Name: Método mejorado para la preparación de una base de células, Contacto Modelo Humano de la barrera hematoencefálica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-12T18:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprenda a preparar un modelo de barrera hematoencefálica humana mediante cocultivo de astrocitos y células endoteliales cerebrales en membrana porosa. Este método optimiza la adherencia celular y permite estudiar la permeabilidad del BBB in vitro.

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Este estudio fue financiado por subvenciones concedidas a RLM de la Salud y medicina Consejo de Investigación Nacional de Australia (subvención # 606658).

1. Cultivos Celulares (3-7 días antes de la acreditación de la Asamblea) 1.1. Primaria células cerebrales humanas endoteliales microvasculares (BEC) BEC se obtuvieron comercialmente. Las células fueron producidas por disociación dispasa de tejido normal corteza cerebral humana y presenten en estado congelado en el paso 3 (&lt;12 duplicaciones de la población). <ol><li> Sustrato: vasos Escudo de cultivo de tejidos con &quot;factor de unión&quot; de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Mantenimiento celular: Mantener BEC en medio completo que contiene suero. Para la experimentación, la cultura BEC en un medio libre de suero completo. Mantener las células en un humidificado 5% de CO 2, 21% de O 2 incubadora a 37 ° C Nota: Como alternativa a los reactivos especializados, 0,1% (w / v) de solución de gelatina puede servir como un reactivo de recubrimiento, mientras que DMEM/F-12 complementado con 15 mM de HEPES, 10% (v / v) de suero de ternera fetal (FCS), 2 mM de L-glutamina, 50 g/ Ml de gentamicina, 20 mg / ml de heparina y 20 mg de suplemento de crecimiento de células endoteliales / ml se pueden utilizar para el mantenimiento de BEC. </li><li> Sub-cultivo para la experimentación: BEC confluentes Split en una proporción de 01:03-01:06, dependiendo de la hora prevista para el próximo uso (3-7 días). Cambie el medio de mantenimiento cada 3 días. Utilice BEC hasta 15 pasajes. </li></ol> 1.2. SVG humano fetal astrogliales Cell-line Células astrogliales SVG humanos fetales 22 se derivaron originalmente de cultivos primarios de cerebro fetal humano transformado con replicación deficiente virus de simio 40. <ol><li> Mantenimiento: células de cultivo de SVG en medio esencial mínimo con solución salina equilibrada de Earle suplementado con 20% (v / v) de FCS (mismo porcentaje de suero utilizada para mantener sus células primarias de los padres 22), 2 mM de L-glutamina, 50 U / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina. Mantener las células en un humidificado 5% de CO 2, 21% de O2 </sub&gt; incubadora a 37 ° C. </li><li> Sub-cultivo para la experimentación: IVS confluentes Split en una proporción de 1:5 a 1:10, dependiendo de la hora prevista para el próximo uso (3-7 días). La eliminación de la tripsina no es necesario debido al alto contenido de suero en el medio. Cambie el medio cada 3 días. Utilice SVGs hasta 20 pasajes. </li></ol> 2. Asamblea y cocultivo del humano in vitro BBB Modelo (día 0) Comentario: El humana in vitro modelo de contacto acreditación se preparó de acuerdo con los protocolos publicados 13,23, con modificaciones. 2.1. Recubrimiento de las inserciones <ol><li> Coloque los insertos de cultivo de tejidos (6,5 mm de diámetro con poliéster membrana porosa, 3 micras de tamaño de poro) en los pocillos de la placa de 24 pocillos se suministra. Cubra la superficie luminal de los insertos <s> </s> durante la noche en un incubador humidificado 37 ° C con colágeno I de rata (20 g / cm 2; 50 l de 132 g/ Ml de colágeno I en ácido acético 0,02% en agua Milli-Q (MQH 2 O)). Lavar los insertos de una vez (tanto desde el lado abluminal y luminal) con MQH 2 O para eliminar el ácido residual. Nota: La membrana basal de los capilares del cerebro no contiene colágeno I, pero principalmente lamininas, isoformas de colágeno tipo IV, nidogens y proteoglicanos heparán sulfato 9. Por esta razón, algunos investigadores utilizan agentes de revestimiento tales como colágeno IV, fibronectina 13, o Matrigel (BD Biosciences) 16 para una más auténtico modelado de la acreditación. </li></ol> 2.2. SVGs Siembra en la parte inferior (Abluminal) superficie de la membrana <ol><li> Invierta la