Imágenes cuantitativas tridimensionales de fase para caracterizar subtipos de linfocitos

Cargue una suspensión de subtipo de linfocitos en una cámara de imágenes.

Coloque la cámara en la platina del microscopio de imágenes de fase cuantitativas 3D.

Ajuste los parámetros del microscopio y el plano focal para obtener imágenes óptimas.

Durante las imágenes de linfocitos, el rayo láser se divide en haces de referencia y de muestra.

El dispositivo de microespejo digital, que cuenta con una matriz de microespejos en la trayectoria del haz de muestra, permite que el haz gire 360 grados alrededor del eje óptico.

Cada haz que pasa a través del linfocito sufre un cambio de fase basado en las variaciones del índice de refracción dentro de la célula.

Los haces de muestra y de referencia resultantes se recombinan, formando un holograma 2D.

Se captura una secuencia de hologramas que contienen información de fase y amplitud desde diferentes ángulos a través de la rotación del haz alrededor del linfocito.

Adquiera múltiples hologramas de fondo con diferentes ángulos de iluminación, excluyendo linfocitos.

Utilizando el algoritmo de tomografía de difracción, reconstruya los hologramas en un tomograma de índice refractivo 3D, proporcionando información morfológica y bioquímica de los linfocitos sin necesidad de etiquetado.

Para obtener imágenes óptimas, diluya cada muestra de células a una concentración de 180 células por microlitro de medio RPMI e inyecte lentamente 120 microlitros de la primera muestra diluida en una cámara de imágenes. Después de confirmar la falta de burbujas dentro de la cámara, coloque una gota de agua destilada en la lente del objetivo de un microscopio de fase cuantitativa 3D y coloque la cámara de imágenes en la etapa de traslación del microscopio. Ajuste la platina para que la muestra se alinee con la lente del objetivo y haga clic en Enfoque y superficie en la pestaña Calibración de la perspectiva del microscopio del software de imágenes, para ajustar las posiciones axiales del objetivo y las lentes del condensador, respectivamente.

Haga clic en Modo automático para alinear el objetivo y las lentes del condensador. Para optimizar la alineación, abra el modo de escaneo y ajuste manualmente las lentes para alinear el patrón del dispositivo de microespejo digital con el centro. Luego, regrese al modo normal y ajuste la etapa de traslación para ubicar una celda en el campo de visión. Ajuste la posición axial de la lente del objetivo para encontrar el plano focal hasta que el límite de la muestra visualizado en la pantalla sea casi invisible.

Es importante ajustar perfectamente el enfoque de la célula para generar una tomografía RI 3D óptima. Si la imagen no se toma correctamente, la reconstrucción 3D se verá afectada, lo que resultará en un tomograma ruidoso.

Ajuste la fase de traslación para buscar una ubicación sin celda y haga clic en Calibrar para medir varios hologramas 2D con diferentes ángulos de iluminación. Ajuste la etapa de traducción para ubicar una celda en el centro del campo de visión y, en la pestaña Adquisición, asigne un nombre a la muestra que se está visualizando.

Haga clic en Instantánea 3D para medir los hologramas de la celda utilizando los mismos ángulos de iluminación que para los hologramas 2D que se acaban de medir. Cuando los datos adquiridos aparezcan en el panel de administración de datos, haga clic con el botón derecho en Datos y haga clic en Procesar para reconstruir un tomograma de índice de refracción 3D a partir de los hologramas 2D utilizando el algoritmo de tomografía de difracción implementado en el software de imágenes. Después de la creación de imágenes, en el panel Administración de datos, haga clic con el botón derecho en los datos y haga clic en Abrir para visualizar los datos.

Haga clic en el centro de la celda para cambiar su posición y haga clic en Tomograma de RI en el panel Administrador de datos. En la pestaña Ajuste preestablecido, haga clic en Cargar y haga doble clic en lymphocytes.xml, que es una función de transferencia predefinida proporcionada por el software de imágenes para visualizar el tomograma de acuerdo con las distribuciones de RI 3D. Desplácese con el mouse para acercar y arrastre la celda para rotarla en cualquier dirección.