Name: Microscopía de luz de hoja para la visualización tridimensional de las células inmunes humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Aprende a visualizar células inmunes humanas en matrices de colágeno tridimensionales mediante microscopía de hoja de luz. Este protocolo permite rastrear la migración celular con alta resolución y mínima fototoxicidad.

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Agradecemos al Instituto de Hemostaseology clínica y medicina de la transfusión para proporcionar sangre dispensadora de aceite; Carmen Hässig y Cora Hoxha excelente ayuda técnica. Agradecemos a Jens Rettig (Universidad de Saarland) para el vector modificado pMAX, Roland Wedlich-Söldner (Universidad de la Münster) para la construcción original de la LifeAct-Ruby y Christian Junker (Universidad de Saarland) para generar la construcción de LifeAct-mEGFP. Este proyecto fue financiado por Sonderforschungsbereich 1027 (proyecto A2 B.Q.) y 894 (proyecto A1 M.H.). El microscopio de luz de hoja fue financiado por DFG (GZ: INST 256/4 19 1 FUGG).

Investigación realizada para este estudio con el material humano (cámaras sistema reducción de leucocitos de donantes de sangre humana) está autorizado por el Comité de ética local (declaración de 16.4.2015 (84/15; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) y sigue las pautas correspondientes.
1. preparación de solución de colágeno neutralizado (500 μl)
<ol><li>Transfiera 400 μL de solución stock de colágeno refrigerado (10,4 mg/mL) a un tubo de 1,5 mL estéril debajo de la campana de la cultura de célula. Lentamente, añada 50 μl de frío 10 x PBS (pH 7.0-7.3) a 400 μL de solución stock de colágeno refrigerados. Mezcle la solución por mosaico suavemente el tubo. Nota: Todas las medidas en la parte 1 deben realizarse bajo una campana de cultivo celular.</li>
	<li>Añadir 8 μl de 0,1 M NaOH en 500 μl de la solución de colágeno de 1.1. para ajustar el pH a 7.2-7.6. Utilizar tiras reactivas de pH (rango de pH: 6-10) para determinar el valor de pH de la mezcla. Nota: Los volúmenes pueden variar para diferentes lotes de colágeno. Solución de NaOH tiene que mezclarse lentamente para evitar burbujas de aire. La mezcla debe mantenerse en hielo para evitar la gelificación de colágeno.</li>
	<li>Añadir 2 μl de ddH estéril2O para hacer el volumen final de 500 μl. Mezcle bien y almacene esta solución de colágeno (8,32 mg/mL) en hielo o a 4 ° C hasta su uso posterior. Nota: En esta condición, neutralizado colágeno puede utilizarse para h. 24 alícuotas no se recomiendan para evitar burbujas de aire.</li>
</ol>2. preparación para microscopía de fluorescencia de luz-hoja con capilares
<ol><li>Etiqueta fluorescente las células vivas de interés con los tintes fluorescentes primaria deseada15 o proteínas fluorescentes11 como se describió anteriormente.</li>
	<li>Transferencia de 1 × 106 de células en un tubo de 1,5 mL estéril bajo una campana de cultivo celular. Centrifugar el tubo a 200 x g por 8 min descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 μL de medio de cultivo. Nota: La densidad celular de 5 x 106 células/mL se recomienda para la visualización de la migración de células inmunes humanas, especialmente de los linfocitos T citotóxicos (CTL) y las células asesinas naturales (NK).</li>
	<li>Añadir 85,9 μl de solución de colágeno neutralizado de 1.3. en la suspensión celular de 2.2. y mezclar correctamente para llegar a una concentración de 2,5 mg/mL de colágeno. Dejar la mezcla de colágeno de la célula en el hielo en la campana. Nota: Suponga que la concentración de colágeno es N mg/mL, el volumen de neutralizado solución de colágeno (para la suspensión de la célula de 200 μL) = 200 × N /(8.32-N)</li>
	<li>A continuación, poner el pistón correspondiente en el capilar (diámetro interior ~ 1 mm) hasta que el émbolo es de 1 mm en el tubo capilar. Moje el émbolo por inmersión en medio de cultivo (figura 1A). Nota: Este paso puede ayudar a prevenir las burbujas de aire cuando el tubo capilar se sumerge en la mezcla de colágeno de la célula. El capilar y el buzo no debe de ser estéril.</li>
