Una mejor visualización y análisis cuantitativo de los efectos de drogas Uso de células micropatterned

El objetivo general del siguiente procedimiento es mostrar cómo la normalización de la arquitectura celular y la posición, lograda mediante patrones microscópicos adhesivos específicos, permite una automatización sencilla de la adquisición de imágenes y un procesamiento directo de las mismas, con una cuantificación sensible y robusta de los efectos de fármacos, lo cual es inalcanzable en portaobjetos convencionales de vidrio. Esto se consigue sembrando células heli en chips SI dos que presentan patrones microscópicos en forma de L marcados con SI tres. Las células adoptan una forma triangular, formando una fibra de estrés principal que se extiende entre los dos extremos de la L. A continuación, las células en patrón se incuban con lebos statina o se dejan sin tratar, y luego se fijan y tiñen para visualizar el citoesqueleto de actina y los núcleos.

Posteriormente, se adquieren y procesan imágenes de las células con micropatrones utilizando la macro de referencia celular para generar una pila de imágenes para análisis y la macro de hipotenusa para cuantificar los fenotipos. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran un efecto significativo de dosis bajas de estatinas BLE en células HELOC con micropatrones, el cual es indetectable en condiciones estándar de cultivo celular. Hola, bienvenido.

Estamos aquí hoy para guiarlo a través de nuestro protocolo experimental que explica cómo utilizar patrones microscópicos adhesivos para el análisis celular, así como para mostrarle datos experimentales que ilustran la fácil cuantificación de dosis muy bajas de fármacos sobre estos patrones microscópicos adhesivos. Al observar por primera vez estos patrones microscópicos, comprenderá inmediatamente cómo pueden resolver problemas de variabilidad en la captura de imágenes durante el análisis celular. Debido a que, al tener una disposición ordenada de células, muy similar a una matriz microscópica, puede mover fácilmente la platina del microscopio de una célula a otra para capturar imágenes de manera secuencial.

Pero esa por supuesto no es la única ventaja que ofrecen los micropatrones. Ofrece muchas más mejoras porque, de hecho, en ciertos micropatrones típicos como el cruzado o la Y, estamos normalizando en realidad la arquitectura interna de la célula, lo que significa que los orgánulos, el huso mitótico, el citoesqueleto y las diferentes redes de proteínas se encuentran todos en las mismas ubicaciones de célula a célula o en la misma orientación de célula a célula, lo cual facilita mucho predecir y cuantificar los efectos de los fármacos sobre estos patrones particulares. Ahora bien, esto puede parecer bastante contraintuitivo en comparación con lo que normalmente se hace en la placa de Petri clásica o en la microplaca.

Bueno, porque a menudo se observa, por supuesto, que las células se mueven y adoptan diferentes morfologías. En cambio, sobre los micropatrones adhesivos, todas las células comenzarán a parecerse porque responden a este micropatrón adhesivo y organizan su arquitectura de la misma manera. Esto podría parecer, de hecho, un poco artificial, pero cuando se analiza detenidamente, ¿no es aún más artificial la placa de Petri?

Dado que en los tejidos, las células están restringidas por las células vecinas así como por la matriz extracelular. Por lo tanto, reciben mucha información espacial, que orienta la arquitectura celular. Y esta base in situ para el uso de microestructuras es lo que estamos haciendo.

Estamos restaurando esta información espacial a las células y todas las células están respondiendo a esto y organizándose de la misma manera. Y ahora, dado que todas las células se parecen, podemos introducir el concepto de célula de referencia, lo que significa que podemos promediar todas las imágenes y obtener una única imagen, que representa fielmente cómo se ve una célula en una condición determinada. Luego, se puede añadir un fármaco y observar nuevamente la célula de referencia para ver cómo se ha modificado la morfología u organización celular en respuesta a ese fármaco.

Coloque dos chips situ two individualmente en dos pocillos independientes de una placa de seis pocillos, asegurándose de que el logotipo situ two sea legible. Los chips situ two utilizados en este experimento tienen micropatrones teñidos con FibroGen SI three y deben mantenerse en la oscuridad antes de su uso. Recolecte células hela que presenten aproximadamente un 80 % de confluencia mediante tripsina y verifique que estén adecuadamente individualizadas bajo el microscopio; centrifugue a 300 ×g durante cuatro minutos y resuspenda suavemente las células. Cuente y diluya las células hasta una concentración de 15 000 células por mililitro.

