Name: De alta eficiencia de transducción de las células de cáncer de hígado por recombinante serotipo del virus adeno-asociado 3 Vectores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 2 s
Description: Aprenda a producir vectores AAV3 para transducir células de cáncer de hígado humano con alta eficiencia. Este protocolo detalla la purificación y titulación del virus, demostrando su superioridad en terapia génica.

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Agradecemos a los Dres. R. Jude Samulski y Xiao Xiao para sus regalos de tipo recombinante AAV3 y plásmidos AAV-EGFP, respectivamente, y el Dr. Gail Tomlinson por su generosidad al proporcionar células Hep293TT. Esta investigación fue financiada en parte por el Servicio de Salud Pública otorga beca R01 HL-076901, R01 HL-097088, y P01 DK-058327 (Proyecto 1) de los Institutos Nacionales de Salud (AS).

1. Embalaje de virus recombinante del serotipo 3 adeno-asociados (rAAV3) Vectores <ol><li> Ir a la página web: " <a href="http://www.geguchadze.com/calc">http://www.geguchadze.com/calc</a> "y calcular la cantidad de ADN. </li><li> Pre-mezcla de plásmidos pHelper (ayudante adenovirus), pACG2c3 (AAV ayudante) y pdsAAV-CB-EGFP (rAAV vector) en medio sin FBS y antibióticos. El volumen total debe ser 8.750 l por diez 15 cm 2 placas. </li><li> Añadir directamente 1.250 l de PEI (0,1% m / v, Polysciences, Cat # 23966, pH 4,5) en la solución de ADN en el Paso 1.2. Vortex la solución de ADN-PEI durante unos segundos. </li><li> Incubar ADN-PEI solución para formar un complejo de 5 min a temperatura ambiente (TA). </li><li> Añadir 1 ml de ADN-PEI solución por cada 15 cm 2 de placas. </li><li> Quitar medio después de 4 horas, reemplazando con agua dulce 25 ml de medio completo 10% de SFB (C-DMEM). </li><li> Setenta y dos horas después de la transfección, las células de raspar y se vierte en un tubo de 250 ml de centrífuga cónico. </li><li> Giran a 3000 rpm, a 4 ° C durante 10 min. Elimínese el líquido sobrenadante. </li><li> Vuelva a suspender el pellet de células en 5 ml de RB TMS Buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8,0). Traslado a un nuevo tubo de 15 mL cónico. </li><li> Congelación en hielo seco y baño de etanol durante 10 minutos y descongelar a 37 ° C durante 10 min. Repita tres veces. </li><li> Añadir 1 l de 4,8 M de MgCl 2 y 2 l de Benzonase (25 U / l, Novagen, Cat # 70.664-3). Agitar e incubar a 37 ° C durante 40 min. </li><li> De girar a 4.000 rpm, a 4 ° C durante 40 minutos y recoger el sobrenadante (lisado clarificado). </li><li> En un tubo de 13 ml centrífuga Quick-Seal (Beckman, Cat # 342413), la carga de gradiente iodixanol (OptiPrep, Cat # 1114542) de arriba a abajo: 2 ml de 15%, 2 ml de 25%, 1,5 ml de 40% y 1,5 ml de 60% iodixanol. Cargar el sobrenadante (Paso 1.12) en la parte superior del gradiente iodixanol. Llenar los tubos con RB Buffer TMS. </li><li> Centrifugar a 75.000 rpm durante 1 hora a 16 ° C con rotor Beckman 90TI. </li><li> Recoger la fracción iodixanol 40% mediante la inserción de una jeringa en el 40-60% de los límites. </li><li> La transferencia de la fracción iodixanol 40% en un tubo cónico de 50 ml y completar hasta 40 ml con tampón A. (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5) </li><li> Montar el equipo de filtración utilizando HiTrap Q HP columna (GE Healthcare, Cat # 17-1154-01). Lavar la columna con el tampón siguiente: 25 ml de tampón A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5);, 25 ml de tampón B (10 