Name: Análisis de linfocitos extravasación El uso de una In Vitro Modelo de la barrera sangre-cerebro humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprende a analizar la extravasación de linfocitos mediante un modelo in vitro de la barrera hematoencefálica humana. Este método permite estudiar poblaciones raras de linfocitos a nivel de célula única y evaluar la integridad de la barrera mediante análisis de permeabilidad con azul de Evans.

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Este estudio ha sido apoyado por el Centro de Investigación Colaborativa CRC TR128 "Iniciador/Efector versus Mecanismos Reguladores en la Esclerosis Múltiple-Progreso hacia el Abordaje de la Enfermedad" (Proyecto A9 a H.W. y C.C.G., proyecto B1 a N.S.).

1. Cultivo celular de cerebro humano Las células endoteliales microvasculares (HBMEC) <ol><li> Recubrimiento de matraces de cultivo celular <ol><li> Para preparar la solución de fibronectina, añadir 10 ml de PBS a un tubo de centrífuga de 15 ml. Añadir 150! L fibronectina y mezclar bien. </li><li> Para cubrir la parte inferior de un frasco de cultivo de células T-25 Añadir 2 ml de la solución de fibronectina. Incubar el matraz de cultivo de células durante al menos 3 h a 37 ° C en la incubadora. Matraces recubiertos de fibronectina se pueden almacenar durante 2 semanas a 37 ° C / 5% de CO2. </li></ol></li><li> La siembra y cultivo de células de HBMEC <ol><li> solución de fibronectina Aspirar desde el fondo del matraz de cultivo celular. Añadir 7,2 x 10 4 HBMEC / cm² en suspensión en 6 ml ECM-b medio (= ECM-b suplementado con 5% de suero bovino fetal, 1% de penicilina / estreptomicina y 1% de suplemento de crecimiento endotelial celular). Incubar a 37 ° C / 5% de CO2. Compruebe el crecimiento celular diariamente utilizando un microscopio. </li><li> Cambiar el medio cada 3 días.Recoger o de células de división, cuando HBMEC alcanzan aproximadamente 80% de confluencia. HBMEC se debe utilizar entre el paso 1 y 15 para evitar la pérdida de propiedades fisiológicas. </li></ol></li><li> Cosecha HBMEC. <ol><li> Preparar Accutase solución mezclando Accutase (1x) con PBS en una proporción de 1: 1. Mantenga Accutase solución a 37 ° C en un baño de agua hasta su uso posterior. </li><li> Transferencia ECM-b medio del matraz de cultivo celular a un tubo de centrífuga de 15 ml. Lavar HBMEC mediante la adición de 5 ml de PBS a la parte inferior del frasco de cultivo celular. Aspirar PBS y repetir la etapa de lavado dos veces más. </li><li> Añadir 2 ml de solución pre-calentado Accutase. Incubar a 37 ° C durante 2 min. Después, HBMEC se resuspenden tocando firmemente el matraz de cultivo de células varias veces. desprendimiento de células se controla mediante un microscopio </li><li> El ECM-b-medio almacenado previamente en un tubo de 15 ml se añadió de nuevo al matraz de cultivo celular tan pronto como se inicia HBMEC a separar. Enjuague el fondo del matraz varias veces hasta que la mayoría son HBMECre-suspendido. </li><li> Transferir la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante y las células en 1 ml ECM-b medio resuspender. Recuento de células y diluir la suspensión de células para alcanzar una concentración final de 3 x 10 5 HBMEC por ml ECM-b medio. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de la Célula de Cultura Inserts <ol><li> Recubrimiento de insertos de cultivo celular Nota importante: Evitar tocar la membrana de los insertos de cultivo celular. <ol><li> Añadir 100! L solución de fibronectina (véase 1.1.1) para cada inserto de cultivo celular (Figura 1A) y un pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo plano (control óptico también). Incubar durante al menos 3 h a 37 ° C. Después de solución de incubación aspirado de fibronectina. </li><li> Añadir 100 ml HBMEC suspensión a los insertos de cultivo celular y el control óptico también. Añadir 600 l ECM-b medio para el compartimiento inferior de la célulainsertos de cultivo. Incubar durante 3 - 4 días a 37 ° C / 5% de CO 2 hasta integridad de la barrera (Figura 1B) se alcanza, comprobar el crecimiento celular por evaluación microscópica de la HBMEC en el control óptico también. Nota: No se recomienda el crecimiento celular más allá de cuatro días. </li><li> Opcional: Para imitar las condiciones inflamatorias Aspirar el medio desde el compartimiento inferior y reemplazarlo con ECM-b medio suplementado con 500 U / ml de IFN-γ / TNF-α 24 h antes el ensayo de migración. </li></ol></li></ol> 3. Control de Calidad con azul de Evans en el Día del ensayo de transmigración <ol><li> Preparación de solución de azul de Evans <ol><li> Para preparar PBS / B27 mezcla de solución 10 ml de PBS con 200 l suplemento B27 usando un tubo de centrífuga de 15 ml. Diluir la solución madre de azul de Evans (20 mg / ml PBS) 1: 1000 con PBS / B27. </li></ol></li><li> ensayo de permeabilidad azul de Evans <ol><li> Aspirar el medio desde el compartimiento inferior seguido por el compartimiento superiorde un inserto de cultivo celular que contiene un confluente HBMEC monocapa. Añadir 100! L de solución de azul de Evans al inserto de cultivo celular. </li><li> Añadir 600! L de PBS / B27 para el compartimiento inferior y se incuba durante 60 min a 37 ° C / 5% de CO2. Retire cuidadosamente la inserción de cultivo celular utilizando fórceps. </li></ol></li><li> medición de azul de Evans <ol><li> Retirar PBS / B27 desde el compartimiento inferior y transferir 100! L cada uno a dos pocillos de una poliestirol negro placa de 96 pocillos de fondo plano. Inserte la placa en un lector de placa Tecan Pro Infinito M200 y determinar z-posición óptima. </li><li> Medida de excitación de azul usando ajustes respectivos Evans (por ejemplo: excitación: 620 nm, emisión: 680 nm, ancho de banda de excitación: 9 nm, ancho de banda de emisión: 20 nm, la mejora 175x, 25 parpadea, el tiempo de integración: 20 mu s). </li><li> Para determinar las funciones de barrera HBMEC comparar datos adquiridos con una curva patrón que representa evans permeación azul a través HBMEC en diferentes puntos de tiempo después de semillacélulas ING (Figura 1B, derecha). </li></ol></li></ol> 4. Ensayo de migración <ol><li> Preparación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). <ol><li> Añadir 10 ml de RPMI en un tubo de centrífuga de 15 ml y añadir 200 l suplemento B27. Recuento de células PBMC y centrifugar a 300 xg durante 5 min. Vuelva a suspender PBMC a una concentración final de 5 x 10 6 células / ml RPMI / B27. </li></ol></li><li> Puesta en marcha del ensayo de migración <ol><li> Medio Aspirar desde el compartimiento inferior seguido por el compartimiento superior de los insertos de cultivo de células que contienen confluente HBMEC monocapas (Figura 1A). Por donante añadir 100 l PBMC suspensión cada uno para los insertos de cultivo celular y también a un pocillo de una placa de 24 pocillos por (control in vitro). </li><li> Añadir 600! L RPMI / B27 para el compartimiento inferior de los insertos de cultivo celular y 500 l a la PBMC del control in vitro y se incuba 6 horas a 37 ° C / 5% de CO2. </li&gt; </ol></li><li> La recolección de migrada PBMC <ol><li> Extraer el inserto de cultivo celular utilizando fórceps y enjuagar cuidadosamente la parte inferior con 400 l de PBS sin tocar la membrana. Desechar el inserto de cultivo celular. </li><li> Añadir 20 l fluoroesferas de recuento de flujo (aproximadamente 