Análisis de linfocitos extravasación El uso de una In Vitro Modelo de la barrera sangre-cerebro humano

El objetivo general de este ensayo de transmigración es investigar la extravasación de linfocitos en el sistema nervioso central in vitro. Este método puede ayudar a mejorar nuestra comprensión de las enfermedades inflamatorias del sistema nervioso central y al desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos. Algunas ventajas de esta técnica son que es de fácil acceso y que permite el análisis de poblaciones de linfocitos raros a nivel de célula única.

Este método puede proporcionar información sobre la transmigración de linfocitos a través de la barrera hematoencefálica y puede aplicarse al estudio de la transmigración a través de la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo. Además, se puede realizar el análisis de permeación azul de Evans para evaluar la integridad del modelo de barrera hematoencefálica. Comience cubriendo el fondo de un matraz de cultivo celular T-25 con dos mililitros de solución de fibronectina recién preparada para una incubación de al menos tres horas en una incubadora de cultivo celular a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

Al final de la incubación, reemplace la solución de fibronectina con 7,2 veces 10 a la cuarta célula endotelial microvascular del cerebro humano, o HBMEC, en seis mililitros de medio ECM-b completo, y devuelva el matraz a la incubadora. Cuando el HBMEC alcance una confluencia del 80%, transfiera el sobrenadante a un tubo cónico de 15 mililitros y lave las células adherentes tres veces con cinco mililitros de PBS. Después del tercer lavado, agregue dos mililitros de solución Accutase precalentada a las celdas durante dos minutos a 37 grados centígrados.

A continuación, golpee firmemente el matraz varias veces, confirmando el desprendimiento de la célula mediante microscopía óptica. Cuando las células comiencen a levantarse del fondo del matraz, utilice el sobrenadante recolectado para enjuagar el matraz repetidamente hasta que la mayor parte del HBMEC se vuelva a suspender. A continuación, transfiera la suspensión de la célula a un tubo cónico de 15 mililitros para su centrifugación y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio ECM-b fresco para contar.

Para preparar los insertos de cultivo celular para un ensayo de transmigración, primero agregue 100 microlitros de solución de fibronectina a cada inserto y a un pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos. Después de tres horas a 37 grados centígrados, reemplace la solución de fibronectina con 100 microlitros de HBMEC y agregue 600 microlitros de medio ECM-b fresco a los compartimentos inferiores de los insertos de cultivo celular. A continuación, devuelva las placas a la incubadora de cultivos celulares durante tres o cuatro días.

Para comprobar si se ha alcanzado la integridad de la barrera, aspire el medio de los compartimentos inferior y superior de un inserto de cultivo celular y añada 100 microlitros de solución azul de Evans recién preparada al inserto. Agregue 600 microlitros de PBS suplementado con B27 al compartimento inferior y devuelva la placa a la incubadora. Después de una hora, use fórceps para quitar cuidadosamente el inserto y transfiera 100 microlitros de PBS B27 desde el compartimiento inferior a dos pocillos individuales de una placa de fondo plano de poliestireno negro de 96 pocillos.

A continuación, cargue la placa en un lector de microplacas multimodo y determine la posición z óptima. Para determinar la función de barrera de HBMEC, mida la excitación de la solución de tinte azul de Evans utilizando los ajustes apropiados y compare los datos adquiridos con una curva estándar que representa la permeación del azul de Evans a través del HBMEC en diferentes puntos de tiempo después de la siembra. Después de confirmar la formación de la monocapa celular, vuelva a suspender la muestra de la célula mononuclear de sangre periférica, o PBMC, a una concentración de cinco veces 10 a la sexta célula por mililitro en medio RPMI suplementado con B27.

A continuación, aspire el medio de los compartimentos inferior y superior del número adecuado de insertos de cultivo celular que contengan las monocapas de HBMEC confluentes, y agregue 100 microlitros de PBMC por donante a los insertos de cultivo celular y a un pocillo de una placa de 24 pocillos por control in vitro. Agregue 600 microlitros de RPMI más B27 a los compartimentos inferiores de los insertos de cultivo celular y 500 microlitros a los pocillos de control in vitro, y devuelva las placas a la incubadora de cultivo celular durante seis horas. Al final de la incubación, use pinzas para quitar los insertos de cultivo celular, enjuagando cuidadosamente los fondos con 400 microlitros de PBS sin tocar las membranas.

A continuación, mezcle completamente 20 microlitros de fluorosferas de recuento de flujo con las células de los pozos de control experimentales e in vitro, y transfiera un mililitro de las suspensiones de PBMC resultantes a los tubos de citometría de flujo correspondientes adecuados. Recoja las células por centrifugación y agregue los anticuerpos conjugados con fluorocromo de interés en 100 microlitros de tampón de citometría de flujo a cada muestra. Después de 30 minutos a cuatro grados centígrados, lavar las células con 250 microlitros de tampón de citometría de flujo fresco y volver a suspender los gránulos en el volumen adecuado de tampón de citometría de flujo para el análisis.

Cuando se hayan adquirido todos los datos, abra el software de análisis de citometría de flujo adecuado. Para analizar la transmigración del subconjunto de células NK, primero seleccione los linfocitos en un diagrama de canal de dispersión lateral frente a uno de dispersión directa, y muestre las células en un diagrama de puntos CD3 frente a CD56. A continuación, seleccione las células NK CD56 positivas y CD3 negativas.

Para distinguir entre los subconjuntos de células NK transmigradas, muestre las células en una gráfica CD56 frente a CD16 y la puerta para las células CD56bright, CD16dim o negativas, y CD56dim, CD16 positivas. A continuación, seleccione las fluorosferas de recuento de flujo de un diagrama de dispersión frontal frente a lateral. Para determinar el número de perlas, muestre los datos seleccionados en un gráfico de un canal que cubra una longitud de onda de emisión entre 525 y 700 nanómetros en función del tiempo.

Por último, determine el porcentaje de células NK migradas como la relación entre el número total de células migradas y el número total de células en el control in vitro. Después de tres o cuatro días de cultivo, el HBMEC expresó la molécula de unión estrecha Zonula occludens-1 y creció en monocapas que exhiben resistencia eléctrica transendotelial y permeabilidad reducida del colorante azul de Evans. La estimulación de la monocapa de células endoteliales con interferón gamma y TNF alfa durante 24 horas antes de un ensayo de transmigración de PBMC completo da como resultado un aumento de la migración de todas las poblaciones de linfocitos analizadas.

Curiosamente, las células CD56bright, CD16dim o NK negativas exhiben una mayor capacidad migratoria que las células CD56dim, CD16-positivas NK tanto en HBMEC no estimuladas como activadas por citocinas. Aunque el aumento relativo de la transmigración a través de una monocapa de células inflamadas es mayor para las células CD56dim en general, imitando las observaciones in vivo de que las células NK CD56bright, CD16dim-negativas están enriquecidas en el compartimento intratecal. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 10 horas.

El pretratamiento de la configuración de transmigración in vitro con interferón gamma y TNF alfa permite el estudio de la migración de linfocitos en condiciones inflamatorias. Nuestro protocolo puede modificarse mediante la aplicación de fuerzas de cizallamiento o mediante el cocultivo con otras células de la barrera hematoencefálica, como los astrocitos, para proporcionar un modelo refinado para la transmigración de linfocitos al sistema nervioso central. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo investigar la transmigración de linfocitos utilizando un modelo in vitro de la barrera hematoencefálica humana.