	<li>Sumerja el capilar en la mezcla de colágeno de la célula de 2.3. Tire lentamente del émbolo hacia atrás para 10-20 mm (figura 1B). Limpie la pared exterior del tubo capilar con una toalla de papel humedecida con rocío de etanol 70% para eliminar la solución restante de colágeno.</li>
	<li>Monte el tubo capilar con plastilina en la pared interior de un tubo de 5 mL y empuje la mezcla de colágeno de la célula hacia el borde del tubo capilar (figura 1).</li>
	<li>Mantenga el tubo capilar a 37 ° C con 5% CO2 para 1 h para la polimerización de colágeno.</li>
	<li>Añadir el medio de cultivo (aproximadamente 1-2 mL) a un tubo de 5 mL. Presione con cuidado la varilla de colágeno polimerizado por en medio y alrededor de 3/4 del colágeno en el medio (figura 1).</li>
	<li>Mantenga el tubo capilar, así, a 37 ° C con 5% CO2 para otro 30 min para equilibrar la barra del colágeno con el medio. Nota: Luego, la barra de colágeno puede ser jalada hacia atrás a capilar y culta más antes de seguir usándolo.</li>
</ol>3. imagen adquisición mediante microscopía de luz hoja
<ol><li>Conjunto de la cámara de la muestra según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Encienda la incubación y el microscopio para calentar la cámara de la muestra a 37 ° C (para celular directo imágenes solamente).</li>
	<li>Coloque el capilar en el compartimiento de muestra y localizar la muestra para encontrar el área de interés para adquisición de imágenes.</li>
	<li>Activar el oambos correspondiente. Establecer los siguientes ajustes: láser de potencia, tiempo de exposición, tamaño de paso de la posición z-stack, el inicio y el final de z-stack y el intervalo de tiempo para la proyección de imagen de células vivas. Nota: por ejemplo, la muestra en la figura 2 era reflejada cada 40 s por 6 h a 37 ° C con un tamaño de paso de 1 μm (grueso total: 538 μm). La energía del laser fue 1% con un tiempo de exposición de la Sra. 30 el tamaño del pixel en dirección x-y es 0.23 μm.</li>
	<li>Iniciar la adquisición de la imagen.</li>
</ol>4. automatizado de análisis de seguimiento
<ol><li>Abrir el convertidor de archivo, haga clic en Agregar archivos para seleccionar los archivos imagen que se convertirá en el formato de archivo de software (*.ims). Haga clic en examinar y seleccione una carpeta para guardar los archivos convertidos. Haga clic en Inicio todos.</li>
	<li>Abra el software de análisis. Haga clic en superar. Ir a archivo y haga clic en abrir, luego seleccionar el archivo imagen a ser analizada. Nota: Si el tamaño del archivo es grande este paso puede tomar tiempo. Archivos mayores de 1 Terabyte (TB) no se recomiendan para un experimento simple como el proceso de archivos tan grandes son capacidad computacional altamente exigentes.</li>
	<li>Haga clic en agregar nuevos puntos. Marque la casilla Proceso toda imagen finalmente. Haga clic en siguiente.</li>
	<li>Introduzca las coordenadas x e y (en píxeles) para definir la región de interés. Introduzca el número de marcos de tiempo y posición z para analizar. Haga clic en siguiente.</li>
	<li>Seleccione el canal de destino, que contiene los objetos a ser seguido, en la lista desplegable de Canales de origen. Ingrese Estimado xy diámetro (en μm). Haga clic en siguiente. Nota: Estimado xy el diámetro es el diámetro promedio en la dimensión de x-y de los objetos para ser rastreados.</li>
	<li>Haga clic en calidad. Definir un umbral, en el que debe incluirse la mayoría de las células (objetos). Haga clic en siguiente.</li>