1.000 cuentas / ml) al compartimento inferior del cultivo celular insertan así como para el control in vitro y se mezclan bien. Transferir 1 ml de resultante suspensión de PBMC a la citometría de flujo tubos. </li></ol></li></ol> 5. Citometría de Flujo <ol><li> preparación de la muestra <ol><li> Centrifugar PBMC a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Preparar la solución de anticuerpo mediante la adición de anticuerpos conjugados con fluorocromo a 100! L de tampón citometría de flujo (/ EDTA mM PBS / 1% BSA 2) por muestra. Para los resultados presentados a continuación 1 l CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 l CD56-PC7, 1 l CD8-A700, y 1 l CD16-A750 se utilizaron por muestra. </li><li> Resuspender PBMC en 100 l de la solución de anticuerpo y se incuba durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Añadir 250! L de tampón de citometría de flujo y se centrifuga a 300 xg durante 5 min. </li></ol></li><li> la adquisición de muestras <ol><li> Vuelva a suspender PBMC en la cantidad requerida (varía dependiendo de la citómetro de flujo utilizado) de citometría de flujo de tampón. </li><li> Adquirir manchado PBMC usando un citómetro de flujo con un detector activo entre 525 y 700 nm de longitud de onda para detectar fluoroesferas de recuento de flujo (excitación 488 nm, emisión de 525 - 700 nm). (Los pasos siguientes son un ejemplo si se usa un flujo Gallios citómetro operado con software Kaluza G:. (1) Iniciar el equipo (2) Cuando el sistema operativo se ha cargado completamente, inicie el citómetro de flujo pulsando la tecla &quot;citómetro en&quot; botón . (3) Cargar el protocolo de adquisición respectiva pulsando el botón &quot;protocolo abierto&quot;. (4) seleccione el protocolo requerido y seleccione &quot;abrir&quot;. (5) Duplicar el protocolo para cada muestra haciendo clic con el derechobotón del ratón sobre el protocolo visible en el carrusel virtual y un clic izquierdo en el campo &quot;duplicado&quot;. (6) Etiqueta de cada muestra en la lista de muestras. (7) Transferir las muestras a las posiciones indicadas del carrusel y comenzar la adquisición.) </li></ol></li><li> análisis de las muestras <ol><li> Abrir flujo resultante citometría de datos utilizando el software respectivo. Determinar el número de subpoblaciones de interés para transmigrado PBMC así como las células de los pocillos de control in vitro y fluoroesferas de recuento de flujo usando el software de análisis respectiva. (Un ejemplo de la estrategia de gating se da en la parte resultados (Figura 1 C: Para analizar la transmigración de los subconjuntos de células NK, primero seleccionar linfocitos en un canal de dispersión lateral (SSC) frente hacia adelante canal de dispersión parcela (FSC) Los linfocitos son. a continuación, muestran en una CD3 frente trama CD56 y CD56 + CD3 -. se seleccionan las células NK Para distinguir entre subconjuntos de células NK, las células NK se muestran enuna parcela CD56 frente a CD16 y CD56 CD16 brillante dim / - las células NK, así como CD56 dim CD16 + se seleccionan. Además, fluoroesferas de recuento de flujo se seleccionan de una parcela FSC frente a SSC y, posteriormente, se muestra en una parcela de un canal con una emisión entre 525 y 700 nm frente al tiempo para determinar su número). </li><li> Para calcular el número total de células de cada muestra, normalizar el número detectado de las células usando fluoroesferas de recuento de flujo: <img alt="Ecuación" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li> Determinar el porcentaje de células migradas como la relación entre el total de células migradas y las células totales en el control in vitro. </li></ol></li></ol>