inserción y ajuste suavemente por el borde de la membrana porosa de un pequeño trozo de tubo de silicona elástica (&quot;tubing externa&quot;; ~ 10 mm de largo, 8 mm de diámetro interior y 1,6 mm de pared), básicamente la creación de un nuevo muy por encima de la superficie abluminal (Figura 2A). </li><li> La parte inferior de la Nee insertods a sellar para evitar la fuga de los medios de comunicación. En primer lugar, preparar un enchufe (Figura 2A y 2B) hecha de un tubo de silicona (denominado &quot;tubo interno&quot;; ~ 8 mm de largo, 3,2 mm de diámetro interno, 1,6 mm de pared; Figura 2B), sellado en un extremo con un cono de sellado de plástico (~ 3 mm de largo; preparado por el corte de la parte inferior de una reacción en cadena de 0,2 ml de la polimerasa (PCR) del tubo; Figura 2B). Este cono no sólo sella el lumen de los tubos internos, pero también amplía su borde más apretado para encajar en el inserto. A continuación, utilizando unas pinzas esterilizadas, inserte el tapón de silicona en la cavidad luminal y avanzar hasta que llegue hasta a ~ 1-2 mm de la membrana (Figura 2A). </li><li> A continuación, las semillas 4 x 10 4 células SVG en 200 medio de mantenimiento SVG l (SEcción 1.2.2 anterior) directamente en la silicona muy por encima de la superficie de la membrana abluminal (Figura 2A). Permitir SVGs se adhieran durante al menos 4 horas en la incubadora. Nota: Para mantener la esterilidad transportar los insertos montados entre dos placas de 6 pocillos (una placa invertida sobre la otra; Figura 2C) para reducir al mínimo la exposición al aire sin filtrar durante el procedimiento. Tubos de silicona y tapones se lavan en etanol y en autoclave para su uso posterior. Nota: Utilice tapones (apartado 2.2.2) sólo para plaquitas con poro de la membrana de tamaño mayor que 1 m. Las membranas con poros de diámetro ≤ 1 m rara vez se escapan y sólo requieren la instalación de la tubería de silicona externo (sección 2.2.1). Además, algunos agentes de recubrimiento que no sean de colágeno I (véase la nota a la sección 2.1) pueden impedir leakiness incluso a través de 3 micras poros. Determinar esto empíricamente. </li><li> Con el fin de supervisar el estado de cumplimiento de los astrocitos, sembrar en paralelo enun estándar de 96 pocillos un volumen idéntico de la célula astrocito-suspensión. Este pozo tiene la misma superficie que el inserto de 6,5 mm (0,33 cm 2) y permite la fácil visualización de las células por microscopía de contraste de fase de la membrana de inserción. Cuando se observa la adherencia suficiente de la astrocitos en el control de 96 pocillos, los astrocitos han adecuadamente adherido también a la membrana de inserción. </li><li> Cuando los astrocitos se han adherido suficientemente en el control de 96 pocillos, transferir los conjuntos de inserto a la campana de cultivo de tejido (ver nota anterior) y retire suavemente el tubo de silicona externa y tapones. Inserciones Volver a la orientación normal (es decir, en posición vertical) en los pocillos suministrados contienen 800 l / pocillo de medio de mantenimiento BEC (sección 1.1.2). </li></ol> 2.3. Siembra de BEC en la Cámara por encima de los astrocitos Luminal Seed 2x10 4 BEC en 200 l sobre la superficie luminal de colágeno recubierto y devolver la inseguridadRTS en la incubadora. 2.4. Cocultivo Cocultivo los insertos SVG / BEC sembrados durante 3 días en medio BEC sin cambio de medio antes de la experimentación. 3. La experimentación con el modelo de acreditación Humano (Día 3) <ol><li> Para estimular las células in vitro primera colada de BBB en los medios de comunicación mediante la sustitución abluminal y luminal con 600 l y 100 l de medio libre de suero BEC, respectivamente. </li><li> Aspirar el medio luminal de nuevo y reemplazar con 100 l de medio libre de suero con agentes estimulantes. Nota: Si es necesaria la estimulación de la cámara abluminal (para activar la acreditación vitro desde el compartimiento astrocítica), aspirar el medio abluminal y reemplazar con 600 ul de medio libre de suero con agentes estimulantes. </li><li> Pon a prueba cada grupo experimental en tres ejemplares (por lo tanto, si no se realiza la estimulación luminal, que requiere 3 x 100 l, se recomienda diluir la re<html> agentes a sus concentraciones finales en 350 l de medio libre de suero por grupo para reducir