Barrera hematoencefálica o modelo BBTB: una adaptación del modelo de barrera hematoencefálica o BBB para evaluar la administración de tratamientos al tumor

La barrera hematoencefálica, o BBB, es una barrera selectiva de células endoteliales y células cerebrales como los astrocitos que regula el transporte de sustancias entre la sangre y el cerebro.

Para desarrollar un modelo de BBB, invierta un inserto de membrana en la tapa de una placa de cultivo.

Sembrar astrocitos sobre la membrana. Coloque la placa de cultivo sobre el inserto e incube.

Esto atrapa a los astrocitos entre la membrana y la superficie del pozo.

Invierta la placa para llevar los astrocitos al fondo y agregue un medio adecuado al pocillo.

Al inserto, agregue células endoteliales que expresen proteínas óptimas de unión estrecha que mejoren los contactos de célula a célula necesarios para la formación de barreras.

Incubar para permitir que las células endoteliales se adhieran a la membrana.

Retire el medio gastado y transfiera el inserto a otro medio de astrocitos libre de factor de crecimiento que contenga bien.

Posteriormente, agregue un medio de células endoteliales sin factor de crecimiento al inserto e incube.

La ausencia de factores de crecimiento inhibe la división celular, preservando los contactos de célula a célula y estabilizando las propiedades de barrera.

Las células endoteliales y los astrocitos interactúan para formar una membrana basal con uniones estrechas como la BBB.

A continuación, siembre los esferoides de glioma en un nuevo pozo de cultivo.

Transfiera el modelo BBB sobre estos esferoides e incube para formar la barrera hematoencefálica o modelo BBTB.

Agregue moléculas diana al modelo BBTB para evaluar su entrega al sitio del tumor.

Bajo una campana de cultivo celular estéril, lave cuidadosamente los astrocitos cultivados con 5 mililitros de PBS estéril. Use una bomba de vacío para desechar suavemente el PBS y agregue 2 mililitros de reactivo de disociación celular durante 5 minutos para separar las células.

Luego, agregue 10 mililitros de medio de cultivo celular de astrocitos completo estéril al vaso para inhibir la actividad del reactivo de disociación celular. Utilice una pipeta serológica estéril para transferir las células desprendidas del recipiente a un tubo estéril de 15 mililitros.

Centrifugar a 250 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, coloque los insertos. Use fórceps estériles para colocar los insertos con el cerebro hacia arriba en la tapa de una placa estéril de 6 pocillos.

Cuando se complete la centrifugación, deseche con cuidado el sobrenadante de la suspensión celular y vuelva a suspender el sedimento de astrocitos en 1 mililitro de ABM plus pipeteando suavemente el sedimento en la pared de los tubos hasta cinco veces.

Luego, cuente las células y ajuste la densidad de suspensión celular a 150,000 células en 400 microlitros de ABM más por inserto. Coloque esta suspensión celular en el centro del lado del cerebro de la membrana del inserto y extiéndala con cuidado usando la fuerza capilar con una punta de pipeta estéril.

Con el lado del cerebro de los insertos aún hacia arriba, vuelva a colocar la placa de 6 pocillos en los insertos. Coloque la placa y los insertos con el cerebro hacia arriba en una incubadora a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono para permitir la adhesión celular.

Después de esto, vuelva a colocar la placa de 6 pocillos en su posición normal con los insertos ahora con la sangre hacia arriba. Agregue medio y continúe la incubación como se describe en el protocolo de texto. Bajo una campana de cultivo celular estéril, lave cuidadosamente las células endoteliales cultivadas con 5 mililitros de PBS estéril.

Use una bomba de vacío para desechar suavemente el PBS y agregue 2 mililitros de reactivo de disociación celular durante 5 minutos para separar las células. Luego, agregue 10 mililitros de medio de cultivo de células endoteliales completas estériles al vaso para inhibir la actividad del reactivo de disociación celular.