El autor o autores declararon los siguientes posibles conflictos de intereses con respecto a la investigación, autoría y/o publicación de este artículo: A.S.-M. y U.B. no tienen divulgaciones financieras. T. S.-H. recibió gastos de viaje y conferencias de Biogen. N.S. recibió honorarios de oradores y consejos asesores de Biogen y Novartis Pharma, así como gastos de viaje de Biogen. H.W. recibió una compensación por formar parte de los Consejos Asesores Científicos/Comités Directivos de Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis y Sanofi-Genzyme. También recibió honorarios de orador y apoyo de viaje de Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis y Sanofi-Genzyme. Recibió una compensación como consultor de Biogen, Merck Serono, Novartis y Sanofi-Genzyme. H.W. recibió apoyo para la investigación de Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Alemania y Sanofi US. C.C.G. recibió honorarios de orador y gastos de viaje por asistir a reuniones de Genzyme, Novartis Pharma GmbH y Bayer Health Care.

Aquí presentamos una técnica para investigar la transmigración de los linfocitos a través de la barrera sangre-cerebro humano. El análisis in vitro de la migración de linfocitos al SNC es importante para estudiar los procesos básicos de la extravasación de linfocitos, posibles alteraciones relacionadas con la enfermedad, y los nuevos enfoques terapéuticos. Varias modificaciones del modelo de barrera hematoencefálica son posibles. Por ejemplo, las células del compartimiento ...

la migración de linfocitos de la sangre a los tejidos es crucial para la vigilancia inmune. Una secuencia de interacciones moleculares específicas asegura sitio extravasación específico en el intestino delgado, piel, ganglios linfáticos, el sistema nervioso central (SNC), y otros tejidos 1. Las alteraciones en la migración de linfocitos están implicados en la fisiopatología de una serie de enfermedades de amplia difusión 2. Migración en la inmuno-privilegiado CNS está estrechamente regulada y, en consecuencia alteraciones de este proceso están involucrados en las enfermedades relacionadas con el SNC como la encefalomielitis 3, neuromielitis óptica, derrame cerebral y la esclerosis múltiple (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Por lo tanto, es importante estudiar la extravasación de linfocitos para entender mejor la fisiopatología de la enfermedad y el desarrollo de herramientas para una<html> mejoramiento del terreno de carga 8, 9, 10, 11, 12 enfermedad. Los linfocitos migran al SNC a través de rutas distintas. La extravasación a través de las vénulas postcapilares en el espacio subaracnoideo a través de la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo dentro del plexo coroideo y través de la barrera sangre-cerebro se han descrito 1, 13, 14, 15. La migración a través de la barrera sangre-cerebro se lleva a cabo por la interacción de los linfocitos con las células endoteliales 14. En contraste a las células endoteliales en la periferia, las células endoteliales de la CNS expresan altas cantidades de moléculas de unión estrecha, con lo estrictamente limitando la cantidad de células y proteínas capaces de cruzar la barrera sangre-cerebrolass = &quot;xref&quot;&gt; 16. resultados inflamación en el aflojamiento de las uniones estrechas e induce la expresión de moléculas de adhesión; por lo tanto, la mejora de la migración de linfocitos en el SNC 1, 17, 18. La extravasación a través de la barrera sangre-cerebro es un proceso de múltiples pasos. Linfocitos de sujeción para las células endoteliales y luego rodar a lo largo del endotelio en un proceso mediado principalmente por las selectinas 1, 15. Posteriormente, las interacciones entre las quimiocinas secretadas por el endotelio y los respectivos receptores de quimioquinas expresados en los linfocitos inducen cambios conformacionales de las integrinas, promoviendo así la adhesión firme a las células endoteliales 1. Finalmente, los linfocitos o bien arrastre a lo largo de la barrera endotelial contra el flujo de sangre antes de transmigrando en el espacio perivascular, o detener inmediatamente y directamente transmigrate en el sitio de la firma de la adhesión 1, 19, 20. Todos estos pasos de extravasación de linfocitos pueden ser analizados in vitro usando técnicas distintas 21. Time-lapse microscopía de vídeo se utiliza para estudiar la inmovilización inicial y 15 de rodamiento. Ensayos de adhesión proporcionan información detallada acerca de la detención firme endoteliales barreras 22. Ensayos de transmigración como se demuestra aquí permiten el análisis de la transmigración de células inmune 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29. Uso de la humana en sangre modelo in vitro de barrera cerebro, recientemente hemos podido demostrar que un Migr mayorcapacidad Atory de CD56 CD16 brillante dim / - células NK en comparación con su CD56 dim CD16 + homólogos se reflejó por un predominio de este subconjunto de células NK en el compartimento intratecal 21. Por lo tanto, nuestra configuración experimental parece ser adecuado para imitar la situación in vivo.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>sin CaCl2 o MgCl2</td></tr><tr><td>Fibronectina 1 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>de plasma bovino</td></tr><tr><td>Matraz de cultivo celular T-25</td><td>Greiner BioOne</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>HBMEC</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pelobiotech</td><td>PB-H-6023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ECM-b</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FBS ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de crecimiento de células endoteliales</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>transparente, 6,5 mm de diámetro, 3,0 & micro; m tamaño de poro</td></tr><tr><td>placa de fondo plano de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Evans azul</td><td>Sigma</td><td>E2129-10G</td><td>solución madre: 1 g/50 mL PBS</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50x concentrado</td></tr><tr><td>Infinite M200Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-pocillos negro placa de fondo plano</td><td>Greiner BioOne</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>48 pocillos</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Fluorosferas de conteo de flujo</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547053</td><td></td></tr><tr><td>Na-EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Gallios Citómetro de flujo de 10 colores</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaluza 1.5a</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-y alfa;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>IFN-y gamma;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300430</td><td>clon UCHT1</td></tr><tr><td>CD56-PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21692</td><td>clon N901</td></tr><tr><td>CD16-A750</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66330</td><td>clon 3G8</td></tr><tr><td>CD4-FITC</td><td>Biolegend</td><td>300506</td><td>clon RPA-T4</td></tr><tr><td>CD8-A700</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66332</td><td>clon B9.11</td></tr></tbody></table>