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8,5), 50 ml de tampón A 40 ml de muestra de virus en un Buffer, 50 ml de tampón A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5);, 20 ml de tampón C (20 mM Tris, 175 mM NaCl, pH 8,5) </li><li> Recoger C de búfer en un 20 concentradores ml Apolo (Orbital Biosciences). Se centrifuga a 3000 rpm, a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Deseche el filtrado y agregar 20 ml de PBS frío y centrifugar a 3.000 rpm, a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Deseche el filtrado y añadir 500 l de PBS frío. Lavar los vectores de la membrana y la transferencia de siliconado tubos Eppendorf y se congele en pequeñas alícuotas a -80 ° C. </li></ol> 2. Determinación de rAAV3 Los títulos vectoriales <ol><li> Descongele 10 l de agua purificada de virus en un tubo Eppendorf en hielo. Añadir 40 l de ddH 2 O. </li><li> Añadir 0,2 l de Benzonase (25 U / l, Novagen, Cat # 70664) y se incuba a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Tome 50 L de la norma plásmido (0,2 ng / mL) en otro tubo Eppendorf. </li><li> Añadir 50 l de 100 mM NaOH en cada tubo y se incuban en 65 º C durante 30 min. </li><li> Se enfría en hielo inmediatamente a por lo menos 5 min. </li><li> Corte la membrana de transferencia (Millipore, Cat # INYC00010) de acuerdo con Bio-Dot Papel de filtro (Bio-Rad, Cat # 1620161). Enjuague la membrana en SSC 10x con tres papeles de filtro durante 20 minutos. </li><li> Establecer ranura blot SF aparato (Bio-Dot, Cat # 170 a 6.542). Conectarse a un frasco vacío y añadir 100 ml de 10x SSC a los aparatos de slot blot. </li><li> Añadir 100 L de 20x SSC y 1 L de colorante de carga 6x a cada una de las muestras en el Paso 2.5. </li><li> Carga de 100 l de cada muestra en la membrana en el aparato de slot blot. </li><li> Agregue otro 100 l de 10x SSC en cada una de las muestras. </li><li> Repita los pasos 2.9 y 2.10 hasta que la muestra pasa a través de la membrana. </li><li> Desmontar el aparato de slot blot y quitar la membrana. Lo puso en Enlazador Inspector SL-1000 Crosslinker UV. A su vez sobre "Energía", "óptima Crosslink" (show 1200) y pulsar "Start". </li><li> Hervir 1 ml de esperma de salmón (SS) del ADN (Fisher, Cat # NC9753983) durante 5 min. Se enfría en hielo durante al menos 5 min. </li><li> Prepare la solución pre-hibridación mediante la mezcla de 27,5 ml de ddH2O, 15 ml de 20x SSC, 5 ml de solución de 50x Denhardt, 1,25 ml de 20% SDS, 0,25 ml de Polya y 1 ml de SS de ADN a partir del paso 2.13. </li><li> Suspender la membrana en 25 ml de solución de pre-hibridación en un cilindro de vidrio tapado y se incuba a 65 ° C en una cámara de hibridación noche a la mañana. </li><li> Diluir 50 plantillas ng de DNA en 10 l de ddH2O. Hervir a 100 º C durante 5 minutos y enfriar en hielo inmediatamente a por lo menos 5 min. </li><li> Se centrifuga a 3000 rpm a temperatura ambiente durante 1 min. Añadir 2 l de 10 mM dNTPs 3 (que carecen de dCTP), 2 l de la mezcla hexanucleótido (Roche, Cat # 11277081001), 1 l de Klenow (Roche, Cat # 11008404001) y 5 L de α -32 P-dCTP. Se incuba a 37 ° C durante 10 min. </li><li> Centrifugadora G-50 columnas (GE Healthcare, Cat # 27-5330-01) a 3.000 rpm durante 2 min. carga de la sonda en el paso 2.17 en la columna. Se centrifuga a 3000 rpm durante 2 minutos y recoger el filtrado. </li><li> Contar con la radiactividad. Hierva la sonda a 100 º C durante 5 minutos y enfriar en hielo inmediatamente a por lo menos 5 min. </li><li> Añadir la sonda (6x10 5 cpm / ml) en