	<li>Elija el algoritmo deseado (se recomiendaMovimiento autorregresivo ). Introduzca la distancia máxima (se recomienda20 μm ) y el tamaño máximo vacío (se recomienda 3 o 2). Haga clic en todo el proceso de la imagen finalmente. Nota: Distancia de Max y Max brecha tamaño son dos umbrales para romper las pistas. Más concretamente, en dos cuadros continuos cuando la distancia entre el objeto mismo supera la distancia máxima, este objeto en el fotograma más adelante se considerará como un nuevo objeto. A veces durante la adquisición, el mismo objeto puede desaparecer por unos marcos y apareces otra vez. En este caso, solamente cuando este objeto vuelve a aparecer en el tamaño máximo del espacio, se considerará como el mismo objeto.</li>
	<li>Tipo de filtro , haga clic en y elija la opción de excluir pistas no deseadas. Nota: Este paso es opcional.</li>
	<li>Haga clic en siguiente y haga clic en Finalizar. Nota: Este paso puede tardar horas hasta días dependiendo el rendimiento informático.</li>
	<li>Haga clic en Editar pistas y elija Deriva correcta. Seleccionar el algoritmo adecuado (se recomiendaDeriva traslacional ). Seleccione el deseado Tamaño de conjunto de datos de resultados (Nuevo tamaño igual al tamaño actual se recomienda). Haga clic en Aceptar. Nota: Este paso sólo es necesario cuando el colágeno se desvió durante la adquisición de la imagen.</li>
	<li>Haga clic en estadísticas y elija Configurar lista de estadísticas valores visibles. Compruebe las opciones de interés para ser exportaron (por ejemplo, coordenadas, velocidad y así sucesivamente). Haga clic en Aceptar.</li>
	<li>Haga clic en Todas las estadísticas de exportación a archivo e introduzca el nombre de archivo.</li>
</ol>5. fijación y la inmunofluorescencia, tinción de células en Matrices de colágeno
<ol><li>Transferencia 1.000 μl de paraformaldehído al 4% (PFA, en PBS) en un tubo de 5 mL bajo una campana química. Nota: PFA debe ser equilibrado a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sumerja el capilar con colágeno polimerizado de 2.9. en la solución de la PFA (para ~ 5 m m) y Monte el tubo capilar en la pared interna del tubo de 5 mL con plastilina (como se muestra en la figura 1).</li>
	<li>Presione el émbolo suavemente hasta la mitad de la varilla de colágeno está colgando en la solución de la PFA (figura 1). Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 20 minutos.</li>
	<li>Tire hacia atrás el émbolo para conseguir la barra de colágeno dentro del tubo capilar. Sacar el tubo capilar y deseche PFA.</li>
	<li>Montar el tubo capilar en un tubo nuevo y añadir 1 mL de PBS. Asegúrese de que el tubo capilar se sumerge en el PBS.</li>
	<li>Presione el émbolo suavemente hasta la mitad de la varilla de colágeno está colgando en la solución. Monte el tubo capilar en la pared interior con plastilina.</li>
	<li>Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 5 minutos.</li>
	<li>Repita el 5.4. -5.7 por otro 2 veces.</li>
	<li>Tire hacia atrás el émbolo para conseguir la barra de colágeno dentro del tubo capilar. Descartar el PBS. Transferencia de 1-2 mL de tampón de bloqueo/permeabilización (PBS + BSA de 1% + 0.1% de tensioactivo no iónico) en el tubo y repetir 5.6. Nota: La BSA (1%) puede ser sustituida por 5% de suero de los animales en que AB secundario creció.</li>
	<li>Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 30-60 min.</li>
	<li>Tire hacia atrás el émbolo para conseguir la barra de colágeno dentro del tubo capilar. Deseche el buffer de permeabilización. Transfiera 200-500 μl del anticuerpo primario en buffer de bloqueo/permeabilización y expulsa la varilla en la solución.</li>
	<li>Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 1 h.</li>
	<li>Lave la varilla del colágeno 3 veces con SAFT (PBS + 0.1-% de tensioactivo no iónico) como descrito en 5.4. -5.8.</li>
	<li>Incubar la varilla en el anticuerpo secundario en tampón de bloqueo/permeabilización durante 1 h a temperatura ambiente. Impedir que la luz.</li>
	<li>Lave la varilla del colágeno 3 veces con PBS descrito en 5.4. -5.8.</li>
	<li>Tire hacia atrás el émbolo para conseguir la barra de colágeno dentro del tubo capilar. Mantenga las muestras en PBS hasta que la proyección de imagen.</li>
	<li>Análisis de las muestras como se describe en 3.</li>
</ol>