al mínimo los errores de pipeteo entre pozos). </li><li> Realizar paracelular estándar y / o ensayos de permeabilidad transcelular de trazadores marcados 16,24 (para el último usamos isotiocianato de fluoresceína (FITC) y conjugado con albúmina) y / o la medición de la TEER 13,16,25 como se describe anteriormente. </li></ol> Para tener en cuenta las fluctuaciones en la permeabilidad de la línea de base entre los experimentos, analizar los cambios en la permeabilidad relativa a un inserto revestido sin células (que sirve como una referencia para la permeabilidad máxima) y al grupo tratado con vehículo usando la fórmula: Permeabilidad (% de max) = ( valor de permeabilidad de inserción experimental - valor promedio de la permeabilidad del grupo del vehículo) / (valor de permeabilidad de la inserción en blanco - el valor promedio de la permeabilidad del grupo del vehículo) X 100. 4. La visualización de las células en membranas porosas nt &quot;&gt; Comentario: las células no teñidas en las membranas de inserción son difíciles de observar por contraste de fase o el contraste de interferencia diferencial (DIC) de microscopía ya que la membrana es bastante opaca e interfiere con la transmisión de la luz Para hacer frente a este problema, hemos desarrollado diversos procedimientos de tinción de células en. inserciones, que mejoran en gran medida la apariencia de células en la membrana. Generalmente, las manchas de las membranas de inserción mientras que todavía unido a la pieza de inserción, en los pozos. Las membranas deben ser retirados sólo al final del procedimiento de tinción para los propósitos de montaje. 4.1. Hematoxilina tinción <ol><li> Fijar insertos con helado 4% (w / v) paraformaldehído (PFA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS; NaCl 130 mM, 10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, pH 7,2) durante 20 min. Lavar una vez con PBS. </li><li> Sumerja el inserto en solución de hematoxilina de Mayer 0,1% durante 2 min. </li><li> Lave suavemente la boquilla con agua del grifo (sumergiendo las insert en un vaso que contiene el agua del grifo y pipetear suavemente el exceso de agua). Transferir el inserto a la solución de Scott agua del grifo (2 g / l de NaHCO3, 20 g / L MgSO4) durante ~ 20 s hasta que el color azul deseado desarrolla. Lave el inserto de nuevo con agua del grifo (punto 4.1.3). Una tinción de eosina opcional se puede introducir aquí por inmersión de la pieza de inserción en la solución de eosina 1% durante 10 s seguido por un lavado con agua del grifo. </li><li> Aire secar la membrana de inserción. Usando un bisturí (corte alrededor del borde de la membrana) quitar la membrana y montarlo en un portaobjetos de vidrio para la imagen de campo claro Nota: Si se utiliza di-N-butylphthalateinxylene (DPX) medio de montaje lavar el inserto con etanol al 100%, seguido de xileno antes de retirar y montar la membrana. </li></ol> 4.2. Microscopio Electrónico de Barrido (SEM) <ol><li> Fijar insertos con enfriado con hielo 4% (w / v) de PFA en PBS durante 20 min. Lavar tres veces en PBS. </li><li> Post-fijar las membranas durante 30 min en 1% (w / v) Tetróxido de osmio en MQH 2 O. </li><li> Lavar insertos en agua (sección 4.1.3) y se deshidratan en un gradiente creciente de etanol (50%, 70%, 90% durante 5 min cada uno, y luego 3 veces con etanol al 100% durante 10 minutos por intervalo). </li><li> Tratar insertos deshidratados con una mezcla de hexametildisilazano (HMDS): etanol (1:2 y luego 2:1 para 5 min). </li><li> Tratar insertos con 100% HMDS de 5 min, aire seco y almacenar en condiciones desecadas. </li><li> Retire la membrana utilizando un bisturí (corte alrededor del borde de la membrana). Examine las membranas por microscopía electrónica de barrido. </li></ol> 4.3. Inmunofluorescencia <ol><li> Fijar insertos con enfriado con hielo 4% (w / v) de PFA en PBS durante 20 min, se lava una vez en solución salina tamponada con Tris (TBS; 50 mM de Tris-HCl, pH 7,6, NaCl 154 mM, 0,22 m filtrada). </li><li> Realizar la inmunotinción de las células en la membrana de inserción como se ha descrito anteriormente 26. </li><li> Retire la membrana utilizando un bisturí (corte alrededor del borde de la membrana) y montarlo en agdiapositiva lass con medio de montaje de fluorescencia. Examine membrana mediante microscopía de fluorescencia. </li></ol>