Utilice una pipeta serológica estéril para transferir las células desprendidas del vaso a un tubo estéril de 15 mililitros. Centrifugar a 250 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento de células endoteliales en 1 mililitro de EBM plus pipeteando lentamente la suspensión celular en la pared del tubo hasta cinco veces.

Cuente las células y ajuste la densidad de la suspensión celular a 200.000 células en 2,5 mililitros de cultivo de células endoteliales, desprovisto de suero y factor de crecimiento endotelial vascular-A por inserto. Recupere la placa que contiene los insertos.

Deseche con cuidado el medio del lado de la sangre y reemplácelo con los 2,5 mililitros de suspensión de células endoteliales. Luego, regrese la placa a la incubadora y déjela toda la noche para permitir que las células endoteliales se adhieran a la membrana.

Al día siguiente, prepare una placa de 6 pocillos transfiriendo 3 mililitros de ABM precalentado menos a cada pocillo. Con unas pinzas estériles, manipule los insertos para desechar con cuidado el medio endotelial completo del lado de la sangre y coloque el inserto en la nueva placa que contiene ABM menos. Luego, agregue 2.5 mililitros de EBM menos.

Deje los insertos en la incubadora con una mínima alteración física o variación de temperatura durante 5 días. El día de la transferencia, reemplace el medio. Para obtener imágenes de inmunofluorescencia, coloque hasta cuatro cubreobjetos redondos de borosilicato estériles en cada pocillo de una placa de 6 pocillos, que contengan 2 mililitros de poli-D-lisina. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Mientras tanto, use una pipeta serológica estéril para transferir cuidadosamente las esferas tumorales del recipiente de cultivo celular a un tubo estéril de 15 mililitros. Centrifugar las esferas tumorales a 250 x g durante 3 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente las esferas en 1 mililitro de GBM menos.

Cuente las celdas y ajuste la densidad celular a aproximadamente 10,000 esferas o 100,000 celdas por mililitro de GBM menos. A continuación, deseche la poli-D-lisina de los pocillos y enjuague los pocillos tres veces con PBS estéril. Siembre cada pocillo de la placa con 3 mililitros de la suspensión esferoide tumoral y transfiera los insertos con el imitador BBTB a la suspensión de células tumorales.

Incube durante la noche a 37 grados Celsius con dióxido de carbono al 5% para permitir que los sitios de tumores sanguíneos y cerebrales del ensayo se equilibren. Al día siguiente, reemplace el medio en el lado de la sangre con EBM menos complementado con las moléculas, medicamentos o nanopartículas de interés.

• BBTB (Blood-Brain Tumor Barrier) - A barrier in the central nervous system that prevents blood-borne substances from reaching brain tumors.
• Sterile Cell Culture Hood - Ensures sterile conditions during lab procedures.
• Astrocytes - Star-shaped glial cells in the brain, part of the BBTB.
• Endothelial Cells - Line the interior of blood vessels, involved in forming the BBTB.
• Cell Dissociation Reagent - Used to break down cellular bonds to isolate individual cells.

• Introduce BBTB - The brain-specific barrier that protects from substances in the blood (e.g., BBTB)
• Key Concepts – Summarize procedures for astrocyte and endothelial cell culture (e.g., sterile cell hood).
• Underlying Mechanisms – Describe cell harvesting and resuspension (e.g., cell dissociation reagent).
• Connect to Experiment – Understand the role of BBTB in brain cancer research.

• What does BBTB stand for and how does it contribute to brain tumor research?
• Why are sterile conditions essential in cell culture procedures?
• What role do Astrocytes and Endothelial cells play in forming the BBTB?

• Practical Applications – BBTB studies have implications in brain cancer research (e.g., BBTB).
• Industry Impact – Influences medical and pharmaceutical industries (e.g., drug design).
• Societal Importance – Improves understanding for better treatments (e.g., brain cancer).
• Link to Scientific Advancements – Complexity of BBTB has advanced cell culture technology.