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Los autores no declaran conflicto de intereses financiero o comercial.

Mayoría en vitro ensayos se llevan a cabo sobre una superficie 2D, por ejemplo en las placas de cultivo celular, platos de Petri o en cubreobjetos, mientras que en vivo las células, especialmente las células inmunes, sobre todo un microambiente 3D la experiencia. Emergentes de la evidencia muestran que los patrones de migración de células inmunes diferencian entre 2D y 3D escenarios17. Por otra parte, los perfiles de expresión de las células tumorales también son diferentes en 2D...

Más conocimiento acerca de la migración las células viene de 2D1,2,3, los experimentos que se realizan normalmente en una superficie de vidrio o plástico de una cultura/proyección de imagen de plato. Sin embargo, una situación fisiológica requiere, en la mayoría de los casos, un microambiente 3D, en el que la matriz extracelular (ECM) juega un papel decisivo. ECM no sólo proporciona lo esencial de la estructura en 3D para mantener la morfología de la célula adecuada sino también ofrece señales de supervivencia o las señales direccionales para un óptimo funcionamiento de muchas células4,5 . Por lo tanto, un entorno 3D es necesario para identificar mejor las funciones celulares y comportamiento en un entorno que mejor reflejan el contexto fisiológico.
En el cuerpo humano, la mayoría de las células especialmente las células inmunes, ejercen sus funciones bajo un escenario 3D. Por ejemplo, las células T activadas patrullan tejidos buscando las células blanco, células ingenuas T migran a través de los ganglios linfáticos en busca de sus cognadas células presentadoras de antígeno, durante la cual el modo de migración y las máquinas se adaptan a las correspondientes extracelular medio ambiente3,6,7. El gel de colágeno 3D ha sido ampliamente utilizado como un 3D bien establecidas y bien caracterizadas de la célula cultura sistema8,9,10. Nuestro trabajo previo demuestra que los linfocitos humanos primarios son muy móviles y migran a una velocidad promedio de aproximadamente 4.8 μm/min en una matriz de colágeno de 0.25%11. Reordenamiento del citoesqueleto desempeña un papel clave en la migración celular del12. La acumulación de pruebas demuestra que los linfocitos no se aplican solamente un solo modo de la migración pero pueden alternar con cierto comportamiento de migración dependiendo de la ubicación, microambiente, citoquinas, gradientes quimiotácticos, señales extracelulares que tune la comportamiento migratorio en diferentes formas 3.
Para analizar con fiabilidad las funciones inmunes celulares y comportamiento, por ejemplo, migración, formación de las protuberancia o transporte vesicular, es de gran ventaja ser capaz de adquirir imágenes en volúmenes relativamente grandes de 3D de manera rápida y confiable. Para la proyección de imagen 3D, la tecnología de microscopia de luz hoja recientemente desarrollado (también conocida como microscopía de iluminación solo plano) ofrece una solución satisfactoria13,14. Durante la adquisición de imágenes, se genera una hoja fina de luz estática para iluminar la muestra. De esta manera, en el plano de enfoque, un área grande se puede iluminar al mismo tiempo sin afectar las células off-plane. Esto permite una alta velocidad con un blanqueo drásticamente reducida y la fotocitotoxicidad. En este papel, describimos cómo visualizar las células inmunes humanas primarias mediante microscopía de luz de hoja y cómo analizar la migración en un escenario 3D.