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<li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315-327 (2011).</li>
</ol>

Los autores tienen nada que revelar.

La investigación médica en patologías cerebrales sufre mucha dificultad de traslación. En el área de accidente cerebrovascular isquémico agudo, por ejemplo, muchos fármacos que mostraron una gran promesa en modelos animales fallaron en la clínica 38,39. Las razones de estos resultados decepcionantes son diversos e incluyen la infidelidad de los sistemas de pruebas preclínicas con el escenario de derrame cerebral humana y la exageración de los resultados obtenidos a partir de estudios en animales 21.</sup...

La acreditación es una interfaz especializada entre la circulación de la sangre periférica y el sistema nervioso central, de manera crucial responsable del mantenimiento de la hemostasia cerebro. Se compone de células cerebrales distintas endoteliales microvasculares (BEC) que son funcionalmente influenciada por pocos componentes celulares y acelulares (a continuación) para formar una puerta de entrada ajustado y dinámico en el cerebro. En condiciones fisiológicas la acreditación restringe el paso de las células sanguíneas, componentes del plasma y sustancias nocivas, todos potencialmente neurotóxico, en el cerebro. En paralelo, la acreditación intercambia selectivamente iones y nutrientes (glucosa y amino-ácidos) clave y los productos de desecho metabólicos entre el cerebro y la circulación para mantener con precisión el entorno de 1,2 cerebro. En los últimos años cada vez es más evidente que el fallo de la BBB se produce en una variedad de patologías cerebrales crónicas, tales como enfermedades neurodegenerativas o relacionados con la inflamación (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer y multiple esclerosis, respectivamente) 3, así como en condiciones agudas como accidente cerebrovascular isquémico 4. Las propiedades únicas de BBB de las células endoteliales del cerebro (BEC) se inducen en gran medida por su entorno cerebral 5, y en particular por los astrocitos 6,7. Hay una creciente comprensión de que otros tipos de células, tales como pericitos 8, neuronas y microglia 1,3, así como la membrana basal 9, apoyan BEC y juntos forman una unidad funcional denominada &quot;unidad neurovascular&quot; (NVU), que al mismo tiempo parejas neuronal demandas metabólicas a sus capilares que suministran 10. La participación de la acreditación en situaciones patológicas subyace numerosos intentos de desarrollar modelos in vitro de BBB para ayudar en la investigación relacionada con la acreditación 11,12. Estos modelos tienen como objetivo imitar lo más cerca posible in vivo características de BBB de acuerdo con el principio NVU. In vitro </em&gt; modelos de BBB se basan generalmente en una monocapa de las BEC apretado nudo de formación (principalmente de bovino 13, 14 humana, de rata 15, ratón 16, y porcinos 17,18 orígenes), cultivadas en una membrana porosa junto con astrocitos de apoyo (ampliamente revisado por Deli et al. 2005 11). Los astrocitos pueden ser cultivadas en condiciones sin contacto en la parte inferior de un pocillo de cultivo tisular, separado de las BEC (cultivadas en la superficie superior de la membrana) por el medio de cultivo todavía la comunicación con las BEC a través de factores solubles 16. En modelos más avanzados que mejor se asemejan a la estructura anatómica de la BBB in vivo, los astrocitos se mantienen en condiciones de contacto y se cultivaron directamente en el lado opuesto de la membrana en las proximidades de las BEC 13,15,17 (Figura 1). Esta configuración permite el contacto físico entre BEC y astrocitos, establecido cuando el proyecto astrocitossus procesos a través de la membrana porosa. Es importante destacar que, para un verdadero contacto a producirse los poros debe ser ≥ 1μm de diámetro, desde astrocíticos-pies finales no pueden pasar a través de tamaños de poro más pequeños (es decir, 0,4 micras) 14,15. En particular, los sistemas de contacto de BBB se demuestran en algunos estudios para ser superior a sus homólogos sin contacto con respecto a su resistencia eléctrica trans-endotelial (TEER) y los valores de permeabilidad del endotelio de diversos trazadores 13,17,18. Una dimensión adicional de flujo de medios de comunicación se añadió recientemente en un número de modelos in vitro de BBB para aplicar fuerzas de cizallamiento al endotelio para más cerca de la simulación de la vasculatura del cerebro 12,19. Un obstáculo técnico a superar cuando se genera un modelo de contacto acreditación es la siembra de los astrocitos en contra de la gravedad sobre la superficie abluminal de la membrana porosa. Protocolos anteriores 13,20, donde los astrocitos se sembraron en simplemente una gota de medios de comunicación en la parte superior de una eninserto verted, permitió veces sólo a corto siembra (es decir, 10 min 13 o 2 horas 20) que se encuentra en nuestras manos para ser insuficiente para la fijación celular adecuada. El uso de este método básico, un período más largo de fijación de astrocitos requiere un constante monitoreo de los insertos mediante la apertura frecuente de la incubadora (causar fluctuaciones en la temperatura, el pH y la humedad) y también es propensa a la siembra de células irregular debido a las fugas de los medios de comunicación a través de los poros, especialmente Si se emplean poros de más de 1 m. Aquí se describe un protocolo general para la preparación de un modelo de contacto BBB. Nuestro procedimiento incluye un método alternativo para la célula-siembra en inserciones invertidas, que aborda las limitaciones mencionadas anteriormente. El método permite la adherencia sin perturbaciones de los astrocitos en la superficie de la membrana abluminal, en un incubador equilibrado, durante un período prolongado de tiempo. Como resultado, se consigue una siembra uniforme de los astrocitos que aumenta la calidad de barreray minimiza las variaciones de permeabilidad basales entre insertos. A medida que el uso de células humanas es importante para la investigación humana correspondiente 21, que, además demostramos en este artículo la utilización específica de una novedosa combinación de las BEC humanos primarios e inmortalizado astrocitos humanos para el establecimiento de un modelo de acreditación de contacto humano con una alta capacidad de rastreo de . Desde la visualización de las células en membranas porosas puede ser, nosotros también las técnicas de tinción de detalles difíciles que pueden ayudar en la determinación de la confluencia y la morfología de las células de las membranas porosas. Finalmente, se ejemplifican cómo nuestro modelo de acreditación humano puede ser utilizado para examinar el efecto de tipo activador del plasminógeno tisular (t-PA) - una enzima para disolver coágulos que sirve como una opción de tratamiento único para el accidente cerebrovascular isquémico agudo - en la acreditación.