análisis de linfocitos extravasación el uso de una<em&gt; in vitro</em&gt; modelo de la barrera sangre-cerebro humano

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

extravasación de linfocitos en el sistema nervioso central (SNC) es fundamental para la vigilancia inmune. alteraciones relacionadas con la enfermedad de extravasación de linfocitos podrían dar lugar a cambios fisiopatológicos en el SNC. Por lo tanto, la investigación de la migración de linfocitos en el SNC es importante entender las enfermedades inflamatorias del sistema nervioso central y para desarrollar nuevos enfoques de terapia. Aquí presentamos un modelo in vitro de la barrera sangre-cerebro humano para estudiar la extravasación de linfocitos. células endoteliales microvasculares del cerebro humano (HBMEC) se cultivan confluently en un tereftalato de polietileno poroso transwell insertar para imitar el endotelio de la barrera sangre-cerebro. La función de barrera es validado por zonula occludens inmunohistoquímica, la resistencia eléctrica transendotelial (TEER) mediciones así como el análisis de evans permeación azul. Este modelo permite la investigación de la diapedesis de los subgrupos de linfocitos raros tales como CD56 CD16 brillante dim / - las células NK. Ademmineral, los efectos de otras células, citocinas y quimiocinas, alteraciones relacionadas con la enfermedad, y regímenes de tratamiento distintos sobre la capacidad migratoria de los linfocitos puede ser estudiado. Por último, el impacto de los estímulos inflamatorios, así como diferentes regímenes de tratamiento en la barrera endotelial pueden ser analizados.

Se muestran los resultados representativos que muestran transmigración de las células NK y subconjuntos de células T utilizando el hematoencefálica modelo de barrera humana (Figura 1A). La integridad de la monocapa HBMEC fue validado por tinción de la molécula de unión estrecha mediciones de resistencia eléctrica transendotelial (TEER) ZO-1, y evans permeación azul (Figura 1B). Después de 3 - 4 días de cultivo HBMEC expresa la molécula de unión estrecha ...

Aquí, describimos un modelo de barrera hematoencefálica humana que permite investigar in vitro la transmigración de linfocitos al sistema nervioso central.