<table><tbody><tr><td>Fibricol, solución de colágeno bovino</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>&nbsp;#5133-20ML Matriz de</td><td>colágeno</td></tr><tr><td>0,5 M Solución de NaOH</td><td>Merck</td><td></td><td>1091381000 para neutralizar la solución de Fibricol</td></tr><tr><td>Agarosa de fusión ultra baja Affymetrix</td><td></td><td>32821-10GM Preparación de</td> muestras en células T CD8 humanas intactas de baja <td>c[Col]</td></tr><tr><td>Dynabeads Kit de células T CD8 humanas intactas</td><td>Thermo Fisher</td><td>11348D</td><td>Aislamiento de linfocitos T CD8+ humanos primarios de PBMC</td></tr><tr><td>Dynabeads Activador T humano CD3/CD28 para la expansión y activación de linfocitos T</td><td>Thermo Fisher</td><td>11132D</td><td>Activación de poblaciones de CTL</td></tr><tr><td>Interleucina-2 recombinante humana</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHC0023</td><td>Estimulación de CTL</td></tr><tr><td>P3 cultivado Kit de solución primaria</td><td>Lonza</td><td>V4XP-30XX</td><td>Transfección</td></tr><tr><td>&alpha;-PFN1 anticuerpo, conejo, IgG</td><td>Abcam</td><td>ab124904</td><td>IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A22284</td><td>IF</td></tr><tr><td>CellMask Orange Tinción de membrana plasmática</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10045</td><td>Etiqueta de células fluorescentes</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-250mL</td><td>IF</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Eurobio</td><td>018774</td><td>IF</td></tr><tr><td>DPBS Solución salina tamponada con fosfato Dulbecco</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190250</td><td>IF</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A9418-100G</td><td>IF</td></tr><tr><td>Cabra y alfa; Conejo 568, IgG, conejo</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11011</td><td>IF</td></tr><tr><td>Lightsheet Z.1 (Microscopía de lámina ligera)</td><td>Zeiss</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Campana de cultivo celular</td><td>Thermo Fisher</td><td>HeraSafe KS</td> Incubadora de <td></td></tr><tr><td>cultivo celular HERACell 150i&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Centrífugas 5418 y 5452</td><td>Eppendorf</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Pippettes</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039, 3123000020, 3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta</td><td>VWR</td><td>89079-444, 89079-436, 89079-452&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>&nbsp; 62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Capilares 50 y micro; L</td><td>VWR (Marca)</td><td>613-3373</td><td>Zeiss Preparación de muestras LSFM</td></tr><tr><td>Émbolo para capilares</td><td>VWR (Marca)</td><td>BRND701934</td><td>"Sellos con punta de teflón" Preparación de muestras LSFM</td></tr><tr><td>MColorPhast Puntas de pH</td><td>Merck</td><td>1095430001</td><td>para probar el pH de las jeringas neutralizadas Fibricol</td></tr><tr><td>BD Plastipak 1mL BD</td><td>Z230723</td><td>&nbsp; ALDRICH</td><td>Preparación alternativa de muestras</td></tr><tr><td>Plastilina (Hasbro Play-Doh A5417EU7)</td><td>Play-Doh</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Convertidor de archivos Imaris</td><td>Bitplane</td><td>disponible en http://www.bitplane.com&nbsp;</td><td>Convertir archivos de imagen a formato de archivo Imaris</td></tr><tr><td>Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)</td><td>Bitplane</td><td>disponible en http://www.bitplane.com&nbsp;</td><td>Análisis de datos de imágenes 3D y 4D</td></tr></tbody></table>

microscopía de luz de hoja para la visualización tridimensional de las células inmunes humanas

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

In vivo, la activación, proliferación y función de las células inmunes todos se producen en un entorno tridimensional (3D), por ejemplo en los ganglios linfáticos o tejidos. Hasta la fecha, la mayoría en vitro sistemas se basan en dos dimensiones (2D) las superficies, como las placas de cultivo celular o cubreobjetos. A óptimo imitan las condiciones fisiológicas en vitro, utilizamos una matriz de colágeno 3D simple. Colágeno es uno de los principales componentes de la matriz extracelular (ECM) y ha sido ampliamente utilizado para constituir matrices de 3D. Para la proyección de imagen 3D, la tecnología de microscopia de luz hoja recientemente desarrollado (también conocida como microscopía de iluminación solo plano) se presenta con alta velocidad, la profundidad de penetración grande, blanqueo bajo y fotocitotoxicidad. Además, microscopia de la hoja de luz es particularmente ventajosa para medición a largo plazo. Aquí se describe un protocolo optimizado cómo configurar y manejar las células inmunes humanas, por ejemplo primario humano los linfocitos T citotóxicos (CTL) y las células natural killer (NK) en la matriz de colágeno 3D para uso con la microscopia de luz-hoja para la proyección de imagen de células vivas y muestras fijadas. Se presentan el procedimiento de adquisición de imágenes y análisis de la migración de la célula. Especial atención se da a resaltar pasos críticos y los factores para preparación de muestras y análisis de datos. Este protocolo puede ser empleada para otros tipos de suspensión de células en una matriz de colágeno 3D y no se limita a las células inmunes.

