Microscopía de reflexión de interferencias para la visualización sin etiquetas de la dinámica de los microtúbulos

La microscopía de reflexión de interferencia permite obtener imágenes de microtúbulos que crecen y se encogen dinámicamente.

Fije tiras de parafina en un cubreobjetos y coloque un cubreobjetos un poco más pequeño encima. Calentar para derretir la parafina, formando un canal sellado. Pipetee una solución que contenga anticuerpos a través del canal. Los anticuerpos se adhieren a la superficie del cubreobjetos. Agregue una solución de bloqueo, bloqueando las regiones no unidas a anticuerpos y evitando la unión no específica a proteínas.

Coloque el cubreobjetos en la platina del microscopio. Ajuste el calentador de muestras a una temperatura que facilite el crecimiento de microtúbulos.

Pipeta semillas de microtúbulos estabilizadas con un análogo de trifosfato de guanosina no hidrolizable, GTP. Las semillas se unen al cubreobjetos recubierto de anticuerpos. Agregue un tampón que contenga tubulina, GTP y agentes reductores sin marcar.

A una temperatura y condiciones de amortiguación óptimas, las semillas actúan como sitios de nucleación, lo que permite la unión de tubulina no marcada y el crecimiento de microtúbulos.

Comience a obtener imágenes. La luz incidente se enfoca a través de un diafragma de apertura en un divisor de haz que refleja parcialmente la luz hacia el objetivo, iluminando la muestra. La interfaz de amortiguación de vidrio del cubreobjetos refleja parcialmente la luz incidente. La luz incidente restante pasa y se refleja en las interfaces tampón-microtúbulo.

Según la distancia entre el microtúbulo y el cubreobjetos, los haces reflejados de las dos interfaces interfieren, produciendo interferencia constructiva (haces que se combinan para producir una señal brillante) o interferencia destructiva (haces que se cancelan para producir una señal oscura).

Visualice los microtúbulos como imágenes de alto contraste. Capture imágenes de lapso de tiempo, detectando el crecimiento y la contracción de los microtúbulos.

Para comenzar, inserte un espejo 50/50 en la rueda de filtros de un microscopio fluorescente usando un cubo de filtro apropiado. Manipule el espejo con cuidado, ya que a menudo tienen un revestimiento antirreflectante. Gire a un objetivo de gran aumento que también tenga una alta apertura numérica. El que se muestra aquí es un objetivo de aceite de 100x con una apertura numérica de 1.3.

Luego, use una hoja de afeitar y un portaobjetos de microscopio como borde recto para cortar tiras de película de parafina de plástico de 3 milímetros de ancho. Coloque dos de las tiras de película de parafina de plástico a 3 milímetros de distancia en un cubreobjetos limpio de 22 por 22 milímetros. Luego, coloque un cubreobjetos de 18 por 18 milímetros encima de las tiras para formar un canal.

Transfiera el cubreobjetos a un bloque de calor a 100 grados centígrados durante 10 a 30 segundos para que la película de parafina forme un canal sellado. Con una pipeta, fluya 50 microgramos por mililitro de un anticuerpo anti-rodamina por perfusión e incube el portaobjetos durante 10 minutos.

Después de la incubación, lave el canal cinco veces con BRB80 filtrado. Luego, fluya en poloxámero 407 al 1% en el BRB80 filtrado para bloquear la superficie contra la unión inespecífica e incube el portaobjetos durante 10 minutos. Nuevamente, lave el canal cinco veces con BRB80 filtrado.

Para evitar que la muestra se seque, agregue dos gotas del BRB80 filtrado en los extremos del canal y agregue más tampón según sea necesario. Coloque la muestra en la platina del microscopio y encienda la fuente de luz de epiiluminación. Concéntrese en el borde de la película de parafina para encontrar la superficie de la muestra y, a continuación, mueva el campo para establecer la vista en el centro de la cámara. Observará múltiples superficies a medida que el objetivo se mueve hacia arriba y hacia abajo debido a la reflexión posterior de la luz de la óptica dentro de la trayectoria óptica.

A continuación, centre el diafragma de campo en el campo de visión cerrándolo a la mitad y usando los tornillos de ajuste Una vez que el diafragma esté correctamente alineado, vuelva a abrirlo. Luego, deslice la lente Bertrand para ver el plano focal posterior, también conocido como la pupila de salida del objetivo.

Cierre el diafragma de apertura más allá de los bordes de la pupila de salida y use los tornillos de ajuste para centrar el diafragma de apertura con respecto a la pupila de salida. Vuelva a verificar abriendo el diafragma de apertura y haciendo coincidir sus bordes con los de la pupila de salida. Luego, ajuste el diafragma de apertura a aproximadamente 2/3 de la apertura numérica del objetivo.

Para obtener imágenes de la dinámica de los microtúbulos utilizando tubulina cerebral, comience ajustando la temperatura del calentador de la muestra a 37 grados Celsius. Con una pipeta, haga fluir 10 microlitros de semillas de microtúbulos estabilizadas con GMPCPP y controle su unión a la superficie mediante imágenes vivas de la superficie. Una vez que se unan de 10 a 20 semillas dentro del campo de visión, lave la muestra usando el doble del volumen del canal de BRB80 precalentado y filtrado.

A continuación, fluya en 10 microlitros de la mezcla de polimerización.

Para medir el crecimiento de los microtúbulos, configure un lapso de tiempo utilizando el software de adquisición para adquirir una imagen cada 5 segundos durante 15 minutos. Mejore el contraste adquiriendo una imagen promedio de 10 en cada punto de tiempo. Adquiera imágenes de fondo como se muestra en la sección anterior. Calcule la mediana yendo a Imagen, seleccionando Pila, luego Proyecto Z, luego Mediana. Reste el fondo correspondiente yendo a Proceso, yendo a Calculadora de imágenes y eligiendo Restar en el menú desplegable. Asegúrese de que la opción de resultado flotante de 32 bits esté marcada.

Para la contracción de microtúbulos, adquiera imágenes a 100 fotogramas por segundo ajustando el retardo de tiempo a cero y manteniendo el tiempo de exposición en 10 milisegundos.