Microscopía de luz de hoja para la visualización tridimensional de las células inmunes humanas

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como cómo se comportan exactamente las células inmunitarias en un contexto fisiológicamente relevante, como cómo buscar células objetivo de manera eficiente en un entorno tridimensional. La principal ventaja de este método es generar una lámina de luz muy delgada para iluminar solo el plano focal sin afectar las celdas fuera del plano. Esto permite una velocidad de adquisición muy rápida con una reducción pronunciada del blanqueo y la fotocitotoxicidad.

El Dr. Renping Zhao, un postdoctorado de mi laboratorio, demostrará este procedimiento. Para comenzar, bajo una campana de cultivo celular, transfiera 400 microlitros de solución madre de colágeno refrigerada a un tubo estéril de 1,5 mililitros. Agregue lentamente 50 microlitros de PBS 10X frío.

A continuación, mezcle la solución inclinando suavemente el tubo. Agregue 48 microlitros de hidróxido de sodio 0.1 molar a la solución de colágeno para ajustar el pH a 7.2 a 7.6. Use tiras reactivas de pH para determinar el valor de pH de la mezcla.

Agregue dos microlitros de agua destilada desionizada estéril para llevar el volumen final a 500 microlitros. Mezcle bien y almacene la solución de colágeno en hielo o a cuatro grados centígrados hasta su uso posterior. Después de marcar con fluorescencia las células vivas de acuerdo con el protocolo de texto, bajo la cubierta de cultivo celular, transfiera una vez 10 a la sexta célula a un tubo estéril de 1,5 mililitros.

Centrifugar el tubo a 200 veces g durante ocho minutos. A continuación, deseche el sobrenadante y utilice 200 microlitros de medio de cultivo para resuspender el pellet. Agregue 85.9 microlitros de la solución de colágeno neutralizado a la suspensión celular y mezcle adecuadamente para alcanzar una concentración de colágeno de 2.5 miligramos por mililitro.

Deje la mezcla de colágeno celular en hielo en la capucha. A continuación, inserte un émbolo en el capilar correspondiente hasta que el émbolo sobresalga un milímetro del capilar. A continuación, humedece el émbolo sumergiéndolo en el medio de cultivo.

Saltarse este paso puede resultar en la introducción indeseable de burbujas de aire entre el émbolo y la matriz de colágeno. Sumerja el capilar en la mezcla de colágeno celular y tire lentamente del émbolo hacia atrás de 10 a 20 milímetros. Luego, con una botella rociadora de etanol al 70%, humedezca una toalla de papel y úsela para limpiar la pared exterior del capilar para eliminar la solución de colágeno restante.

Ahora use arcilla para modelar para montar el capilar en la pared interna de un tubo de cinco mililitros. Empuje la mezcla de colágeno celular hasta el borde del capilar. A continuación, incubar el tubo con el capilar a 37 grados centígrados y 5%CO2 durante una hora para polimerizar el colágeno.

Después de la incubación, agregue uno o dos mililitros de medio de cultivo al tubo. A continuación, expulse con cuidado la varilla de colágeno polimerizado en el medio hasta que aproximadamente la mitad del colágeno quede colgando en el medio. Incuba el capilar durante otros 30 minutos.

Para llevar a cabo la microscopía de lámina ligera, ensamble la cámara de muestras de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de encender el microscopio y la incubadora si realiza imágenes en vivo, coloque el capilar en la cámara de muestras, ubique la muestra y encuentre el área de interés para la adquisición de imágenes. Activa los láseres correspondientes.

A continuación, ajuste la potencia del láser y el tiempo de exposición. Establezca también el tamaño de paso de la pila Z, las posiciones inicial y final de la pila Z y el intervalo de tiempo para la obtención de imágenes de células vivas. A continuación, inicie la adquisición de la imagen.

Transfiera un mililitro de paraformaldehído al 4% en PBS a un tubo de cinco mililitros debajo de una cubierta química. A continuación, sumerja el capilar con el colágeno polimerizado en la solución de paraformaldehído y utilice arcilla para modelar para montar el capilar en la pared interna del tubo. Presione suavemente el émbolo hasta que la mitad de la varilla de colágeno quede colgando en la solución de paraformaldehído.

A continuación, tire del émbolo hacia atrás para llevar la varilla de colágeno de vuelta al capilar. Retire el capilar del tubo y deseche el paraformaldehído. Monte el capilar en un tubo nuevo y agregue un mililitro de PBS.

Asegúrese de que el capilar esté sumergido en el PBS. Presione suavemente el émbolo hasta que la mitad de la varilla de colágeno quede colgando en la solución e incube durante cinco minutos. Tire hacia atrás del émbolo para recoger la varilla de colágeno en el capilar.

A continuación, sustituya el PBS por un PBS fresco y expulse la varilla de colágeno a la solución. Después del tercer lavado, agregue uno o dos mililitros de tampón de permeabilización de bloqueo en el tubo. Expulse la varilla de colágeno en la solución e incube el tubo a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos.

Reemplace el tampón de permeabilización de bloqueo con 200 a 500 microlitros de anticuerpos primarios en el tampón de permeabilización de bloqueo e incube la varilla de colágeno sumergida en la solución durante una hora. Después de usar PBST para lavar la varilla de colágeno tres veces, incube la varilla en anticuerpos secundarios en tampón de permeabilización de bloqueo a temperatura ambiente durante una hora. Después de tres lavados más en PBS, tire de la varilla de colágeno hacia el capilar y mantenga la muestra en PBS hasta la obtención de imágenes.

Como se ve en esta película, durante la migración, las células CTL transfectadas con una proteína de fusión de actina EGFP formaron protuberancias principales en forma de limón, bordeadas por finas estructuras en forma de huso. Las trayectorias de los CTL se ilustran aquí con la velocidad y la persistencia o el desplazamiento dividido por la longitud total de la pista como parámetros medidos. Las velocidades oscilan entre 0,01 y 0,19 micras por segundo con una diferencia de casi 20 veces y la persistencia oscila entre cero y 0,7.

Esta figura muestra células CTL fijas en gel de colágeno 3D teñidas para perforina-1 endógena y actina. La muestra se iluminó desde un solo lado o desde ambos lados. Desde diferentes posiciones Z, las células se tiñen uniformemente, lo que indica una buena penetración de los anticuerpos en los geles de colágeno.

El CTL fijo exhibió la misma morfología que las células vivas, lo que indica que la morfología se mantiene bien con este protocolo. Al intentar este procedimiento, es muy importante recordar evitar las burbujas de aire y ajustar correctamente el valor del pH. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la tinción de células vivas con moléculas de superficie particulares, para responder a preguntas adicionales, como cómo correlacionar el comportamiento celular con la diferenciación o con diferentes subtipos de células, o para investigar la interacción célula-célula y el destino celular.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular, la inmunología y la investigación del cáncer exploraran el comportamiento celular, el destino celular, la diferenciación y la interacción celular en el sistema in vitro más relevante fisiológicamente. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar muestras con células incrustadas en una matriz de colágeno tridimensional, cómo visualizar muestras usando microscopía de lámina de luz, ya sea en vivo o fija, y cómo rastrear la migración celular en 3D.