Preparación de la Calidad pirofosfatos Inositol

El objetivo general de este procedimiento es generar y purificar pirofosfato de buena calidad y nool. Esto se logra utilizando primero IP six como sustrato para la IP seis quinasa, una enzima para generar IP seven. A continuación, se cargan las reacciones enzimáticas en un gel de poliamida y se extirpa la banda correspondiente a IP siete.

A continuación, el IP siete se aísla mediante ciclos de hidratación por deshidratación posteriores. El paso final del procedimiento es confirmar la pureza del producto y determinar la concentración. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la actividad biológica de IP seven a través de la incubación de IP seven.

Con la quinasa VIP uno y con la fosfatasa IP siete DDP uno, estas reacciones generan IP ocho e IP seis respectivamente. Hacer esto, Met puede proporcionar información sobre la señalización IP siete. También se puede aplicar a otros sistemas, como en parte de los fosfatos como IP eight o el PPIP four derivado de IP five.

Este protocolo comienza con la preparación de reacciones enzimáticas en las que IP seis quinasa uno o VIP uno convierten IP seis en las isoformas relacionadas con el pirofosfo. Para esta demostración, las enzimas IP seis marcadas con histamina, quinasa uno y VIP uno marcadas con GST se purificaron a partir de E. coli de acuerdo con un procedimiento descrito anteriormente. Para comenzar, prepare de 10 a 20 reacciones enzimáticas independientes que contengan IP seis y su IP seis quinasa uno o GST VIP uno como se describe en el protocolo escrito.

Ajuste el volumen a 50 microlitros con agua destilada doble milli Q. Después de hacer girar brevemente los tubos, incube las reacciones a 37 grados centígrados durante la noche con rotación. Prepare el aparato de gel de poliacrilamida utilizando placas de vidrio de 24 centímetros de largo, 18 centímetros de ancho, espacios de 1,5 milímetros de ancho y un peine de 16 carriles.

A continuación, vierta una solución de gel previamente preparada entre las placas de vidrio prefabricado a un volumen de 50 mililitros por gel. Inserte el peine y deje que el gel polimerice durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente. Una vez que el gel se haya polimerizado, transfiera el aparato a la cámara frigorífica.

Ejecute previamente el gel en una vez TBE durante unos 30 a 60 minutos a 200 a 300 voltios, mientras tanto, una vez colorante naranja G. Para cada reacción, prepare una muestra de control estándar que contenga dos moles de IP seis. Después de la pre-ejecución, lave cada pocillo a fondo con tampón para correr.

Usar una jeringa conectada a una aguja de calibre 21 para eliminar cualquier precipitado. A continuación, cargue las muestras en el gel, evitando cargar los dos primeros y los dos últimos carriles del gel. Finalmente, haga funcionar el gel durante la noche a siete miliamperios por gel hasta que la banda de tinte G naranja esté dentro de los últimos 10 centímetros de la parte inferior del gel.

Para comenzar el aislamiento de IP siete, desmonte el aparato de gel y retire con cuidado una placa de vidrio dejando el gel en la otra. Corte una pequeña porción del gel desde justo por encima de la banda GD naranja hasta la parte inferior, incluido el estándar IP six y un carril de muestra. Tiñe la parte cortada del gel con azul de toluidina durante unos minutos hasta que aparezca la banda de pirofosfato de Anatol.

Mientras tanto, vuelva a colocar la placa de vidrio previamente retirada encima del gel para evitar que el gel sin manchar se seque. Transfiera la parte manchada del gel a una solución de tinción DES durante unos minutos para lavar cualquier exceso de azul de toluidina, luego vuelva a colocar el gel con el gel sin teñir. La banda IP siete debería ser visible, ya que funciona ligeramente más lento que el IP six estándar A TP, que funciona más rápido que IP seis también debería ser visible.

A continuación, use una hoja de afeitar para cortar la banda IP siete en la parte sin manchar del gel. Aproveche la posición de migración IP siete determinada con el gel antimanchas. Para estimar la ubicación de la banda IP siete, coloque la banda IP siete que se cortó del gel en un tubo de 15 mililitros y agregue 10 mililitros de agua destilada doble mili Q.

Rotar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente después de la incubación, desechar el líquido por decantación para eliminar el exceso de TBE y las partículas microscópicas de acrilamida. Posteriormente, realice dos ciclos de hidratación por deshidratación añadiendo primero cinco mililitros de metanol al 50% al tubo que contiene el gel IP seven. Gire la muestra a temperatura ambiente durante dos horas.

A continuación, transfiera la rodaja de gel a un nuevo tubo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de agua bidestilada mili Q y gírela a temperatura ambiente durante dos horas. Guarde el tubo que contiene metanol para su uso posterior después de la incubación. Repita el ciclo de hidratación de deshidratación una vez más para concentrar el IP siete eluido.

Combine los cinco mililitros de agua agregados anteriormente y cinco mililitros de metanol al 50%. Seque la solución combinada con una aspiradora rápida calentada a 60 grados centígrados. Una vez que las muestras estén casi secas, transfiera el líquido restante a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros.

Gire el tubo durante dos minutos de 5.000 rotaciones por minuto. Recoja el natante de SUP dejando los 20 a 30 microlitros inferiores, ya que puede contener partículas de acrilamida. Transfiera la muestra a un tubo de centrífuga nuevo de 1,5 mililitros.

Si es necesario, continúe el proceso de secado con una aspiradora rápida sin calentar. La recuperación de IP siete se reduce drásticamente si las muestras se secan por completo. Por lo tanto, es imperativo finalizar el proceso de secado cuando las muestras alcancen el volumen de 100 a 300 microlitros.

Una vez que se haya recuperado el IP siete aislado, cargue de dos a cinco microlitros de la muestra en un gel de página para determinar su concentración y pureza. Cargue varias diluciones de IP seis como patrones de concentración y cuatro moles de marcador de pólipos. Después de ejecutar el gel, visualice las isoformas iniciales de pirofosfato tiñendo y destiñiendo todo el gel con una solución de azul de toluidina.

Siguiendo el procedimiento que se acaba de describir después de la tinción con toluidina, las concentraciones se pueden determinar escaneando el gel y comparando las diferencias de intensidad entre IP seis e IP siete. Utilizando software de imagen como Image J, la conversión enzimática preparativa de IP seis a IP siete. El uso de las enzimas IP seis quinasas one y VIP one se puede resolver fácilmente mediante el análisis de páginas.

La carga de IP six como control de tamaño junto con la tinción en gel de azul de toluidina permite la identificación de los derivados pirofosforilados. Dado que funcionan más lentamente, dependiendo del número de grupos fosfato presentes en el inicial, el procedimiento descrito anteriormente resultó en la fácil purificación de IP siete. Además, el análisis del pirofosfato de anatol purificado por página reveló la pureza del IP siete.

Curiosamente, el isómero IP cinco de pirofosfato de tres del producto IP siete de VIP one migra ligeramente más lento que el isómero IP cinco de cinco pirofosfatos de VIP siete que es generado por IP seis quinasa uno. El uso de los estándares IP six permite una fácil cuantificación de la concentración del IP siete purificado antes de utilizar el IP siete. Para otros experimentos, se puede evaluar su actividad biológica. Cinco.

El pirofosfato IP cinco se incuba con FIP uno y con la fosfatasa IP siete DDP uno de forma rutinaria. La IP siete purificada se convierte en IP ocho por VIP uno y en IP seis por DDP uno. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como una tinción prolongada de tolin en azul, para responder a preguntas adicionales, como el aislamiento de IP ocho u otras formas fosforiladas en isoformas.