<table><tbody><tr><td>Factor de fijación</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>4Z0-210</td><td></td></tr><tr><td>Células endoteliales microvasculares cerebrales (BECs), primarias, humanas</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>ACBRI 376</td><td></td></tr><tr><td>Medio completo</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>4Z0-500</td><td>Complementado con CSC JetFuel</td></tr><tr><td>Medio completo sin suero</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>SF-4Z0-500</td><td>Complementado con CSC RocketFue</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 con 15 mM HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento para el crecimiento de las células endoteliales (de origen bovino)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2759-15MG</td><td></td></tr><tr><td>Tubo externo de silicona</td><td>Watson-Marlow</td><td>913.A080.016</td><td>Pumpsil marca, 8 mm de diámetro interno, 1,6 mm de pared</td></tr><tr><td>Suero fetal de ternera</td><td>Lonza</td><td>14-501F</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sódica</td><td>Pfizer</td><td></td><td>1.000 U/ml</td></tr><tr><td>Hexametildisilazano (HMDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4875</td><td></td></tr><tr><td>Células endoteliales microvasculares del cerebro humano</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>ACBRI 376</td><td></td></tr><tr><td>Tubo interno de silicona</td><td>Watson-Marlow</td><td>913.A032.016</td><td>Marca Pumpsil, 3,2 mm de diámetro interno, pared de 1,6 mm</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Mayer' s solución de hematoxilina</td><td>Amber Scientific</td><td>MH</td><td></td></tr><tr><td>Medio esencial mínimo con Earle' s solución salina equilibrada</td><td>HyClone Laboratories</td><td>SH30244.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno de rata I</td><td>Trevigen</td><td>3440-100-01</td><td>Marca Cultrex</td></tr><tr><td>Insertos de cultivo de tejidos</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3472</td><td>marca Transwell, 6,5 mm de diámetro, con membrana porosa de poliéster, 3 &; m tamaño de poro</td></tr></tbody></table>

método mejorado para la preparación de una base de células, contacto modelo humano de la barrera hematoencefálica

