Método mejorado para la preparación de una base de células, Contacto Modelo Humano de la barrera hematoencefálica

Este procedimiento tiene como objetivo una simulación in vitro de la barrera hematoencefálica mediante el cocultivo de astrocitos y células endoteliales en lados opuestos de una membrana porosa. En primer lugar, recubrir la superficie luminal de la membrana porosa con una matriz extracelular. Las proteínas como el colágeno se ajustan al inserto invertido con un tubo de silicona externo y un tapón de silicona interno para crear un pozo extraíble por encima de la superficie abluminal de la membrana.

Ahora siembra las células de astrocitos en el inserto invertido para que se adhieran a la superficie abluminal. A continuación, retire el tubo y coloque el inserto en su orientación normal dentro de un pocillo lleno de mediano. A continuación, siembre las células endoteliales en el compartimento luminal del inserto y co-cultive con los astrocitos opuestos.

En última instancia, el paso de trazadores fluorescentes o el registro de la resistencia eléctrica transendotelial se utiliza para medir los cambios de permeabilidad en la BHE in vitro en respuesta a diversos agentes estimulantes. Barry Nigo, un postdoc en mi laboratorio, que durante el curso de su doctorado, desarrolló este protocolo de siembra modificado que hemos utilizado para simular la barrera hematoencefálica. Primero tuvimos una idea de este procedimiento después de probar métodos de asiento más rudimentarios y tener mucha frustración con las fugas de medio a través de la pausa, así como volúmenes medianos pequeños.

Esto dictó un período de asiento de astrocitos corto e insuficiente, que estamos tratando de abordar en nuestro procedimiento. Coloque los insertos de cultivo de tejidos en los pocillos de una placa de 24 pocillos. Luego agregue 50 microlitros de colágeno de rata de 132 microgramos por mililitro, uno para recubrir la superficie luminal de los insertos, incubar durante la noche en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados para eliminar cualquier ácido residual, lavar tanto el lado abluminal como el luminal de los insertos con agua destilada doble.

A continuación, invierta los insertos y coloque suavemente un trozo corto de tubo de silicona elástica alrededor del borde de la membrana porosa. Básicamente, creando un nuevo pozo por encima de la superficie abluminal. Para sellar la parte inferior.

Prepare un tapón hecho de tubo de silicona sellado en un extremo con la punta cortada de un tubo de PCR de 0,2 mililitros. Ahora, con una pinza estéril, inserte el tapón de silicona en la cavidad luminal y avancéelo hasta que alcance aproximadamente uno o dos milímetros de la membrana. A continuación, 40.000 astrocitos en 200 microlitros de su medio de mantenimiento directamente en la silicona muy por encima de la superficie de la membrana abluminal.

Para controlar el estado de adherencia de los astrocitos, utilice una placa estándar de 96 pocillos, ya que tiene la misma superficie que el inserto de 6,5 milímetros y lo permite. Visualización más fácil de las células mediante microscopía de contraste de fase, un volumen idéntico de la suspensión celular del astrocito en la placa de 96 pocillos ocho. Esto se controlará a lo largo del tiempo para determinar cuándo los astrocitos en el pocillo 96 y, por extensión, en la membrana del inserto se han adherido lo suficiente como para mantener la esterilidad.

Transporte los insertos ensamblados entre dos placas de seis pocillos para minimizar la exposición al aire sin filtrar. Coloque las células en la incubadora para permitir que los astrocitos se adhieran. Coloque también la placa de control de 96 pocillos en la incubadora en este momento.

Después de unas cuatro horas, revise el pozo de control 96 para ver si los astrocitos se han adherido. Si es así, transfiera el conjunto de insertos de nuevo a la campana de cultivo de tejidos. Retire con cuidado el tubo de silicona externo y los tapones.

A continuación, vuelva a colocar los insertos en la orientación vertical normal en pocillos que contengan 800 microlitros por pocillo de medio de mantenimiento de células endoteliales. Vea 20.000 células endoteliales cerebrales en 200 microlitros en el cocultivo de superficie luminal recubierta de colágeno durante tres días en medio BEC sin ningún cambio de medio. Antes de la experimentación.

Lave los tubos y tapones de silicona en etanol antes de esterilizarlos en autoclave para su uso posterior. Para estimular la barrera de cerebros en sangre in vitro, primero, reemplace el medio abluminal y luminal con 600 microlitros y 100 microlitros de medio becs libre de suero respectivamente. Aspirar el lavado luminal y sustituirlo por 100 microlitros de medio libre de suero que contenga agentes estimulantes.

Si induce la BHE in vitro desde el compartimento astrocítico, aspire el medio abluminal y reemplácelo con 600 microlitros de suero libre. El medio que contiene agentes estimulantes continúa con los ensayos estándar de permeabilidad paracelular o transcelular de los trazadores de etiqueta para establecer un modelo de barrera hematoencefálica en contacto humano. Los astrocitos inmortalizados humanos y las células endoteliales cerebrales se cultivan en membranas porosas de tres micras que permiten el paso de los astrocitos y las patas para el contacto con las células endoteliales.

El método permitió un período óptimo de siembra ininterrumpida de astrocitos y becs, que a su vez se adhieren fuertemente a la superficie porosa con una pérdida celular mínima y crecen hasta la cofluidez en tres días. Publicación de la siembra. Ambos tipos de células mantienen sus marcadores celulares específicos en membranas porosas, como lo indican los patrones de expresión de la proteína ácida fibrilar glial GFAP en SVG y el factor de von Vand VWF NEC.

De acuerdo con la característica más fundamental de un modelo BBB de contacto, el NFE astrocítico puede pasar a través de los poros de tres micras hacia el compartimento luminal. Por lo tanto, potencialmente puede existir contacto entre SVGs y BES asentados en poros de esta dimensión. Además, las imágenes SEM indican que los SVG y los BBCs eran capaces de crecer directamente sobre los poros de la membrana, un fenómeno que contribuye artificialmente a la función de barrera física de los modelos de contacto BBB in vitro.

En este estudio, se utiliza el modelo BBB de contacto humano para explorar el efecto del agente fibrinolítico TPAA sobre la BBB. Estos estudios in vitro confirman que el TPA aumentó la permeabilidad de la BHE intacta de forma dependiente de la concentración y del tiempo, ambas dentro de un rango farmacológico relevante. Los cambios morfológicos dramáticos de los astrocitos SVG son evidentes en las membranas porosas después de la exposición a TPA, lo que sugiere que la respuesta astrocítica a TPA subyace a la apertura de la BBB inducida por TPA.

Este método desempeñó un papel clave en nuestra investigación, cuyo objetivo era investigar cómo responde la barrera hematoencefálica al fármaco trombolítico TPAA utilizado en pacientes con ictus para disolver los coágulos sanguíneos. Es la primera demostración de este método en la literatura, y esperamos que otros investigadores puedan adoptarlo para sus propios fines.