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro humano

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

El objetivo general de este ensayo de transmigración es investigar la extravasación de linfocitos hacia el sistema nervioso central in vitro. Este método puede contribuir a profundizar el entendimiento de las enfermedades inflamatorias del sistema nervioso central y al desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos. Algunas ventajas de esta técnica son su fácil acceso y la posibilidad de analizar poblaciones raras de linfocitos a nivel de célula individual.Este método puede proporcionar información sobre la transmigración de linfocitos a través de la barrera hematoencefálica y puede aplicarse al estudio de la transmigración a través de la barrera hematoencefálica-líquido cefalorraquídeo. Además, se puede realizar un análisis de permeación con azul de Evans para evaluar la integridad del modelo de barrera hematoencefálica. Comience cubriendo la base de un frasco de cultivo celular T-25 con dos mililitros de solución recién preparada de fibronectina durante una incubación de al menos tres horas en un incubador de cultivo celular a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.Al final de la incubación, sustituya la solución de fibronectina por 7,2 veces 10 a la cuarta células endoteliales microvasculares humanas del cerebro, o HBMEC, en seis mililitros de medio ECM-b completo, y regrese el frasco al incubador. Cuando las HBMEC alcancen una confluencia del 80 %, transfiera el sobrenadante a un tubo cónico de 15 mililitros y lave las células adherentes tres veces con cinco mililitros de PBS. Después del tercer lavado, agregue dos mililitros de solución de Accutase precalentada a las células durante dos minutos a 37 grados Celsius.Luego, golpee firmemente el matraz varias veces, confirmando la disociación celular mediante microscopía de luz. Cuando las células comiencen a desprenderse del fondo del matraz, use el sobrenadante recolectado para enjuagar el matraz repetidamente hasta que la mayoría de las HBMEC queden resuspendidas. A continuación, transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros para centrifugación, y resuspenda el sedimento en un mililitro de medio ECM-b fresco para el recuento.Para preparar los insertos de cultivo celular para un ensayo de transmigración, primero agregue 100 microlitros de solución de fibronectina a cada inserto y a un pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos. Después de tres horas a 37 grados Celsius, reemplace la solución de fibronectina con 100 microlitros de HBMEC y agregue 600 microlitros de medio ECM-b fresco a los compartimentos inferiores de los insertos de cultivo celular. Luego, devuelva las placas al incubador de cultivo celular durante tres a cuatro días.Para comprobar si se ha alcanzado la integridad de la barrera, aspire el medio de los compartimentos inferior y superior de un inserto de cultivo celular y agregue 100 microlitros de solución recién preparada de azul de Evans al inserto. Añada 600 microlitros de PBS suplementado con B27 al compartimento inferior y devuelva la placa al incubador. Después de una hora, use pinzas para retirar cuidadosamente el inserto y transfiera 100 microlitros de PBS con B27 del compartimento inferior a dos pocillos individuales de una placa negra de fondo plano de 96 pocillos hecha de poliestireno.Luego, cargue la placa en un lector multi-modo de microplacas y determine la posición z óptima. Para determinar la función de barrera de las HBMEC, mida la excitación de la solución de azul de Evans utilizando los ajustes apropiados y compare los datos obtenidos con una curva estándar que represente la permeación del azul de Evans a través de las HBMEC en diferentes puntos de tiempo tras la siembra. Tras confirmar la formación de la monocapa celular, re suspenda la muestra de células mononucleares de sangre periférica, o PBMC, hasta una concentración de cinco veces 10 a la sexta células por mililitro en medio RPMI suplementado con B27.A continuación, aspire el medio de los compartimentos inferior y superior del número adecuado de insertos para cultivo celular que contengan monocapas de HBMEC confluentes, y añada 100 microlitros de PBMC por donante a los insertos para cultivo celular y a un pocillo de una placa de 24 pocillos por cada control in vitro. Añada 