Una mejor visualización y análisis cuantitativo de los efectos de drogas Uso de células micropatterned

El objetivo general del siguiente procedimiento es mostrar cómo la normalización de la arquitectura y la posición de las células lograda en micropatrones adhesivos específicos permite una fácil automatización de la adquisición de imágenes y un procesamiento sencillo de imágenes con una cuantificación sensible y robusta de los efectos de los medicamentos, lo que es inalcanzable en los soportes convencionales de cubreobjetos de vidrio. Esto se logra mediante la siembra de células heli en SI, dos chips que llevan tres micropatrones marcados con SI en forma de L. Las células adoptan la forma triangular formando una fibra de estrés importante que abarca los dos extremos de la L. Las células patrón se incuban a continuación con estatinas de Lebos o se dejan sin tratar, luego se fijan y se tiñen para visualizar el citoesqueleto y los núcleos de actón.

A continuación, se adquieren y procesan imágenes de las células de micropatrón utilizando la macro de referencia de celda para generar una pila de imágenes para el análisis y la macro de hipotenusa para cuantificar los fenotipos. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran un efecto significativo de las dosis bajas de estatinas BLEs en las células HELOC de micropatrón, que es indetectable en condiciones de cultivo celular estándar. Hola, bienvenido.

Hoy estamos aquí para guiarle a través de nuestro protocolo experimental, explicando cómo utilizar micropatrones adhesivos para el análisis de células, así como mostrándole datos experimentales que ilustran la fácil cuantificación de dosis muy bajas de fármacos en estos micropatrones adhesivos. Por lo tanto, al ver por primera vez estos micropatrones, comprenderá de inmediato cómo puede resolver los problemas de variabilidad en la captura de imágenes durante el análisis de celdas. Porque al tener una matriz real de células, al igual que una micromatriz, puede mover fácilmente la platina del microscopio de una célula a otra para poder capturar imágenes de manera escalonada.

Pero esa, por supuesto, no es la única ventaja de los micro patrones que ofrece. Ofrece muchas más mejoras porque, de hecho, en ciertos micro patrones típicos, como el crossbo o el Y, estamos normalizando la arquitectura interna de la célula, lo que significa que los orgánulos, el huso mitótico, el citoesqueleto y las diferentes redes de proteínas están todos en las mismas ubicaciones de célula a célula o en la misma orientación de célula a célula. lo que hace que sea mucho más fácil predecir y cuantificar los efectos de los medicamentos en estos patrones particulares. Ahora bien, esto puede parecer bastante contradictorio de lo que normalmente se hace en la clásica placa de Petri o microplaca.

Bueno, porque a menudo se ven, por supuesto, células que se mueven y adoptan diferentes morfologías. Mientras que en los micropatrones adhesivos, todas las células comenzarán a parecerse porque responden a este micropatrón adhesivo y organizan su arquitectura de la misma manera. De hecho, esto puede parecer un poco artificial, pero cuando lo miras de cerca, ¿no es la placa de Petri aún más artificial?

Porque en los tejidos, las células están constreñidas por las células vecinas, así como por la matriz extracelular. Están recibiendo una gran cantidad de información espacial, que está orientando la arquitectura de la célula. Y esto en el sitio para el anuncio de micro patrones es lo que estamos haciendo.

Estamos restaurando esta información espacial a las células y todas las células están respondiendo a esto y se están organizando de la misma manera. Y ahora, debido a que todas las celdas se parecen, podemos introducir el concepto de celda de referencia, lo que significa que podemos promediar todas las imágenes y obtener una sola imagen, que es realmente representativa de cómo se ve la celda en una condición dada. A continuación, se puede añadir un fármaco y volver a mirar esa célula de referencia y ver cómo ha modificado la morfología o la organización de la célula en respuesta a ese fármaco.

Coloque dos chips situ two individualmente en dos pocillos independientes de una placa de seis pocillos, asegurándose de que el logotipo de situ two sea legible. Los chips situ two utilizados para este experimento tienen micropatrones teñidos con FibroGen SI three y deben mantenerse en la oscuridad antes de su uso. Recoja las células hela que tengan aproximadamente un 80% de confluente por tripsina y verifique que estén correctamente individualizadas bajo un microscopio centrífugo a 300 G durante cuatro minutos y vuelva a suspender las células, cuente suavemente y diluya las células hasta una concentración de 15.000 células por mililitro.

