Análisis simplificado y de alto rendimiento de la contractilidad de una sola célula utilizando elastómeros con micropatrones

Este trabajo presenta un protocolo flexible para utilizar la tecnología de superficies contráctiles elastoméricas marcadas fluorescentemente (FLECS) en formato de micropozos para una cuantificación simplificada y sin intervención de las fuerzas contráctiles de una sola célula basada en desplazamientos visualizados de micropatrones de proteínas fluorescentes.

Las fuerzas mecánicas generadas por las células son esenciales para el funcionamiento adecuado en varios órganos de todo el cuerpo. Además de los intestinos, la vejiga, el corazón y otros. Estos órganos deben generar patrones estables de contracción y relajación celular, para mantener el estado hemostático interno.

La contracción anormal de las células del músculo liso puede conducir a la aparición de diversos trastornos, incluida la dismotilidad intestinal que caracteriza los patrones anormales de contracción intestinal con contracción muscular, así como afecciones como la vejiga hiperactiva o poco activa. Y en las vías respiratorias, algunas células musculares que contraen cualquier patrón irregular pueden desencadenar hiperreactividad asmática. Claramente, los mecanismos contráctiles dentro de las células y los tejidos pueden conducir a enfermedades que requieren opciones de tratamiento.

Y como estas condiciones pueden derivarse directamente de comportamientos contráctiles disfuncionales de las células, se vuelve lógico y necesario medir la función contráctil celular en sí, al evaluar posibles candidatos a medicamentos. Siguiendo los recientes avances en la tecnología micro, desarrollamos un ensayo basado en microplacas fácil de usar que permite mediciones cuantitativas de la contracción de una sola célula. En cientos de miles de células llamadas flex, también conocidas como superficies contraíbles elastoméricas marcadas fluorescentemente.

En este enfoque, incorporamos micro patrones de proteínas fluorescentes, y por lo tanto películas blandas, que se deforman y se encogen cuando las células les aplican fuerzas de tracción. Es importante destacar que los micro patrones de proteínas restringen la posición, la forma y el área de propagación de la célula. Las condiciones de prueba uniformes y permiten mediciones simples basadas solo en sus cambios dimensionales.

En general, la plataforma, que incluye un módulo de análisis de imágenes basado en navegador, permite un análisis sencillo de la fuerza celular contraíble sin requerir procedimientos de manejo delicados o registro de marcadores fiduciarios y puede ser operada por cualquier investigador con los cultivos celulares básicos y el microscopio fluorescente simple con bajo aumento. Esta tecnología debe diseñarse teniendo en cuenta al usuario final, y tiene como objetivo reducir la barrera de entrada para que cualquier científico de laboratorio estudie la biología de la fuerza celular Comience agregando 20 mililitros de medios en un tubo crónico, obtenga una placa de 24 pocillos diseñada para evaluar la contractilidad celular. Ajuste su pipeta a 500 microlitros y obtenga un colador celular para el patógeno celular.

Retire la tapa de la placa de 24 pocillos, sostenga la placa como tal, luego proceda a quitar suavemente la capa de plástico en la parte superior de la placa. Vuelva a colocar con cuidado el plato. Aspire solo PBS de capa superior de cada pozo para evitar cualquier derrame.

Ahora, una fila a la vez, retire el PBS restante del pozo y llénelo rápidamente con 500 microlitros de medios celulares. Agite la placa suavemente y toque de lado para asegurarse de que todo el fondo del pozo esté cubierto con solución. Una vez que todos los pozos se hayan llenado de medios, coloque el plato a un lado.

En este punto, recupere su cultivo celular de la incubadora. Llevaremos a cabo un protocolo de asociación sólido. El propósito de este protocolo es crear una suspensión de 50, 000 células por mililitro.

Antes de sembrar las células, asegúrese de forzar sus células una vez a través del colador, para romper grupos de células en células individuales, coloque cuidadosamente 500 microlitros de su solución celular en cada pozo. Después de la siembra celular, es importante dejar que las placas se asienten durante una hora para que las células puedan asentarse directamente en los patrones. Después de que haya pasado una hora, coloque la placa en una incubadora durante la noche.

La segunda parte del experimento consiste en agregar los medicamentos a la placa de 24 pocillos y la imagen fluorescente de la placa. Para esta parte del protocolo tenemos dos requisitos importantes para garantizar una viabilidad y respuesta celular robusta. La primera es que la concentración final de DMSO en los pozos con célula no es más del 1%, lo que significa que necesitamos hacer una dilución completa de 100 de nuestras existencias de medicamentos.