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

La barrera sangre-cerebro (BBB) ​​comprende impermeables pero adaptables capilares del cerebro que controlan estrechamente el medio ambiente cerebro. El fallo de la BBB ha sido implicado en la etiología de muchas patologías cerebrales, creando una necesidad para el desarrollo de humano en modelos in vitro de BBB para ayudar en la investigación clínica relevante. Entre los numerosos modelos de BBB descritas hasta ahora, una estática (sin flujo), en contacto con la acreditación modelo, donde los astrocitos y las células endoteliales del cerebro (BEC) se co-cultivaron en los lados opuestos de una membrana porosa, surgió como un sistema todavía auténtica simplificado para simular el acreditación con capacidad de cribado de alto rendimiento. Sin embargo, la generación de dicho modelo presenta unos desafíos técnicos. Aquí se describe un protocolo para la preparación de un modelo de acreditación contacto humano que utiliza una combinación nueva de BEC humanos primarios y astrocitos humanos inmortalizados. Concretamente, se detalla un método innovador para la célula-siembra en inserciones invertidas, así como especificar la insercióntécnicas y tinción camisetas ejemplifican cómo usamos nuestro modelo para la investigación relacionada con la acreditación.

Con el fin de establecer un modelo de contacto acreditación humana tuvimos que cultivar IVS y BEC en membranas porosas con un tamaño de poro de 3 micras, que se muestra para permitir el paso de astrocitos finales pies para el contacto con las células endoteliales 14,15,27,28. Una representación esquemática del modelo de contacto completa se ilustra en la Figura 1 (la ilustración de la izquierda). El principal desafío técnico presentado por un sistema de contacto es la necesidad de sembrar ast...

Establecimiento de modelos humanos de la barrera sangre-cerebro (BBB) ​​puede beneficiar a la investigación de las condiciones del cerebro asociadas con la acreditación fracaso. Se describe aquí una técnica mejorada para la preparación de un modelo de acreditación de contacto, que permite que el cocultivo de astrocitos humanos y las células endoteliales del cerebro en los lados opuestos de una membrana porosa.

Método mejorado para la preparación de una base de células, Contacto Modelo Humano de la barrera hematoencefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Este procedimiento tiene como objetivo simular in vitro la barrera hematoencefálica mediante el cultivo conjunto de astrocitos y células endoteliales en caras opuestas de una membrana porosa. Primero, recubra la superficie luminal de la membrana porosa con una matriz extracelular. Proteínas como el colágeno ajustan el inserto invertido con un tubo de silicona externo y un tapón de silicona interno para crear un pocillo removible por encima de la superficie abluminal de la membrana.Ahora siembre las células astrocíticas sobre el inserto invertido para que se adhieran a la superficie abluminal. Luego retire el tubo y coloque el inserto en su orientación normal dentro de un pocillo lleno de medio. A continuación, siembre las células endoteliales en el compartimento luminal del inserto y realice un cultivo conjunto con los astrocitos opuestos.En última instancia, el paso de trazadores fluorescentes o la grabación de la resistencia eléctrica transendotelial se utiliza para medir los cambios de permeabilidad en la BHE in vitro en respuesta a diversos agentes estimulantes. Quien demostrará este procedimiento será el Sr. Barry Nigo, un posdoctorado en mi laboratorio, que durante su doctora

improved-method-for-preparation-human-cell-based-contact-model-blood

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Bioingeniería

Este video demuestra el co-cultivo de células pericitarias, astrocitos y endoteliales del cerebro humano. Cada capa celular se forma por separado y luego se cultiva junta, creando un sistema de tres capas que imita la disposición celular de la barrera...