En medios de cultivo D-M-E-M-F 12 incompletos, dispense 60.000 células por pocillo. La placa debe moverse lo menos posible para evitar introducir movimientos de rotación en el medio, que tenderán a concentrar las células en el centro. Deje que las células se sedimenten durante 10 minutos bajo el capó, luego muévalas a la incubadora de células.

Dentro de 10 a 20 minutos en la incubadora de células, las células comenzarán a adherirse después de 10 minutos, verifique regularmente bajo el microscopio cuando las células se hayan adherido. Cambie el medio celular y elimine el exceso de células repitiendo el siguiente procedimiento cuatro veces. Manteniendo la placa plana, aspire suavemente el medio desde el costado del pozo.

Tenga cuidado de mantener suficiente material para evitar que el chip se seque. Agregue cuatro mililitros de PBS y aspire comenzando por el centro del chip. Luego, moviéndose hacia el costado del pozo para aspirar la mayor parte del PBS como antes, verifique bajo el microscopio si hay células flotantes.

Si queda una gran cantidad de células flotantes, repita el procedimiento de lavado. Si hay muy pocas células presentes, aspire parte del PBS y reemplácelo con dos mililitros de medio fresco y agregue cuatro mililitros de medio fresco dos veces. Incube las células durante tres horas en una incubadora de células para permitir que las células se propaguen por completo.

Con este método, entre el 10 y el 30% de los micropatrones estarán ocupados por una sola celda, mientras que otros patrones estarán vacíos u ocupados por varias celdas. Para tratar las células con estatinas BLE, diluya la solución madre del fármaco de 17 milimolares hasta una concentración final de cinco micromolares con DMSO al 0,1% en cuatro mililitros de medio. Para el control, prepare el medio con 0.1% de DMSO, solo aspire el medio celular y reemplácelo rápidamente con las estatinas BLEs o las soluciones de control para evitar que el chip se seque.

Incubar las células durante una hora a 37 grados centígrados. Durante esta incubación, prepare el tampón del citoesqueleto. Añade un gramo de sacarosa a dos mililitros de cb.

Esto ayuda a preservar las estructuras celulares internas. Mezclar un mililitro de sacarosa CB con cuatro mililitros de PFA al 5%. Añadir dos mililitros de PFA en la solución de sacarosa CB.

En dos pocillos de una placa fresca de seis pocillos. Para fijar las celdas, use pinzas para recoger el chip CY dos y colóquelo en la placa de seis pocillos que contiene dos mililitros de PFA en solución de sacarosa CB. Incubar las células durante 10 minutos a temperatura ambiente, retirar el PFA y lavar las células una vez con PBS, luego lavar las células con dos mililitros de cloruro de amonio de 100 milimolares durante 10 minutos.

Para apagar la actividad reticulante residual de PFA, permeable las células agregando dos mililitros de PBS que contienen 0.1% de tritton X 100 durante tres minutos, lavado dos veces con filamentos de actina de tinción de PBS con dos mililitros de fain conjugado ZI a uno a 2000 en PBS con 1.5% BSA incubar durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, lavar las células una vez con dos mililitros de PBS. A continuación, sostenga los núcleos.

Agregue dos mililitros de un miligramo por mililitro pregonado en PBS e incube durante tres minutos a temperatura ambiente. Lavar dos veces con dos mililitros de PBS. Monte los dos chips laterales en una corredera estándar utilizando de 25 a 30 microlitros de soluciones de montaje como al.

Para adquirir imágenes en tres longitudes de onda, utilizamos el software de imágenes Metamorph y un microscopio NIK icon eclipse T. Equipado con la cámara CCD Hema Matsu y un iluminador de fibra de mercurio intens lite. Primero seleccione un aumento de 20x.

A continuación, en la barra de menús, abra la adquisición multidimensional. Para configurar los diferentes parámetros del experimento. Primero indica dónde guardar tus datos.

Establezca el número de longitudes de onda en tres, seleccione la longitud de onda SI tres y coloque la corredera de la cubierta de modo que 12 micropatrones estén centrados en el campo de la cámara. El número de micropatrones visualizados por campo variará en función de la configuración de la cámara y del objetivo. Establezca el tiempo de exposición para cada longitud de onda y enfoque automático.

Para PS tres, cree un diario que ejecute la adquisición multidimensional y guárdelo como MDA jnl. Abra la función de etapa de escaneo para adquirir 24 imágenes, cada una con 12 micropatrones. Ingrese seis columnas y cuatro filas con un tamaño de paso de menos 400 micras x y un tamaño de paso de 300 micras y en el diario establecido para ejecutar, cargue el escaneo de prensa MDA jnl del diario para iniciar la adquisición automatizada de las 24 imágenes en las tres longitudes de onda.