la solución de pre-hibridación con la membrana. </li><li> Incubar toda la noche a 65 ° C en una cámara de hibridación. </li><li> Deseche la solución de hibridación y lavado de la membrana en 2x SSC 0,1% SDS a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Deseche la solución y enjuague de la membrana en 0,1 x SSC 0,1% SDS a 65 ° C durante 30 min. </li><li> Deseche la solución y enjuague de la membrana en 0,1 x SSC a una breve RT. </li><li> Exponer la película a -80 ° C durante 6 horas y desarrollar la película. Un resultado típico se muestra en la Figura 1. </li></ol> 3. rAAV3 vector-mediado de transducción y la expresión del transgén en células humanas de cáncer de hígado <ol><li> Semillas de 1x10 4 células (ya sea Huh7 o Hep293TT) en cada pocillo de placa de 96 pocillos. Incubar en un incubador humidificado de CO 2 durante al menos 18 horas. </li><li> Quitar medio de la placa de 96 pocillos. </li><li> Lavar las células dos veces con 50 l de medio sin FBS y antibióticos y eliminar. </li><li> Añadir 50 l de medio sin FBS y antibióticos y vectores rAAV en 5000 VGS / celular. </li><li> Incubar las placas en la incubadora de CO 2 durante 4 horas. </li><li> Se elimina el medio. Lavar las células dos veces con 50 l de medio completo y se retire. </li><li> Añadir 150 ml de DMEM-C a cada pocillo e incubar la placa en la incubadora de CO 2 durante 72 horas, y visualizar la expresión EGFP utilizando un microscopio de fluorescencia (DMI 4000B, Leica Microsystems). </li><li> Imágenes de tres pozos de células infectadas por virus son analizados cuantitativamente por análisis de software ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EE.UU.). </li><li> La expresión del transgen se evalúa como un área total de fluorescencia verde (pixel 2) por el campo visual. Un resultado típico se muestra en la Figura 2. </li><li> La expresión del transgen también puede ser determinada por citometría de flujo. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, se puede generar vectores AAV serotipo de manera eficiente. El rendimiento típico es de ~ 500 ~ l contiene 10 11 VGS / l de agua purificada de valores vectoriales. La pureza de las acciones vector se determina mediante la comparación de las señales de hibridación de ADN cuantitativa manchas ranura, con y sin digestión Benzonase. Purificada rAAV3 vectores cáncer de transducción de hígado humano - hepatoblastoma (HB) y el carcinoma hepatocelular (CHC) - las líneas celulares de manera eficiente. <img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. ADN cuantitativa slot-blot para determinar los títulos de rAAV3 vectores. Diluciones de los stocks de virus purificado, digerido con Benzonase (fila superior) fueron analizadas en el cuantitativo manchas de ADN ranura con 32 P-etiquetados EGFP sonda específica de ADN. El título de AAV3 vector se determinó por comparación con 1 ng (fila central) o 10 ng (fila inferior) de AAV-EGFP normas plásmido cargado en la membrana. Los números corresponden a copias de ADN. <img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Recombinantes AAV vector mediada por la expresión del transgén en células humanas de cáncer de hígado. Hep293TT células, una recientemente creada línea celular humana hepatoblastoma 4, eran (izquierda) modelo de infectados, o transducidas con 5.000 VGS / celular de cualquiera de scAAV2-EGFP o vectores scAAV3-EGFP a 37 ° C durante 2 horas. La expresión del transgen se visualizó 72 horas después de transducción, utilizando un microscopio de fluorescencia.

