Un en Vivo Barrera Blood - brain permeabilidad ensayo en ratones usando fluorescencia etiquetada trazadores

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la permeabilidad de la vasculatura cerebral en ratones utilizando trazadores marcados con fluorescencia para evaluar la disfunción de la barrera hematoencefálica en modelos animales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la barrera hematoencefálica relacionadas con la permeabilidad neurovascular en las enfermedades y su recuperación después de la terapia. La principal ventaja de este método es que es sencillo y cuantitativo.

Ofrece la posibilidad de evaluar la permeabilidad simultáneamente mediante fluorometría, que es cuantitativa, y también microscopía de fluorescencia para defensas regionales. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico y la terapia de varios trastornos neurológicos, incluidos los tumores cerebrales, los accidentes cerebrovasculares y la enfermedad de Alzheimer, ya que estas enfermedades se asocian con un edema cerebral potencialmente mortal y una mejora de la función de la BBD como objetivo terapéutico clave. La señorita Jadranka Macas, oficial de tecnología científica del instituto, demostrará parte del procedimiento.

Inyectar intraperitonealmente a los ratones 100 microlitros de solución trazadora de dos milimolares. Elija trazadores fijables con lisina, como los dextranos marcados con FITC y TMR con espectros de emisión de excitación distintos para una interferencia mínima entre los tintes. Si combina marcadores, inyecte 200 microlitros de solución combinada de trazadores por vía intraperitoneal.

Incluya inyecciones solo en vehículos para que sirvan como controles simulados para la sustracción de fondo de autofluorescencia. Después de cada inyección, espere cinco minutos antes de anestesiar profundamente a los ratones de acuerdo con los protocolos institucionales aprobados. Preparar a los animales para la perfusión cardíaca 10 minutos después de la administración del anestésico.

Compruebe la ausencia de respuesta de contracción de la pata para asegurarse de que el ratón ha alcanzado un plano quirúrgico de anestesia. Coloque el ratón a perfundir boca arriba y aplique etanol al 80% sobre la piel de la zona abdominal. Después de usar unas tijeras pequeñas para crear una incisión de dos centímetros en la pared abdominal, separe el hígado del diafragma y luego corte lentamente a través del diafragma, exponiendo la cavidad plural.

Cortar la caja torácica bilateralmente y fijar el esternón cortado para exponer el ventrículo izquierdo. Inserte una aguja de mariposa de calibre 21 conectada a un sistema de perfusión peristáltica en la parte posterior del ventrículo izquierdo. Perfore la aurícula derecha y luego use una punta de pipeta de un mililitro con el extremo cortado para recolectar rápidamente los 200 a 300 microlitros de sangre liberada y transferirlos a un tubo de recolección de suero.

Guarde la sangre recolectada en hielo. Tan pronto como se recoja la sangre, encienda el sistema de perfusión y perfunda al animal durante tres minutos con PBS libre de iones de calcio y magnesio a temperatura ambiente. Evalúe la calidad de la perfusión observando el color del hígado y los riñones, que parecen pálidos después de la perfusión.

Después de extraer el cerebro, verifique que no haya sangre visible en los vasos de las meninges. La muestra debe excluirse del análisis de permeabilidad si la calidad de la perfusión es mala. Use un bisturí para separar el cerebro en dos hemicerebros.

A continuación, diseccionar el cerebelo y el lóbulo olfativo de un hemicerebro, y transferir el hemicerebro a un tubo de dos mililitros. Coloque un riñón extraído en otro tubo de dos mililitros. Coloque inmediatamente las muestras en hielo seco.

Incruste de forma nativa el riñón y el hemicerebro restantes con el cerebelo y los lóbulos olfativos intactos en el compuesto de temperatura de corte óptima de TissueTech y colóquelo en hielo seco. Por último, después de centrifugar las muestras de sangre a 10.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, transfiera los sobrenadantes de suero a tubos de 1,5 mililitros y colóquelos en el recipiente de hielo seco. Transfiera las muestras al congelador a menos 80 grados Celsius a medida que aumenta la eficiencia de homogeneización después de la congelación y descongelación.

Coloque las muestras de hemiceribro y riñón en hielo para descongelar y luego pese los tubos que contienen los órganos. A partir de estos pesos, reste el valor medio de aproximadamente 20 tubos vacíos para obtener el peso del tejido. Agregue 300 microlitros de PBS frío al tubo que contiene el riñón y 200 microlitros a los tubos que contienen hemicerebrum.

Homogeneice cada muestra en el tubo de microfuga original con un mortero de PTFE conectado a un agitador aéreo eléctrico, utilizando unos 15 golpes. Almacene las muestras homogeneizadas en hielo, protegidas de la luz. Enjuague el mortero con PBS entre muestras y séquelo antes de pasar a la siguiente muestra.

Cuando todas las muestras se hayan homogeneizado, centrifugar durante 20 minutos a 15.000 g y cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, transfiera los sobrenadantes a nuevos tubos de 1,5 mililitros en hielo antes de proceder a la medición y cuantificación de la fluorescencia. Transfiera el sobrenadante a una placa de 384 pocillos e inserte la placa en el lector de fluorescencia.

Asegúrese de que se incluyen las longitudes de onda de excitación y emisión correctas para el trazador y establezca la ganancia en Óptima. Inicie la medición y exporte los datos como una hoja de cálculo para realizar los cálculos como se describe en el protocolo. El día de la tinción, descongele las secciones de criostato de 10 micras montadas en portaobjetos a 37 grados centígrados durante 10 minutos.

A continuación, fije las secciones con un 4% de paraformaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de un lavado rápido en PBS. Permeabilizar y bloquear la unión inespecífica en las secciones incubando en PBS estéril que contenga 1% de PSA y 0,5% de Triton X-100 durante una hora a temperatura ambiente. Después del bloqueo, incube los portaobjetos con una dilución de uno a 100 del anticuerpo primario CD31 durante 1,5 horas a temperatura ambiente.

Después de lavarse con PBS tres veces durante cinco minutos cada una, realice la incubación secundaria de anticuerpos durante una hora a temperatura ambiente con anticuerpos marcados con fluorescencia específicos de la especie. Monte las secciones manchadas con Aqua-Poly/Mount y déjelas toda la noche para la polimerización a temperatura ambiente en la oscuridad. Por último, adquiera imágenes utilizando un sistema de microscopio de escaneo láser confocal de imágenes espectrales.

Con el fin de establecer el tiempo de circulación del trazador para el ensayo de permeabilidad, se compara un tiempo de circulación largo de dos horas con un tiempo de circulación corto de 15 minutos después de la inyección del trazador. El tiempo de circulación más largo de dos horas conduce a una acumulación baja de marcadores en el riñón en comparación con un tiempo de circulación corto de 15 minutos, posiblemente debido a un alto aclaramiento de dextrano FITC que se muestra en verde desde el compartimento vascular. Este efecto es aún más dramático en el cerebro debido a la estrecha barrera hematoencefálica.

La tinción de CD31 observada en el canal rojo confirmó la presencia de vasos en el riñón en ambos puntos examinados y en el cerebro. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco o seis horas para 10 ratones con dos científicos trabajando en conjunto. Al intentar esta técnica, es importante recordar que debe utilizar trazadores de peso molecular correcto, gráfico y características de fluorescencia para responder a las preguntas sobre la permeabilidad de la barrera hematoencefálica.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inmunohistoquímica para la BBD y los factores de relleno de la enfermedad para responder preguntas adicionales, como la gravedad y la localización del sitio de la enfermedad.