Método mejorado para la preparación de una base de células, Contacto Modelo Humano de la barrera hematoencefálica

Este procedimiento tiene como objetivo simular in vitro la barrera hematoencefálica mediante el cultivo conjunto de astrocitos y células endoteliales en caras opuestas de una membrana porosa. Primero, recubra la superficie luminal de la membrana porosa con una matriz extracelular. Proteínas como el colágeno ajustan el inserto invertido con un tubo de silicona externo y un tapón de silicona interno para crear un pocillo removible por encima de la superficie abluminal de la membrana.

Ahora siembre las células astrocíticas sobre el inserto invertido para que se adhieran a la superficie abluminal. Luego retire el tubo y coloque el inserto en su orientación normal dentro de un pocillo lleno de medio. A continuación, siembre las células endoteliales en el compartimento luminal del inserto y realice un cultivo conjunto con los astrocitos opuestos.

En última instancia, el paso de trazadores fluorescentes o la grabación de la resistencia eléctrica transendotelial se utiliza para medir los cambios de permeabilidad en la BHE in vitro en respuesta a diversos agentes estimulantes. Quien demostrará este procedimiento será el Sr. Barry Nigo, un posdoctorado en mi laboratorio, que durante su doctorado desarrolló este protocolo modificado de siembra que hemos utilizado para simular la barrera hematoencefálica. Tuvimos la primera idea de este procedimiento tras probar métodos de siembra más rudimentarios y experimentar mucha frustración por la fuga de medio a través del inserto, así como por los volúmenes reducidos de medio.

Esto determinó períodos cortos e insuficientes para la adhesión de astrocitos, lo cual estamos intentando abordar en nuestro procedimiento. Coloque los insertos para cultivo de tejidos en los pocillos de una placa de 24 pocillos. A continuación, añada 50 microlitros de colágeno de rata a 132 microgramos por mililitro, uno para recubrir la superficie luminal de los insertos, incube durante la noche en un incubador húmedo a 37 grados Celsius con el fin de eliminar cualquier ácido residual, lave ambas caras, la abluinal y la luminal, de los insertos con agua doblemente destilada.

Luego invierta los insertos y coloque suavemente un trozo corto de tubo de silicona elástica alrededor del borde de la membrana porosa, creando esencialmente un nuevo pocillo por encima de la superficie abluminal, para sellar el lado inferior.

Prepare un tapón hecho de tubo de silicona sellado en un extremo con la punta cortada de un tubo PCR de 0,2 mililitros. Ahora, utilizando una pinza estéril, inserte el tapón de silicona en la cavidad luminal y avance hasta que alcance aproximadamente uno a dos milímetros de la membrana. A continuación, siembre 40.000 astrocitos en 200 microlitros de su medio de mantenimiento directamente en el pocillo de silicona por encima de la superficie de la membrana abluminal.

Para monitorear el estado de adherencia de los astrocitos, utilice una placa estándar de 96 pocillos, ya que tiene la misma área de superficie que el inserto de 6,5 milímetros y permite una visualización más sencilla de las células mediante microscopía de contraste de fase. Siembre un volumen idéntico de la suspensión celular de astrocitos en la placa de 96 pocillos. Esta será monitoreada a lo largo del tiempo para determinar cuándo los astrocitos en la placa de 96 pocillos, y por extensión en la membrana del inserto, se hayan adherido suficientemente para mantener la esterilidad.

Transporte los insertos ensamblados colocándolos entre dos placas de seis pocillos para minimizar la exposición al aire no filtrado. Coloque las células en el incubador para permitir que los astrocitos se adhieran. También coloque en el incubador la placa de control de 96 pocillos en este momento.

Después de aproximadamente cuatro horas, revise el pocillo de control de 96 para verificar si los astrocitos se han adherido. De ser así, transfiera nuevamente el ensamblaje de inserto a la cabina de cultivo celular. Retire con cuidado los tubos de silicona externos y los tapones.

Luego, devuelva los insertos a la orientación normal vertical en los pocillos que contienen 800 microlitros por pocillo de medio de mantenimiento para células endoteliales. Siembre 20.000 células endoteliales cerebrales en 200 microlitros sobre la superficie luminar recubierta con colágeno para el cultivo en co-cultivo durante tres días en medio BEC sin ningún cambio de medio. Antes del experimento.

Lave los tubos y tapones de silicona con etanol antes de la autoclave para su uso posterior. Para estimular la barrera hematoencefálica in vitro, primero reemplace los medios abiluminal y luminal con 600 microlitros y 100 microlitros de medio BECS sin suero, respectivamente. Aspire el lavado luminal y reemplácelo con 100 microlitros de medio sin suero que contenga agentes estimulantes.

Si se induce la BHE in vitro a partir del compartimento astrocitario, entonces aspire el medio abluminal y reemplácelo con 600 microlitros de medio libre de suero. Continúe con los ensayos estándar de permeabilidad paracelular o transcelular de los trazadores marcados para establecer un modelo humano de barrera sangre-cerebro de contacto. Los astrocitos inmortalizados humanos y las células endoteliales cerebrales se cultivan sobre membranas porosas de tres micrones que permiten el paso de los pies astrocitarios para el contacto con las células endoteliales.

El método permitió un período óptimo e ininterrumpido de siembra de astrocitos y BECs, los cuales, a su vez, se adhieren firmemente a la superficie porosa con pérdida mínima de células y alcanzan la cofluencia en tres días posteriores a la siembra. Ambos tipos celulares mantienen sus marcadores específicos en las membranas porosas, como lo indican los patrones de expresión de la proteína ácida fibrilar glial GFAP en SVGs y del factor de von Willebrand VWF en NECs.

Consistente con la característica más fundamental de un modelo de BBB de contacto, el NFE astrocítico puede pasar a través de los poros de tres micrones hacia el compartimento luminal. Por lo tanto, potencialmente puede existir contacto entre los SVG y las BES asentadas sobre poros de esta dimensión. Además, las imágenes de MEB indican que los SVG y las BBC eran capaces de crecer directamente sobre los poros de la membrana, un fenómeno que contribuye artificialmente a la función de barrera física de los modelos in vitro de BBB de contacto.

En este estudio, se utiliza el modelo humano de BBB de contacto para explorar el efecto del agente fibrinolítico TPAA sobre la BBB. Estos estudios in vitro confirman que el TPA aumentó efectivamente la permeabilidad de la BBB intacta de manera dependiente de la concentración y del tiempo, ambos dentro de un rango farmacológicamente relevante. Se observan cambios morfológicos drásticos en los astrocitos SVG sobre las membranas porosas tras la exposición al TPA, lo que sugiere que la respuesta astrocitaria al TPA subyace a la apertura de la BBB inducida por TPA.

Este método desempeñó un papel clave en nuestra investigación, cuyo objetivo era estudiar cómo la barrera hematoencefálica responde al fármaco trombolítico TPAA utilizado en pacientes con accidente cerebrovascular para disolver coágulos sanguíneos. Esta es la primera demostración de este método en la literatura, y esperamos que otros investigadores puedan adoptarlo para sus propios fines.