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Vectores recombinantes basados ​​en un parvovirus no patógenos humanos, el virus adeno-asociados (AAV) se han desarrollado, y están actualmente en uso en una serie de ensayos de terapia génica clínica 5. Anteriormente, de los 10 serotipos más comúnmente utilizado AAV, la eficiencia de transducción de AAV3 vectores, en general, se ha informado es particularmente bajo, tanto in vitro como in vivo 1. Sin embargo, nuestra reciente observación de que AAV3 vectores de transducción de hígado humano líneas celulares de cáncer muy bien, como se determina cuantitativamente por citometría de flujo 2, y que AAV3 utiliza el crecimiento de hepatocitos humanos receptor del factor (hHGFR) como co-receptor celular para la entrada de enlace y en estas las células 3, sugieren una selectiva del tejido tropismo de AAV3 de las células del hígado humano en general, y las células humanas del cáncer de hígado en particular. Sin embargo, desde AAV3 vectores también transducción de hepatocitos humanos normales eficiente 2, su uso potencial en la aplicación de la terapia génica contra el cáncer in vivo sería un impacto negativo. Una estrategia posible para evitar este problema potencial consiste en la transcripción de metas de las células cancerosas mediante la identificación de un producto génico que es selectivamente por el tumor, pero no por los hepatocitos normales. Por ejemplo, estudios previos han mostrado que los niveles séricos de α-fetoproteína (AFP) se utiliza como un marcador específico para el seguimiento de la presencia, la progresión y / o recurrencia de ciertos tipos de cánceres de hígado, ya que los hepatocitos normales generalmente producen cantidades muy pequeñas de esta proteína. De hecho, hemos utilizado AAV3 vectores que contienen el promotor de la AFP para dirigir la expresión del transgén en las células de cáncer de hígado, pero no en los hepatocitos normales 2, y los estudios están actualmente en marcha para probar la eficacia de este enfoque en un modelo murino xenoinjertos de cáncer de hígado. En nuestros estudios adicionales, se ha observado que la eficacia de transducción de diversos vectores AAV serotipo puede ser significativamente aumentada por mutagénesis dirigida de la superficie expuesta residuos de tirosina en las cápsidas virales 06.14. Desde el 6 de 7 en la superficie expuesta tirosinas también se conservan en AAV3, hemos llevado a cabo la mutagénesis dirigida de los residuos, y observó que la eficacia de la transducción de la tirosina-mutante AAV3 vectores es significativamente mayor en células humanas de cáncer de hígado (datos no publicados). Los estudios también están llevando a cabo para evaluar la seguridad y la eficacia de la tirosina-mutante AAV3 vectores en modelos de xenoinjerto de ratón para el hepatoblastoma y el carcinoma hepatocelular humano, y si tiene éxito, el óptimo de la tirosina-mutante vectores serotipo AAV3 puede resultar útil para orientar el hígado humano tipos de cáncer para la terapia génica potencial.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-0170CM</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Benzonasa</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>Columna HiTrap Q HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1154-01</td><td></td></tr><tr><td>ADN de esperma de salmón</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9753983</td><td></td></tr><tr><td>Gradiente de yodixanol</td><td>OptiPrep</td><td>1114542</td><td></td></tr><tr><td>Columnas G-50</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td></td></tr></tbody></table>

de alta eficiencia de transducción de las células de cáncer de hígado por recombinante serotipo del virus adeno-asociado 3 vectores

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors 

Vectores recombinantes basados ​​en un parvovirus patógeno no humanos, el virus adeno-asociado 2 (AAV2) se han desarrollado, y están actualmente en uso en una serie de ensayos clínicos de terapia génica. Más recientemente, una serie de nuevos serotipos de AAV también se han aislado, que se ha demostrado que la exposición selectiva de tejidos tropismo en varios modelos animales grandes y pequeños 1. De los 10 serotipos más comúnmente utilizado AAV, AAV3 es por lejos la menos eficiente en la transducción de células y tejidos in vitro, así como in vivo. Sin embargo, en nuestros estudios publicados recientemente, hemos documentado que AAV3 vectores transducir cáncer de hígado humano - hepatoblastoma (HB) y el carcinoma hepatocelular (CHC) - las líneas de células extremadamente eficiente porque utiliza AAV3 receptor del factor de crecimiento de hepatocitos como un co-receptor celular para la unión y la entrada de estas células 2,3. En este artículo se describen los pasos necesarios para lograr una alta eficiencia de transducción de células humanas de cáncer de hígado por recombinante AAV3 vectores portadores de un gen reportero. El uso de recombinantes AAV3 vectores portadores de un gen terapéutico puede llevar finalmente a la terapia génica potencial de cáncer de hígado en los seres humanos.