La segunda es que no podemos agregar DMSO tan directamente a los pozos porque se estrellará contra el fondo de esa mezcla y luego dañará las células con una concentración de alto nivel. En su lugar, debemos crear una solución intermedia de medicamentos y medios DMS0, que podamos mezclar a fondo para evitar una alta exposición local de DSSO a las células. En este protocolo, haremos una dilución de seis pasos ocho veces que cubre un rango de 40 micromolares hasta un Nano molar Crear la serie de dilución de seis pasos ocho veces transfiriendo 30 microlitros de solución farmacológica a volúmenes consecutivos de 210 microlitros de DMSO y mezclando completamente entre cada paso de transferencia En nuestro experimento, evaluaremos el efecto de la blebbistatina.

en vejigas humanas a través de las células musculares. Para cumplir con ambos requisitos, primero crearemos una solución intermedia de medicamentos DMSO y medios. Eso produce una dilución de 16.7 veces de DMSO.

Luego agregaremos esta solución de medicamento intermedio a nuestras células, utilizando proporciones que producen una dilución adicional de seis veces, lo que resulta en una dilución total de 100 y la concentración final de 1% DMSO Para lograr esto, para cada solución de medicamento de stock, mezcle 30 microlitros de medicamento en 470 microlitros de medio de cultivo celular, luego transfiera 200 microlitros de esta solución intermedia al pozo apropiado en la placa de 24 pocillos, que contiene 1000 microlitros en cada pozo. Esto produce colectivamente una concentración final del 1% de DMSO Incubate durante la cantidad adecuada de tiempo. En nuestro experimento, incubamos durante 30 minutos, cuando esté listo para agregar una mancha nuclear viva en todo su pozo, agregue una dilución de uno a 10, 000 del stock.

Deje que se incube durante 15 minutos adicionales. Cuando esté listo para obtener imágenes, necesitará un microscopio fluorescente que esté equipado para obtener imágenes de los canales fluorescentes tanto para los núcleos celulares marcados como para el tinte fluorescente. Se etiquetan los micro patrones con los que en nuestro ejemplo está el canal tri C.

Ahora, seremos fluorescentes por imágenes de núcleos de blebbistatina para identificar células individuales, asegúrese de obtener imágenes de los núcleos de células de tinción en la misma posición exacta en la que ve el micro patrón para que puedan alinearse durante el análisis. Cargue las imágenes adquiridas en su computadora asegúrese de que las imágenes estén etiquetadas correctamente, de modo que los canales del patrón terminen en PT de subrayado. Y las imágenes en el canal nuclear terminan en dapi subrayado. Ahora, convertiremos las imágenes tif a imágenes PNG, usando la imagen J Una vez que la imagen J esté abierta, cargue en un canal a la vez.

Primero cargaremos el canal de patrón y ajustaremos el contraste, para maximizar la señal y minimizar el fondo. Además, suavizaremos la imagen. Una vez modificada la imagen a nuestro gusto, cambiaremos el tipo de imagen a ocho bits.

A continuación, exporte la imagen como un tipo PNG. A continuación, marque la casilla, utilice etiquetas de sector como nombres de archivo. Cree una nueva carpeta llamada PNG.

Luego guarde los archivos PNG allí, para analizar las imágenes, navegue hasta Biodock dot AI, cree una cuenta y comuníquese con los autores para obtener acceso gratuito al módulo de análisis. Inicie sesión una vez que se haya creado su cuenta. Aquí podrás subir nuevas imágenes.

Llamaremos a este nuevo lote, datos de experimentos web JoVE. Ahora, podemos importar las imágenes arrastrándolas y luego soltándolas, presione OK.At este punto, seleccione sus datos. Luego haga clic en analizar, desplácese hacia abajo hasta el módulo etiquetado análisis de contractilidad y luego presione seleccionar.

Establezca la ampliación en el mismo valor que utilizó para la creación de imágenes Una vez que se completen los datos, haga clic en él y luego podemos seleccionar descargar datos. Una vez que se descargan los datos, podemos ver pares de imágenes superpuestas para cada imagen ingresada. También tenemos acceso a una estadística resumida que nos dará la contracción promedio para cada conjunto de celdas.

La unidad de medida para la contracción está en píxeles. Mirando los datos podemos ver aquí que en los pocillos tratados con DMSO solamente, hubo una contracción mucho mayor de las células en comparación con las células que fueron tratadas con blebbistatina. También tenemos acceso a los datos de cada patrón, que se detectó en cualquiera de las imágenes.