En medio de cultivo D-M-E-M-F 12 incompleto, distribuya 60.000 células por pocillo. La placa debe moverse lo menos posible para evitar introducir movimientos de rotación en el medio, lo que tenderá a concentrar las células en el centro. Deje que las células sedimenten durante 10 minutos bajo la campana, luego trasládelas al incubador de células.

Entre 10 y 20 minutos en el incubador celular, las células comenzarán a adherirse después de 10 minutos; verifique regularmente bajo el microscopio cuándo las células se han fijado. Cambie el medio celular y elimine el exceso de células repitiendo el siguiente procedimiento cuatro veces. Manteniendo la placa plana, aspire suavemente el medio desde el borde del pocillo.

Tenga cuidado de mantener suficiente medio para evitar que el chip se seque. Añada cuatro mililitros de PBS y aspire comenzando desde el centro del chip. Luego, muévase hacia el lado del pocillo para aspirar la mayor parte del PBS como antes, y revise bajo el microscopio la presencia de células flotantes.

Si queda una gran cantidad de células en suspensión, repita el procedimiento de lavado. Si hay muy pocas células, aspire parte del PBS y reemplácelo con dos mililitros de medio fresco, aspire nuevamente y agregue cuatro mililitros de medio fresco dos veces. Incube las células durante tres horas en un incubador celular para permitir que las células se extiendan completamente.

Utilizando este método, entre el 10 y el 30 % de los micropatrones estarán ocupados por una sola célula, mientras que otros patrones estarán vacíos o ocupados por múltiples células. Para tratar las células con la dilución de estatina BLE, diluya la solución stock del fármaco de 17 milimolar a una concentración final de cinco micromolar con 0,1 % de DMSO en cuatro mililitros de medio. Para el control, prepare medio con solo 0,1 % de DMSO, aspire el medio celular y sustitúyalo rápidamente por la solución de estatina BLE o por la solución de control para evitar que el chip se seque.

Incube las células durante una hora a 37 grados Celsius. Durante esta incubación, prepare el tampón de citoesqueleto. Añada un gramo de sacarosa a dos mililitros de cb.

Esto ayuda a preservar las estructuras celulares internas. Mezcle un mililitro de sacarosa en CB con cuatro mililitros de PFA al 5%. Añada dos mililitros de PFA en la solución de sacarosa en CB.

En dos pocillos de una placa fresca de seis pocillos. Para fijar las células, use pinzas para tomar el chip CY2 y colóquelo en la placa de seis pocillos que contiene dos mililitros de PFA en solución de sacarosa CB. Incube las células durante 10 minutos a temperatura ambiente, retire el PFA y lave las células una vez con PBS, luego lávelas con dos mililitros de cloruro de amonio 100 milimolar durante 10 minutos.

Para detener la actividad residual de entrecruzamiento de PFA, permeabilice las células añadiendo dos mililitros de PBS que contenga 0,1 % de Triton X-100 durante tres minutos, lave dos veces con PBS y tiña los filamentos de actina con dos mililitros de fain conjugado con ZI en una dilución de uno a 2000 en PBS con 1,5 % de BSA; incube durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, lave las células una vez con dos mililitros de PBS. Después, tiña los núcleos.

Añada dos mililitros de un miligramo por mililitro de hawked en PBS e incube durante tres minutos a temperatura ambiente. Lave dos veces con dos mililitros de PBS. Monte los dos chips laterales en una portaobjetos estándar utilizando entre 25 y 30 microlitros de soluciones de montaje como al.

Para adquirir imágenes en tres longitudes de onda, utilizamos el software de imagen Metamorph y un microscopio NIK icon eclipse T. Equipado con la cámara CCD Hema Matsu y un iluminador de fibra de mercurio Intens Lite. Primero seleccione una magnificación de 20x.

A continuación, en la barra de menú, abra la adquisición multidimensional para configurar los diferentes parámetros del experimento. Primero indique dónde guardar sus datos.

Establezca el número de longitudes de onda en tres, seleccione las tres longitudes de onda de SI y coloque la preparación con cubreobjetos de manera que 12 microestructuras queden centradas en el campo de la cámara. El número de microestructuras visualizadas por campo variará según las configuraciones de la cámara y los objetivos. Ajuste el tiempo de exposición para cada longitud de onda y el enfoque automático.

Para PS tres, cree un diario que ejecute una adquisición multidimensional y guárdelo como MDA jnl. Abra la función de escaneo de la platina para adquirir 24 imágenes, cada una conteniendo 12 micro patrones. Ingrese seis columnas y cuatro filas con un tamaño de paso x de menos 400 micrones y un tamaño de paso y de 300 micrones en el conjunto de diario para ejecutar, cargue el diario MDA jnl y presione escanear para iniciar la adquisición automatizada de las 24 imágenes en las tres longitudes de onda.