En este artículo se describe la identificación del serotipo del virus adeno-asociado 3 (AAV3) como el vector más eficiente para orientar las células humanas del cáncer de hígado.

De alta eficiencia de transducción de las células de cáncer de hígado por recombinante serotipo del virus adeno-asociado 3 Vectores

Se han desarrollado vectores recombinantes basados en un parvovirus humano no patógeno, el virus adenoasociado 2 (AAV2), los cuales se utilizan actualmente en un...

El objetivo general de este procedimiento es producir vectores activos del virus adenoasociado del serotipo tres que puedan transducir eficientemente células de cáncer hepático humano. Esto se logra primero transfectando simultáneamente tres plásmidos diferentes en células 293. El segundo paso del procedimiento consiste en purificar el AAV tres ensamblado en las células 293.El tercer paso del procedimiento consiste en determinar la concentración del stock purificado del vector AAV tres. El paso final del procedimiento es transducir células de cáncer hepático humano utilizando los vectores AAV tres purificados. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la proteína EGFP altamente expresada en células de cáncer hepático humano mediante microscopía de fluorescencia.La principal ventaja de esta técnica frente al método existente consiste en lograr una alta eficiencia de transferencia y expresión génica en células de cáncer hepático humano. Aunque este método puede proporcionar información sobre la producción de los tres vectores de AAV, también puede aplicarse a otros sistemas, como los vectores AAV2 más ampliamente utilizados. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la cantidad de pasos involucrados, los cuales pueden resultar tediosos. La demostración del procedimiento estará a cargo de un científico biólogo de nuestro laboratorio.Las manipulaciones experimentales en esta sección del protocolo se realizan dentro de una cabina de cultivo celular 48 horas antes de comenzar este procedimiento. Sembrar 10 placas de cultivo celular de 15 centímetros con la línea celular de riñón embrionario humano 2, 9 3 de manera que las células presenten una confluencia del 70 al 80% el día de la transfección. Utilice el sitio web www.ge shae. com/calc para calcular la cantidad de ADN plasmídico que se utilizará para la transfección. Una vez que se hayan calculado los volúmenes correctos de ADN plasmídico, proceda a la transfección: pipetee un volumen adecuado de medio de cultivo celular sin FBS ni antibióticos en un tubo estéril de 15 mililitros.Luego pipetee los volúmenes requeridos de P helper, PACG dos, C3 y PDSA AAV C-B-E-G-F-P en el medio. El volumen total debe ser de 8.750 microlitros para 10 placas de 15 centímetros; pipetee 1.250 microlitros de PEI en el medio que contiene el ADN plasmídico. Vortexee la solución ADN-PEI durante unos segundos, luego incube la solución ADN-PEI durante cinco minutos a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos ADN-PEI. Recupere las 10 placas de 15 centímetros de células HEC 293 del incubador de cultivo celular.Luego, pipetee un microlitro de la solución de D-N-A-P-E-I en cada una de las placas. Incube las placas en un incubador de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante cuatro a seis horas. Después de cuatro a seis horas, aspire cuidadosamente el medio de las placas.Luego, pipetee 25 mililitros de medio completo con 10% de FBS en cada placa. Incube las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 72 horas. Una vez transcurridas las 72 horas, retire las placas del incubador y regrese a la cabina de cultivo de tejidos.Luego, sin aspirar el medio de la placa, utilice un raspador de células para desprender la capa celular del fondo de la placa hacia el medio de cultivo celular. Vierta el medio que contiene las células en un tubo cónico de centrífuga de 250 mililitros. Repita este procedimiento para cada una de las placas transfectadas, vertiendo el contenido de cada placa en el mismo tubo cónico de centrífuga de 250 mililitros.Centrifugue el tubo que contiene las células y el medio en una centrífuga fría. Cuatro grados Celsius durante 10 minutos a 3000 rotaciones por minuto. Tras la centrifugación, deseche el sobrenadante, luego pipetee cinco mililitros de tampón RB TMS sobre el precipitado y resuspenda. Transfiera la solución celular a un tubo cónico de centrífuga limpio de 15 mililitros.Coloque el tubo de 15 mililitros en un baño de etanol con hielo seco para congelar durante 10 minutos. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, retire el tubo y colóquelo a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Para descongelar, repita este ciclo de congelación y descongelación otras dos veces.Vortex la tubo durante unos segundos. Después de cada descongelación, tras el período final de descongelación, pipetee un microlitro de cloruro de magnesio 4,8 molar y dos microlitros de 25 unidades por microlitro. Benon nase en la solución celular y vortex para mezclar.Luego, incubar a 37 grados Celsius durante 40 minutos tras la incubación. Colocar el tubo en una centrífuga refrigerada a cuatro grados Celsius y centrifugar a 4.000 rotaciones por minuto durante 40 minutos. Hacia el final del período de centrifugación, preparar el gradiente de IAL que se utilizará para purificar el virus. Para ello, pipetear dos mililitros de 15%, dos mililitros de 25%, 1,5 mililitros de 40% y 1,5 mililitros de 60% de IAL en un tubo de centrífuga sellado de 13 mililitros.Después de la centrifugación, pipetee el sobrenadante S desde el tubo de centrífuga, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento celular; pipetee el sobrenadante sobre el gradiente IAL y luego agregue con pipeta suficiente tampón RB TMS al tubo para llenarlo completamente. Coloque el tubo en un rotor Beckman 90 TI, asegurándose de que el rotor esté adecuadamente equilibrado. Centrifugue a 75.000 rotaciones por minuto durante una hora a 16 grados Celsius.Tras la centrifugación, recolecte la fracción de 40 % IAL insertando una jeringa de cinco mililitros equipada con una aguja de calibre 18 en el gradiente idal en el límite del 40 al 60 %. Aspire cuidadosamente con la jeringa y recoja la fracción idal del 40 %.Expulse la fracción de 40 %IAL de la jeringa hacia un tubo cónico de 50 mililitros. Luego, complete el tubo hasta un volumen final de 40 mililitros con el tampón a. Arme el aparato de filtración utilizando una columna High Trap Q HP según las instrucciones del fabricante.Luego, lave la columna con las siguientes soluciones: 25 mililitros de tampón A, 25 mililitros de tampón B, 50 mililitros de tampón A, 40 mililitros de la muestra preparada de virus idal en tampón A, 50 mililitros de tampón A y finalmente 20 mililitros de tampón C. Recoga el tampón C en un concentrador Apollo de 20 mililitros. A continuación, centrifugue la muestra en una centrífuga refrigerada ajustada a cuatro grados Celsius durante 10 minutos a 3000 rotaciones por minuto; tras la centrifugación, deseche el flujo atravesante.Luego, agregue 20 mililitros de PBS frío al concentrador Apollo y centrifugue nuevamente en una centrífuga fría a cuatro grados Celsius durante 10 minutos a 3000 rotaciones por minuto tras la centrifugación. Nuevamente, deseche el flujo, pipetee 500 microlitros de PBS frío sobre la membrana para resuspender el virus de la membrana. Luego, pipetee alícuotas de 10 microlitros del vector viral en tubos eppendorf tratados con silicona y almacénelos a menos 80 grados Celsius hasta su uso; derrita una de las alícuotas de 10 microlitros del virus purificado sobre hielo.Pipetee 40 microlitros de agua doblemente destilada en el tubo para diluir el virus. A continuación, agregue 0,2 microlitros de Ben Nase al 25 unidades por microlitro e incube la mezcla a 37 grados Celsius durante una hora. Mientras tanto, pipetee 50 microlitros de estándar de plásmido al 0,2 nanogramos por microlitro en un tubo eppendorf limpio.Tras la incubación, añada 50 microlitros de hidróxido de sodio 100 milimolar al tubo que contiene el virus. Prepare una mezcla Bens aase y añádala al tubo que contiene el estándar de plásmido. Incube ambos tubos a 65 grados Celsius durante 30 minutos.Una vez transcurridos los 30 minutos, enfríe inmediatamente ambos tubos