Esto nos da información detallada sobre la ubicación de la imagen, el origen de la imagen, el tipo de posición, el número de celdas, ya sea cero uno o más de una, el tamaño del micro patrón y la contracción calculada de las células. Esta puesta consiste en cada patrón identificado dentro de la microplaca. Los patrones de celdas individuales de esta lista fueron promedio para calcular la contracción promedio de la imagen PNG en el otro archivo.

Puede ordenar y analizar los datos de una sola celda según sea necesario para su experimento. Para esta parte del video, mostraremos datos representativos que se pueden recopilar de una placa de 24 pocillos que muestra los datos de respuesta de las células del músculo liso de la vejiga tratadas con dos medicamentos diferentes. Estas son imágenes de pozos tratados con DMSO y blebbistatina respectivamente.

Aquí, podemos ver que las células tratadas con DMSO solamente, muestran una gran cantidad de micro patrones de contrato, pero las células tratadas con blebbistatina eran más grandes y estaban abiertas a notar que hay menos contracción. Los datos de este histograma muestran la variación de la contractilidad celular como resultado de los diferentes tratamientos a las células. El centro de distribución para las células tratadas con blebbistatina es más bajo que el centro de distribución para las células que fueron tratadas con el DMSO.

Esto es consistente con la información mostrada en las imágenes anteriores. Porque las células que fueron tratadas con blebbistatina exhibieron una contracción mucho menor. Esto denota que el tratamiento con blebbistatina relaja significativamente las células.

Cada uno de estos conjuntos de datos contribuye a un punto en la curva de dosis-respuesta que se puede recolectar de una sola placa de 24 pocillos, siguiendo los protocolos que se muestran en el video. Aquí, podemos ver que la citocalasina D es más potente que el blebbistan como lo demuestran los valores más bajos de contracción, dadas las concentraciones más altas de fármaco. Si desea escalar significativamente sus experimentos, hay disponible una versión de placa de 384 pocillos, y esto se puede usar con automatización para escalar dramáticamente los experimentos.

Estos datos se pueden recopilar de una placa de 384 pocillos, en lugar de tener seis pasos de dilución para cada medicamento en la placa de 24 pocillos, la placa de pozo 384 nos permite realizar 20 pasos de dilución para cada medicamento con múltiples réplicas. La tecnología de copos de nieve es única. Permite la visualización de la contracción unicelular mediante microscopía, lo que ha sido imposible hasta ahora.

Por lo tanto, la tecnología se basa en la forma de métricas que se modelan con proteínas marcadas fluorescentemente. El patrón sistemático es para la contracción celular y permite la medición precisa de la modulación de un contrato de fenotipo por cualquier fármaco dado. Por supuesto, esta tecnología todavía se está desarrollando activamente para aplicaciones y muchas áreas de enfermedades diferentes, como asma, enfermedades cardiovasculares, inflamación inmunooncología y, por supuesto, cualquiera de nuestras indicaciones de enfermedades donde la contracción celular anormal juega un papel clave en la progresión de la enfermedad.

A medida que demostramos, esta tecnología basada en micropatrones para medir la contractilidad celular ofrece una alternativa simplificada a la microscopía de fuerza de tracción tradicional, proporcionando un análisis intuitivo, observando el patrón encogerse y proporcionando resolución de una sola célula en grandes poblaciones celulares. Algunas consideraciones, este método puede plantear desafíos para el uso de células que son demasiado pequeñas, como las células T y los neutrófilos, o tipos de células que no se adhieren. Además, las células que semanalmente se unen, se unen entre sí predominantemente o que no se propagan completamente, no producirán señales contráctiles medibles.

Los usuarios de la tecnología deben evaluar cuidadosamente diferentes posibles formulaciones de medios de cultivo celular para su tipo de célula en particular. ya que los diferentes componentes, factores de crecimiento, niveles séricos y sensibilidades al pH pueden impulsar comportamientos variables. La optimización de los protocolos debe proceder al escalado de cualquier flujo de trabajo experimental.

En última instancia, si la resolución de una sola célula no es necesaria, o si el tipo de célula objetivo tiene una capacidad de propagación mínima, entonces se pueden emplear métodos tradicionales de microscopía de fuerza de atracción para tales experimentos. De lo contrario, esperamos que esta herramienta proporcione una vía adicional para que los biólogos celulares estudien la contracción celular y realicen sus estudios.