En este video, se utilizan patrones microscópicos en forma de L para inducir la formación de una única fibra de estrés de actina importante que sostiene la parte no adherida de la célula y simplifica la visualización y medición del impacto de las estatinas en las células, en comparación con células ubicadas sobre fibronectina lisa. Para el procesamiento y análisis automatizado de imágenes, describimos dos macros personalizadas escritas para el programa de código abierto ImageJ; a partir de un conjunto de imágenes en bruto, el primer macro extrae células individuales y crea una célula de referencia. El segundo macro mide el colapso de la membrana celular.

El primer paso es la segmentación de células individuales a partir de imágenes en bruto. Se utilizan imágenes de micro patrones marcados con fluorescencia para delimitar regiones centradas en los micro patrones, que se recortan en las imágenes para cada longitud de onda y se vuelven a ensamblar en pilas para cada longitud de onda. Para seleccionar micro patrones con una sola célula, el macro detecta el número de núcleos por imagen y elimina en todas las pilas aquellas que contienen más de un núcleo o ningún núcleo.

Finalmente, se utiliza el complemento multi-stack reg de Image J para volver a alinear todas las imágenes recopiladas y todos los canales según la posición del micropatrón. Este paso genera pilas de líneas de imágenes individuales que ahora pueden usarse para el análisis de células individuales o para crear una célula de referencia. En Image J, la célula de referencia se construye realizando una proyección de las imágenes filtradas y alineadas a partir de una pila.

Se pueden aplicar varios métodos de proyección, pero normalmente se elige una proyección mediana para eliminar los valores atípicos del conjunto de imágenes. La célula de referencia es una herramienta única y útil para la representación y el análisis de imágenes, que solo se obtiene con células de micropatrón. Para facilitar su examen, se aplica una tabla de búsqueda o LUT para convertir la imagen monocromática en un mapa de frecuencias codificado.

Para caracterizar el efecto de la estatina en las BLE, se analizó la rigidez y el colapso de la célula utilizando una macro de segunda imagen en J. Breve descripción: se utilizan imágenes umbral del patrón micro L para definir una hipotenusa teórica de la forma triangular de la célula. A continuación, se realiza el umbralizado de las imágenes de tinción de actina para definir la forma celular.

La diferencia en área entre la hipotenusa teórica y la membrana celular cóncava real se mide entonces; las células que presentan un área debajo de la hipotenusa teórica se consideran colapsadas. El impacto del estatina BLEs de cinco micromolar se caracterizó comparando el número de células colapsadas en condiciones tratadas y control. Se muestran imágenes típicas de células con micropatrones L tratadas con estatina BLEs o dejadas sin tratar; las células se fijaron y tiñeron micropatrones.

La actina y los núcleos se muestran en rojo, verde y azul respectivamente. Observe el impacto del estatina BLEs en la forma celular en comparación con las condiciones de control. Aquí se muestran células representativas tras la incubación con estatina BLEs o controles sobre fibronectina pura.

Las células fueron fijadas y teñidas, el actinio y los núcleos aparecen en verde y azul, respectivamente. Obsérvese la similitud entre las condiciones tratadas y controladas. Se muestran imágenes típicas de células de referencia obtenidas de células tratadas con estatinas BLE o dejadas sin tratar.

Tenga en cuenta el potencial de este enfoque para la observación sencilla del fenotipo en estudio. A continuación se muestra un ejemplo de análisis de los efectos de los BLEs estatina en células utilizando la macro hipotenusa. Mientras que el 25 % de las células control estaban colapsadas, este valor aumentó tres veces, hasta el 75 %, en las células tratadas con BLEs estatina a cinco micromolar, lo que refleja la red contráctil de actinina debilitada.

Después de ver esto, ahora debería tener una buena comprensión de cómo los patrones microadhesivos resuelven varios cuellos de botella en el análisis de alto contenido. Primero, el uso de patrones microadhesivos hace que la captura de imágenes, el procesamiento y el análisis sean mucho más sencillos. Segundo, los patrones microadhesivos permiten detectar efectos muy sutiles de fármacos a dosis muy bajas porque se reduce la variabilidad entre células al normalizar su morfología y su comportamiento.

Y finalmente, en comparación con los miles de células que generalmente son necesarias para obtener un buen resultado en el análisis celular, solo se necesitan unas decenas de células para obtener un resultado robusto y significativo utilizando nuestra célula de referencia.