Desarrollo de un modelo de cultivo celular triple de la barrera hematoencefálica humana

Las células epiteliales del plexo coroideo (CP) forman la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo (BCSFB). Un modelo in vitro del BCSFB emplea células de papiloma del plexo coroideo humano (HIBCPP). Este artículo describe el cultivo y la infección basolateral de células HIBCPP utilizando un sistema de inserción de filtro de cultivo celular.

Un modelo basado en células epiteliales del plexo coroideo de la barrera de fluido cerebroespinal humano Sangre-para estudiar la infección bacteriana desde el lado basolateral

Aquí, describimos un modelo murino in vitro de la barrera hematoencefálica que hace uso de la espectroscopia de células de impedancia, con un enfoque en las consecuencias sobre la integridad y permeabilidad de las células endoteliales al interactuar con las células T activadas.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro mediante Espectroscopia de Impedancia: Un enfoque en la interacción de células T de la célula endotelial

El objetivo del protocolo es presentar un procedimiento optimizado para el establecimiento de un modelo de barrera blood - brain (BBB) en vitro basado en las células endoteliales de cerebro porcino primario (pBECs). El modelo muestra alta reproducibilidad, alta tensión y es adecuado para estudios de transporte y tráfico intracelular en el descubrimiento de medicamentos.

Mejor método para el establecimiento de un In Vitro Barrera Blood - Brain modelo basado en las células endoteliales de cerebro porcino

Tubos capilares del cerebro aislado de tejido de cerebro humano pueden utilizarse como un modelo preclínico para estudiar la función de barrera bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. Aquí, presentamos un protocolo optimizado para aislar los capilares del cerebro del tejido de cerebro humano fresco.

Aislamiento de los capilares cerebrales del cerebro humano fresco tejido

Aquí presentamos un protocolo que describe la configuración de un cellulo en BBB (barrera hematoencefálica)-cultura de membrana porosa poliester Minibrain insertar sistema para evaluar el transporte de biomoléculas o agentes infecciosos a través de una BBB humana y sus impacto fisiológico en las células cerebrales vecinas.

Un modelo de interfaz de sangre-cerebro humano estudiar cruces de barrera por patógenos o medicamentos y sus interacciones con el cerebro

La barrera hematoencefálica (BBB) es una unidad neurovascular multicelular que regula estrechamente la homeostasis cerebral. Mediante la combinación de iPSC shumanos y tecnologías de órgano en chip, hemos generado un chip BBB personalizado, adecuado para el modelado de enfermedades y predicciones de penetrabilidad de fármacos del SNC. Se describe un protocolo detallado para la generación y el funcionamiento del chip BBB.

Generación de un chip de barrera hematoencefálica basada en iPSC humana

Este protocolo describe un método para establecer un modelo in vitro de barrera hematoencefálica humana (BHE). Las células endoteliales y los pericitos se siembran a cada lado de un filtro de inserción (compartimento sanguíneo), y los astrocitos se siembran en el pozo inferior (compartimento cerebral). El modelo caracterizado se utilizó para experimentos de transporte de nanopartículas.

Un sistema celular de triple cultivo que modela la barrera hematoencefálica humana

Aquí, describimos el método para establecer un modelo de cultivo celular triple de la barrera hematoencefálica basado en células endoteliales microvasculares primarias del cerebro humano, astrocitos y pericitos. Este modelo multicelular es adecuado para estudios de disfunción de unidades neurovasculares durante el ictus isquémico in vitro o para el cribado de candidatos a fármacos.

Un modelo triple de cultivo celular primario de la barrera hematoencefálica humana para estudiar el accidente cerebrovascular isquémico in vitro

Este protocolo describe un método de extrusión para preparar vesículas lipídicas de tamaños sub-micra con un alto grado de homogeneidad. Este método utiliza un sistema de presión controlada con tasas controladas de nitrógeno de flujo para la preparación de liposomas. La preparación de...

Presión constante controlada por extrusión Método para la preparación de vesículas de lípidos de tamaño nano-

Aprenda a preparar un modelo de barrera hematoencefálica humana mediante cocultivo de astrocitos y células endoteliales cerebrales en membrana porosa. Este método optimiza la adherencia celular y permite estudiar la permeabilidad del BBB in vitro.

Método mejorado para la preparación de una base de células, Contacto Modelo Humano de la barrera hematoencefálica

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