600 microlitros de RPMI más B27 a los compartimentos inferiores de los insertos para cultivo celular y 500 microlitros a los pocillos de control in vitro, y devuelva las placas al incubador de cultivo celular durante seis horas. Al final de la incubación, use pinzas para retirar los insertos para cultivo celular, enjuagando cuidadosamente los fondos con 400 microlitros de PBS sin tocar las membranas.Luego, mezcle completamente 20 microlitros de Flow-Count Fluorospheres con las células en los pocillos experimentales y de control in vitro, y transfiera un mililitro de las suspensiones resultantes de PBMC a los tubos de citometría de flujo correspondientes. Recupere las células por centrifugación, y añada los anticuerpos marcados con fluorocromo de interés en 100 microlitros de tampón para citometría de flujo a cada muestra. Tras 30 minutos a cuatro grados Celsius, lave las células con 250 microlitros de tampón fresco para citometría de flujo, y resuspenda los sedimentos en el volumen adecuado de tampón para citometría de flujo para su análisis.Una vez que se hayan adquiridos todos los datos, abra el software de análisis de citometría de flujo adecuado. Para analizar la transmigración del subpoblación de células NK, primero seleccione los linfocitos en un gráfico de dispersión lateral versus dispersión directa, y muestre las células en un gráfico de puntos de CD3 versus CD56. Luego, seleccione las células NK positivas para CD56 y negativas para CD3.Para distinguir entre los subconjuntos de células NK transmigradas, muestre las células en un gráfico de CD56 frente a CD16 y seleccione las células CD56bright, CD16dim o negativas, y las células CD56dim, CD16-positivas. Luego, seleccione las Fluoresferas Flow-Count en un gráfico de dispersión directa frente a dispersión lateral. Para determinar el número de microesferas, muestre los datos seleccionados en un gráfico de un canal que cubra una longitud de onda de emisión entre 525 y 700 nanómetros frente al tiempo.Finalmente, determine el porcentaje de células NK migradas como la relación entre el número total de células migradas y el número total de células en el control in vitro. Tras tres o cuatro días de cultivo, las HBMEC expresaron la molécula de unión estrecha Zonula occludens-1 y crecieron en monocapas que exhiben resistencia eléctrica transendotelial y reducida permeación del colorante azul de Evans. La estimulación de la monocapa de células endoteliales con interferón gamma y TNF alfa durante 24 horas antes de un ensayo de transmigración de PBMC completos resulta en un aumento de la migración de todas las poblaciones de linfocitos analizadas.Curiosamente, las células NK CD56bright, CD16dim o negativas exhiben una mayor capacidad migratoria que las células NK CD56dim, CD16-positivas a través de monocapas de HBMEC tanto sin estimular como activadas por citoquinas. Aunque el aumento relativo de la transmigración a través de una monocapa celular inflamada es mayor en general para las células CD56dim, esto imita las observaciones in vivo de que las células NK CD56bright, CD16dim-negativas se enriquecen en el compartimento intratecal. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en menos de 10 horas.El pretratamiento del sistema de transmigración in vitro con interferón gamma y TNF alfa permite el estudio de la migración de linfocitos bajo condiciones inflamatorias. Nuestro protocolo puede modificarse aplicando fuerzas de cizalladura o mediante cultivo conjunto con otras células de la barrera hematoencefálica, como los astrocitos, para obtener un modelo más refinado de la transmigración de linfocitos hacia el sistema nervioso central. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo investigar la transmigración de linfocitos utilizando un modelo in vitro de la barrera hematoencefálica humana.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra una investigación experimental de la transmigración de linfocitos a través de un modelo de endotelio de barrera hematoencefálica (BBB). Se genera una monocapa de células endoteliales microvasculares del cerebro humano (HBMEC) in vitro, y se añaden a la monocapa células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que contienen linfocitos. A continuación, las células se incuban para permitir la transmigración de los linfocitos, y las células migradas se cuantifican mediante...

