Determinación de estructuras moleculares de glicoproteínas de la envoltura del VIH con Cryo-tomografía electrónica y automatizada promedio Sub-tomografía

Más de 60 millones de personas han sido infectadas con el VIH, el virus que causa el SIDA. El VIH/SIDA es una crisis sanitaria mundial y, aunque los intensos esfuerzos de investigación han dado lugar a vidas dramáticas de personas infectadas, una verdadera vacuna sigue siendo difícil de alcanzar. Uno de los principales objetivos de la investigación de vacunas contra el VIH es la glicoproteína de la envoltura, que el VIH utiliza para entrar en las células diana.

En este video, demostramos cómo obtenemos estructuras de esta importante proteína utilizando una técnica de imagen llamada crio-tomografía electrónica. Comenzando con el VIH purificado, mostramos los pasos en la preparación de muestras congeladas, los pasos en el registro de imágenes de microscopía electrónica de estas muestras congeladas y los pasos en la conversión de estas imágenes en modelos estructurales que podrían ser útiles para el diseño de vacunas contra el VIH/SIDA. Un aspecto único de lo que presentamos en este video es que el trabajo será demostrado por miembros de su laboratorio que abarcan una amplia gama de edades, desde estudiantes de secundaria y preparatoria hasta estudiantes universitarios y de posgrado, pasando por becarios postdoctorales y científicos senior.

La preparación de muestras de virus vitrificadas adecuadas para la tomografía crioelectrónica se logra mediante la propagación de una suspensión acuosa de virus a través de pequeños orificios en una película de carbono sostenida por una rejilla de cobre y luego congelando rápidamente los virus. El objetivo de este paso es preparar una muestra congelada de virus intactos capturados en un estado casi nativo. Para empezar, las rejillas se colocan dentro de una unidad de descarga incandescente.

Este dispositivo limpia las redes exponiéndolas al gas ionizado. Ahora que las rejillas están listas para su uso, se prepara una suspensión de virus mezclados con pequeñas partículas de oro. Estas partículas son esenciales para la recopilación y el procesamiento de datos.

A continuación, se coloca una gota de suspensión de virus en la rejilla recién limpiada con plasma. A continuación, la rejilla se carga en un robot, que la seca con papel de filtro, reduciendo la gota a una fina película de líquido. A continuación, la muestra se sumerge en etano líquido, que congela rápidamente los virus a una velocidad superior a los 100.000 kelvin por segundo.

A continuación, la rejilla congelada por inmersión se transfiere a una caja de almacenamiento para su transporte al microscopio. Esto se repite hasta que se congela el número deseado de cuadrículas. Ahora que las cuadrículas de muestras de virus están listas, el siguiente paso es cargarlas en el microscopio.

En el caso de las imágenes, esto se puede hacer manualmente o con asistencia robótica. Cuando las rejillas de muestras se cargan manualmente, el usuario se sienta en una estación especializada donde las muestras se pueden manipular bajo nitrógeno líquido, las muestras se colocan en una cámara portátil enfriada por nitrógeno que se sella, se evacua y luego se conecta al microscopio. Los microscopios más nuevos son capaces de realizar una carga de muestras más automatizada.

Aquí, en un microscopio Titan Cryos, el usuario entrega muestras congeladas al microscopio y luego se cargan robóticamente con las rejillas de muestras cargadas en el microscopio. Cada cuadrícula puede ser examinada por el usuario antes de que puedan comenzar las imágenes. Los parámetros del microscopio se configuran para cada área de la cuadrícula de muestras que tiene características de interés.

En este caso, las características son los virus del VIH. A medida que se define cada nueva área, la computadora del microscopio almacena los parámetros de imagen específicos del área. Cuando el usuario ha definido todas las posiciones de interés, la computadora vuelve a visitar cada posición automáticamente y recopila un conjunto de datos.

Cada conjunto de datos se recopila inclinando la cuadrícula de muestra con respecto al haz de electrones, al tiempo que se garantiza que el haz permanezca enfocado en el mismo punto de la cuadrícula. La recopilación de datos en microscopía electrónica ha requerido tradicionalmente que los usuarios se sienten frente al microscopio e interactúen físicamente con el equipo. Este estilo de interacción con el microscopio se muestra aquí durante una visita del presidente Obama a una fábrica de inteligencia.

Los avances recientes en las interfaces de microscopio y computadora ahora permiten a los usuarios monitorear y ajustar la recopilación de datos en tiempo real desde una computadora remota en el laboratorio o en otro lugar. Con el fin de visualizar las formas de la envoltura, los picos de glicoproteínas, la información de cientos de imágenes individuales debe promediarse para aumentar la señal. Este es un proceso computacionalmente intensivo, que se logra aquí mediante el uso de un grupo de computadoras llamado Bio Wolf.

Ubicados en los NIH, se han desarrollado métodos poderosos para extraer volúmenes individuales y promediar la información utilizando algoritmos que pueden trabajar con altos niveles de ruido. Intrínsecos a este tipo de datos, los mapas de densidad obtenidos tanto de los virus nativos como de los virus complejos a moléculas biológicamente importantes proporcionan una rica base de datos de información sobre la biología estructural del VIH. Los mapas de densidad cobran vida en detalle molecular cuando los datos se combinan con la información de la cristalografía de rayos X de las subunidades individuales que componen la espícula de glicoproteína de la envoltura.

Los datos que salen de estos tomos pueden ser muy densos y difíciles de interpret. 3D software para la industria del entretenimiento se puede utilizar para visualizar los modelos 3D agregando colores, texturas e iluminación, lo que facilita su análisis. El software de visualización más utilizado es Mirror, 3D, Studio Max y Maya.

Acabamos de demostrar procedimientos paso a paso sobre cómo se pueden obtener modelos moleculares para la estructura de la envoltura. Glicoproteína, a partir del VIH purificado. Usando este método, también hemos determinado estructuras para la glicoproteína de la envoltura en complejo con una variedad de moléculas que pueden unirse y utilizar el virus.

Aquí mostramos un ejemplo de la estructura de la glicoproteína de la envoltura en complejo con un anticuerpo llamado B12. Comprender por qué algunas moléculas pueden unirse y utilizar el virus mientras que otras no lo hacen es muy importante para el diseño racional de vacunas. La determinación de las estructuras moleculares de las glicoproteínas de la envoltura del VIH o de otros virus, como la gripe y el ébola, es clave para comprender la entrada y utilización del virus.

Como ha visto, la criotomografía electrónica está emergiendo como una poderosa herramienta para lograr este objetivo.