En este video, se utilizan micropatrones L para desencadenar la formación de una sola fibra de estrés de actina principal que sostiene la parte no unida de la célula y simplifica la visualización y medición del impacto de las estatinas BLE en las células en comparación con las células asentadas sobre fibronectina simple. Para el procesamiento y análisis automatizado de imágenes, describimos dos macros personalizadas escritas para la imagen del programa de código abierto J a partir de una pila de imágenes sin procesar, la primera macro extrae celdas individuales y crea una celda de referencia. La segunda macro mide el colapso de la membrana celular.

El primer paso es la segmentación de celdas individuales a partir de imágenes sin procesar. Las imágenes de micropatrones marcados con fluorescencia se utilizan para determinar regiones centradas en los micropatrones que se recortan en las imágenes para cada longitud de onda y se vuelven a ensamblar en pilas para cada longitud de onda. Para seleccionar micropatrones con células individuales, el macro detecta el número de núcleos por imagen y elimina en todas las pilas aquellas que contienen más de un núcleo o ningún núcleo.

Por último, el plugin image J multi-stack reg se utiliza para realinear todas las imágenes recopiladas y todos los canales en función de la posición del micropatrón. Este paso genera pilas de líneas de imágenes individuales que ahora se pueden utilizar para el análisis de una sola celda o para crear una celda de referencia. En la imagen J, la celda de referencia se construye haciendo una proyección de las imágenes filtradas y alineadas de una pila.

Se pueden aplicar varios métodos de proyección, pero normalmente se elige una proyección mediana para eliminar los valores atípicos de la pila de imágenes. La celda de referencia es una herramienta única y útil para la representación y el análisis de imágenes que solo se obtiene con células de micropatrones. Para facilitar su examen, se aplica una tabla de búsqueda o LUT para convertir la imagen monocolor en un mapa de frecuencia codificado.

Para caracterizar el efecto de las estatinas de BLEs, se analizó la rigidez y el colapso de la célula utilizando una segunda imagen J macro. Brevemente, las imágenes de umbral del micropatrón L se utilizan para definir una hipotenusa teórica de la forma del triángulo celular. A continuación, se realiza el umbral de las imágenes de tinción de actón para definir la forma de la célula.

A continuación, se mide la diferencia de área entre la hipotenusa teórica y la membrana celular cóncava real, y se considera que las células que presentan un área por debajo de la hipotenusa teórica están colapsadas. El impacto de cinco estatinas BLEs micromolares se caracterizó comparando el número de células colapsadas en condiciones tratadas y control. Las imágenes típicas de las células de micropatrón L tratadas con estatinas BLEs o sin tratar se muestran con micropatrones fijos y teñidos.

La actina y los núcleos se muestran en rojo, verde y azul respectivamente. Nótese el impacto de las estatinas BLE en la forma de las células en comparación con las condiciones de control. Aquí se muestran las células representativas después de la incubación con estatinas BLEs o los controles con fibronectina simple.

Las células se fijaron y se tiñeron con actina y los núcleos están en verde y azul respectivamente. Nótese la similitud entre las condiciones tratadas y las controladas. Se muestran imágenes típicas de células de referencia obtenidas de células tratadas con estatinas BLE o no tratadas.

Obsérvese el potencial de este enfoque para facilitar la observación del fenotipo en estudio. A continuación, se muestra un ejemplo de un análisis de los efectos de las estatinas BLE en las células utilizando la macrohipotenusa. Mientras que el 25% de las células de control estaban colapsadas, esto se triplicó, un 75% en las cinco células BLEs micromolares tratadas con estatinas, lo que refleja la red contráctil de actinina debilitada.

Después de ver esto, ahora debería tener una buena comprensión de cómo los micropatrones adhesivos resuelven varios cuellos de botella en el análisis de alto contenido. En primer lugar, el uso de micropatrones adhesivos hizo que el análisis del procesamiento de captura de imágenes fuera mucho más sencillo. En segundo lugar, los micropatrones permiten la detección de efectos muy sutiles de los fármacos en dosis muy bajas, ya que se reduce la variabilidad de célula a célula al normalizar su morfología y su comportamiento.

Y, por último, en comparación con las miles de células que suelen ser necesarias para obtener un buen resultado en el análisis de células, solo se necesitan unas pocas decenas de células para obtener un resultado robusto y significativo utilizando nuestra célula de referencia.