendimiento y la calidad generales.
- Este método puede facilitar investigaciones adicionales en diabetes.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento de islotes pancreáticos es un cuello de botella crítico en la investigación de la diabetes, donde el bajo rendimiento y los protocolos intensivos en mano de obra limitan el número de experimentos para la validación de dianas y estudios mecanicistas. Este protocolo mejora la confianza predictiva al administrar colagenasa P directamente a la ampolla de Vater, lo que permite una digestión enzimática y mecánica más completa del tejido exocrino. El aumento resultante en el rendimiento y la calidad de los islotes posibilita ensayos fiables de secreción de insulina *ex vivo*, aportando información directa para la identificación de fármacos prometedores y la selección de modelos preclínicos en el desarrollo de terapias para la diabetes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de la función de las células β y de las vías de secreción de insulina mediante la recuperación de islotes de alto rendimiento.
- Valor operativo: Reduce las barreras técnicas para el acceso a islotes, favoreciendo una validación consistente de objetivos en múltiples cepas de ratones o modelos de enfermedad.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Produce islotes adecuados para ensayos de secreción de insulina estimulada por glucosa, proporcionando lecturas cuantitativas para la selección de compuestos.
- Valor operativo: Simplifica la purificación mediante un único gradiente de densidad, mejorando la estandarización y la reproducibilidad del ensayo en campañas de cribado.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Valor científico: Apoya sistemas relevantes para enfermedades al proporcionar islotes primarios que mantienen la función endocrina para pruebas preclínicas de eficacia.
- Valor operativo: Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta el trabajo preclínico al entregar islotes listos para validación funcional en modelos diabéticos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento al proporcionar islotes primarios validados para aplicaciones posteriores en la identificación de compuestos activos y la validación preclínica, particularmente para programas enfocados en la diabetes.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre los mecanismos de secreción de insulina mediante el acceso a poblaciones funcionales de islotes.
- Selección: Proporciona preparaciones estandarizadas de islotes que permiten una evaluación fiable de compuestos en ensayos de secreción.
- Análisis: Genera mediciones cuantitativas de variables dependientes (por ejemplo, liberación de insulina) que ayudan a comparar condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al proporcionar islotes relevantes para la enfermedad, útiles para la validación en modelos diabéticos.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad de aislamiento reutilizable que reduce la dependencia de proveedores externos y aumenta el rendimiento interno de los ensayos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mayor confianza predictiva en la validación de objetivos mediante la reducción de la ambigüedad mecanicista en la función de los islotes.
- Valor operativo: Normalización y escalabilidad mediante una purificación simplificada con gradiente único y administración directa de enzimas.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción en programas contra la diabetes al mejorar las tasas de éxito de los ensayos basados en islotes.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en datos confiables de secreción de insulina procedentes de preparaciones de islotes de alto rendimiento.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de microcirugía para la canulación del conducto pancreático y el manejo de tejidos.
- Depende del acceso a microscopios de disección, centrífugas y baños de agua con control de temperatura para la digestión enzimática.
- Necesita la estandarización de la concentración de colagenasa P y del tiempo de incubación entre diferentes operadores para garantizar una calidad constante de los islotes.
- Requiere adaptar los volúmenes del gradiente y los protocolos de lavado al escalar el procedimiento a diferentes cepas o edades de ratones.
- Las limitaciones prácticas incluyen el posible daño a los islotes por sobredigestión, lo cual puede mitigarse mediante la optimización del tiempo de exposición a enzimas, tal como se describe en el protocolo.