en hielo durante al menos cinco minutos. A continuación, corte un trozo de membrana de transferencia del mismo tamaño que un trozo de papel filtro bio dot. Coloque la membrana de transferencia y tres trozos de papel filtro bio en una bandeja poco profunda.Llene la bandeja con SSC 10 veces y deje en remojo durante 20 minutos mientras la membrana se empapa. Configure el aparato de bloque de ranuras SF según las instrucciones del fabricante. Conecte el aparato a un matraz de vacío, luego pipetee 100 microlitros de SSC 10 veces en cada una de las ranuras que se cargarán con la dilución de la muestra de virus y el estándar de plásmido.Retire los tubos del centrifugador refrigerado con hielo ajustado a cuatro grados Celsius durante un minuto a 13.000 rotaciones por minuto. A continuación, agregue 100 microlitros de SSC 20 veces y un microlitro de colorante de carga 6 veces a cada tubo. Luego, pipetee otros 100 microlitros de SSC 10 veces en cada tubo y cargue 100 microlitros de cada muestra en ranuras adyacentes.Repita el procedimiento de dilución y carga hasta que todo el volumen de cada muestra se haya cargado en el aparato de bloque de ranuras y se hayan realizado adiciones adicionales de SSC 10 veces, su volumen de 100 microlitros o menos. Una vez que todas las muestras hayan pasado a través de la membrana, desarme el aparato de bloque de ranuras y retire la membrana con pinzas. Tenga cuidado de manipular la membrana por los bordes y coloque la membrana en la cámara del cruzador UV inspector linker SL 1000.Luego, seleccione el entrecruzamiento con energía óptima; el entrecruzamiento debe tardar aproximadamente 30 segundos. Ahora prepare la hibridación hirviendo un mililitro de ADN de esperma de salmón durante cinco minutos. Después de hervir durante cinco minutos, el ADN de esperma de salmón debe enfriarse inmediatamente en hielo durante al menos cinco minutos.Luego, prepare la solución de prehibridación según el protocolo escrito. Pipetee 25 mililitros de la solución de prehibridación que contiene ADN de esperma de salmón en un tubo de hibridación. Transfiera cuidadosamente la membrana entrecruzada al tubo de hibridación y luego coloque la tapa en el tubo, asegurándose de que la solución de prehibridación cubra completamente la membrana.En posición horizontal, incubar en una cámara de hibridación a 65 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, comenzar la preparación de la sonda pipeteando 50 nanogramos de la plantilla de ADN en un tubo einor y añadiendo 10 microlitros de agua doblemente destilada para diluir; hervir el ADN diluido durante cinco minutos y luego enfriar inmediatamente en hielo durante al menos cinco minutos. Centrifugar la plantilla de ADN diluido a 13.000 rotaciones por minuto durante un minuto a temperatura ambiente.Luego, trabajando de acuerdo con las directrices de seguridad de la institución respecto a la radiactividad. Prepare la sonda radiactiva añadiendo dos microlitros de DN TPS 10 milimolar sin DCTP, dos microlitros de hexanucleótido. Mezcle un microlitro de AU y cinco microlitros de 32 P-D-C-T-P, incube a 37 grados Celsius durante una hora tras la incubación.Prepare columnas G 50 mediante centrifusión a 3000 rotaciones por minuto durante dos minutos. Luego cargue la sonda en la columna y centrifugue su muestra a 3000 rotaciones por minuto durante dos minutos y recoja el flujo que atraviesa. En este punto, se mide la radioactividad del flujo que atraviesa utilizando procedimientos estándar para determinar las cuentas por minuto por mililitro de la sonda.A continuación, hierva la sonda durante cinco minutos. Después de esto, enfríe inmediatamente la sonda en hielo durante cinco minutos. La sonda ya está lista para usarse en la hibridación sin retirar la membrana.Pipetee la sonda a una concentración de seis veces el centro de cinco cuentas por minuto por mililitro directamente en la solución de prehibridación en el tubo de hibridación. Incube la cámara de hibridación durante la noche a 65 grados Celsius al día siguiente. Deseche la solución de hibridación según los protocolos institucionales de radioactividad y pipetee 25 