Estudio de la transmigración de linfocitos a través de una monocapa de células endoteliales microvasculares

Establecimiento de modelos humanos de la barrera sangre-cerebro (BBB) ​​puede beneficiar a la investigación de las condiciones del cerebro asociadas con la acreditación fracaso. Se describe aquí una técnica mejorada para la preparación de un modelo de acreditación de contacto, que permite que el cocultivo de astrocitos humanos y las células endoteliales del cerebro en los lados opuestos de una membrana porosa.

Método mejorado para la preparación de una base de células, Contacto Modelo Humano de la barrera hematoencefálica

Aquí, describimos un modelo murino in vitro de la barrera hematoencefálica que hace uso de la espectroscopia de células de impedancia, con un enfoque en las consecuencias sobre la integridad y permeabilidad de las células endoteliales al interactuar con las células T activadas.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro mediante Espectroscopia de Impedancia: Un enfoque en la interacción de células T de la célula endotelial

Aquí, demostramos los métodos de cuantificación en vivo de la salida de leucocitos de ingenuo, inflamado y mala piel murina. Realizamos una comparación directa de dos modelos: photoconversion de aplicación y en situ FITC transdérmica. Además, demostramos la utilidad de photoconversion para el seguimiento de salida de leucocitos de tumores cutáneos.

Cuantificación de leucocitos salida vía los recipientes linfáticos de la piel murina y tumores

Presentamos un ensayo de fluorescencia para demostrar que Lucifer Yellow (LY) es un marcador robusto para determinar la aparente permeabilidad paracelular de las monocapas celulares hCMEC/D3, un modelo in vitro de la barrera hematoencefálica humana. Usamos este ensayo para determinar la cinética de una formación monocapa confluente en células hCMEC/D3 cultivadas.

Lucifer Yellow - Un marcador de permeabilidad paracelular robusto en un modelo celular de la barrera hematoencefálica humana

Aquí, presentamos los protocolos para investigar el deterioro de la unidad neurovascular durante la encefalomielitis autoinmune experimental en vivo. Específicamente abordamos cómo determinar permeabilidad de la barrera blood - brain y gelatinasa actividad involucrada en la migración de leucocitos a través de la glía INCURVATA4.

Visualizar el deterioro de las barreras endoteliales y Glial de la unidad Neurovascular durante la encefalomielitis Autoinmune Experimental In Vivo

En este protocolo, los linfocitos se colocan en la cámara superior de un sistema de transmigración, separados de la cámara inferior por una membrana porosa. La quimiocina se añade a la cámara inferior, lo que induce la migración activa a lo largo de un gradiente de quimiocina. Después de 48 h, los linfocitos se cuentan en ambas cámaras para cuantificar la transmigración.

Evaluación de la migración de linfocitos en un sistema de transmigración ex Vivo

Este manuscrito presenta un protocolo para inducir la encefalomielitis autoinmune experimental activa (EAE) en ratones. También se presenta un método para el aislamiento y caracterización de los linfocitos infiltrados en el sistema nervioso central (SNC) para mostrar cómo los linfocitos participan en el desarrollo de la enfermedad autoinmune del SNC.

Análisis citométrico de flujo de infiltración de linfocitos en el sistema nervioso central durante la encefalomielitis autoinmune experimental

Aquí, describimos un protocolo, el método de cultivo de células endoteliales extendidas (EECM), que permite la diferenciación de células madre pluripotentes a células similares a células endoteliales microvasculares cerebrales (BMEC). Estas células muestran la expresión de la molécula de adhesión de células endoteliales y, por lo tanto, son un modelo de barrera hematoencefálica humano adecuado para estudiar las interacciones de las células inmunes in vitro.

Diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por humanos a células cerebrales similares a células endoteliales microvasculares con un fenotipo inmune maduro

Este informe proporciona protocolos para el ensamblaje, el cultivo celular y los ensayos en la plataforma μSiM para la construcción de modelos de barrera hematoencefálica.

Uso de la plataforma de tejido de barrera MicroSiM (μSiM) para modelar la barrera hematoencefálica

Se desarrolló un método para visualizar la extravasación del tinte debido a la ruptura de la barrera hematoencefálica (BBB) mediante la administración de dos tintes fluorescentes a ratones en diferentes puntos de tiempo. El uso de glicerol como crioprotector facilitó la inmunohistoquímica en la misma muestra.

Evaluación de la ruptura de la barrera hematoencefálica en un modelo de ratón de lesión cerebral traumática leve

Aprende a analizar la extravasación de linfocitos mediante un modelo in vitro de la barrera hematoencefálica humana. Este método permite estudiar poblaciones raras de linfocitos a nivel de célula única y evaluar la integridad de la barrera mediante análisis de permeabilidad con azul de Evans.

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una

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