mililitros de SSC dos veces más 0,1 % SDS en el tubo y lave la membrana durante 15 minutos a temperatura ambiente.Deseche la solución y pipetee 25 mililitros de SSC 0,1 veces más 0,1 % de SDS en el tubo. Lave la membrana a 65 grados Celsius durante 30 minutos. Después de este lavado, deseche la solución y enjuague brevemente la membrana con 25 mililitros de SSC 0,1 veces a temperatura ambiente.Envuelva la membrana en película de kling y colóquela en una cassette de exposición trabajando en la oscuridad. Coloque una pieza de película encima de la membrana y cierre la cassette para protegerla de la luz. Coloque la cassette de exposición en el congelador a menos 80 grados Celsius durante seis.Después de seis horas, revele la película y determine el título de los lotes virales comparando la densidad de las bandas virales con las bandas de los patrones de plásmido. Una vez determinado el título, el virus puede utilizarse para transducir células; primero siembre 1 × 10⁴ células Hep 293 TT.En cada pocillo de una placa de 96 pocillos, incubar las células durante al menos 18 horas en un incubador con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius. Tras la incubación, aspirar el medio de cada pocillo y pipetear cuidadosamente 50 microlitros de medio sin antibióticos y sin FBS en cada uno. Aspirar este medio y luego repetir el proceso para lavar las células.Diluya los vectores recombinantes a a v en medio sin FBS y antibióticos hasta una concentración final de 5.000 VGS por célula. Añada 50 microlitros de esta solución o 50 microlitros de medio sin FBS como control negativo a los pocillos de la placa de 96 pocillos e incube durante dos horas en un incubador con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius. Tras la incubación, retire el medio que contiene el virus y lave las células dos veces como antes, utilizando 50 microlitros de medio completo por pocillo.Después de desechar el último lavado, añada 150 microlitros de medio completo a cada pocillo e incube la placa en un incubador con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante 72 horas. Finalmente, visualice la expresión de EGFP mediante microscopía de fluorescencia. La intensidad de fluorescencia puede cuantificarse utilizando el software Image J, evaluando la expresión del transgén como el área total de fluorescencia verde por campo visual.Un ejemplo de un bloque cuantitativo de ranuras de ADN para determinar los títulos de los vectores RAV tres se muestra aquí. Esta membrana ha sido hibridada con una sonda de ADN específica de EGFP marcada con P 32. La fila superior del bloque comprende diluciones por duplicado de lotes víricos purificados digeridos con Ben Nase.Las filas intermedia e inferior están compuestas por estándares de A-A-V-E-G-F-P diluidos a partir de un nanogramo o diez nanogramos de plásmido, respectivamente. La titulación de los lotes virales se determina mediante comparación con los estándares de plásmido. Los números mostrados en la transferencia corresponden al número de copias de ADN plasmídico.Este es un ejemplo de expresión de transgenes mediada por un vector AAV recombinante. En una línea celular de hepatoblastoma humano, las células se visualizaron 72 horas después de la transducción utilizando un microscopio de fluorescencia. La primera imagen ilustra los resultados de una infección control.La segunda imagen muestra células HEP 2 93 TT transducidas con 5.000 VGS por célula de todos los vectores AAV dos EGFP a 37 grados Celsius durante dos horas. La imagen final muestra la transducción con 5.000 VGS por célula de RAAV tres EEGFP en las mismas condiciones. Puede observarse que RAAV tres es mucho más eficiente en la transducción de este tipo celular en comparación con RAAV dos.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la terapia génica, como cómo dirigirse a células de cáncer hepático humano. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento del cáncer hepático humano porque una V tres tiene la capacidad de expresar un gen terapéutico específicamente en el cáncer hepático humano a un nivel alto.

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