Formación saliente durante la migración de la célula de T es un proceso altamente dinámico, que es dependiente de actina. Para visualizar la formación saliente del CTL humana primaria, nos transfectadas transitoriamente una proteína mEGFP fundido para etiquetar el citoesqueleto de actina en CTL como se describe antes del11. Un día después de la transfección, las células fueron embebidas en la matriz de colágeno. Pilas de imágenes fueron adquiridas cada 40 s con un ...

Aquí, presentamos un protocolo para visualizar células inmunes embebidas en una matriz de colágeno (3D) tridimensional mediante microscopía de luz de hoja. Este protocolo también explica cómo realizar el seguimiento de la migración celular en 3D. Este protocolo puede ser empleada para otros tipos de suspensión de células en la matriz 3D.

Microscopía de luz de hoja para la visualización tridimensional de las células inmunes humanas

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como cómo se comportan exactamente las células inmunitarias en un contexto fisiológicamente relevante, como cómo buscar células objetivo de manera eficiente en un entorno tridimensional. La principal ventaja de este método es generar una lámina de luz muy delgada para iluminar solo el plano focal sin afectar las celdas fuera del plano. Esto permite una velocidad de adquisición muy rápida con una reducción pronunciada del blanqueo y la fotocitotoxicidad.El Dr. Renping Zhao, un postdoctorado de mi laboratorio, demostrará este procedimiento. Para comenzar, bajo una campana de cultivo celular, transfiera 400 microlitros de solución madre de colágeno refrigerada a un tubo estéril de 1,5 mililitros. Agregue lentamente 50 microlitros de PBS 10X frío.A continuación, mezcle la solución inclinando suavemente el tubo. Agregue 48 microlitros de hidróxido de sodio 0.1 molar a la solución de colágeno para ajustar el pH a 7.2 a 7.6. Use tiras reactivas de pH para determinar el valor de pH de la mezcla.Agregue dos microlitros de agua destilada desionizada estéril para llevar el volumen final a 500 microlitros. Mezc

light-sheet-microscopy-for-three-dimensional-visualization-human

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este video, describimos la técnica de microscopía de lámina de luz reticular para visualizar las interacciones entre las células T vivas y las células presentadoras de antígenos. El método consiste en enfocar una lámina de luz reticular ultradelgada en un par de células que interactúan para obtener una serie de imágenes bidimensionales, que se combinan para obtener imágenes cuatridimensionales de alta resolución que revelan la dinámica espacio-temporal de la interacción célula-célula.

Microscopía de lámina de luz reticular para visualizar las interacciones receptor-ligando en células vivas

De alta resolución de imagen intravital con mejor contraste de hasta 120 m de profundidad en los ganglios linfáticos de ratones adultos se consigue modular espacialmente el patrón de excitación de un multi-focal del microscopio de dos fotones. En 100 m de profundidad se midió resoluciones de 487 nm (laterales) y 551 nm (axial), eludiendo así los límites de dispersión y difracción.

Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

Este protocolo se describe la configuración de un microscopio de lámina de luz y su aplicación para la visualización in vivo de C. elegans embriones.

Configuración de un microscopio de luz Hoja simple para<em&gt; En Toto</em&gt; Imágenes de<em&gt; C. elegans</em&gt; Desarrollo

Un módulo para la iluminación microscopía de plano único (SPIM) se describe que se adapta fácilmente a un microscopio de campo amplio invertida y optimizado para cultivos celulares 3-dimensionales. La muestra se encuentra dentro de un capilar rectangular, y a través de un sistema de microfluidos colorantes fluorescentes, agentes farmacéuticos o medicamentos puede ser aplicado en pequeñas cantidades.

Módulo de iluminación solo plano y Aproximación Micro-capilar para un microscopio de campo amplio

Aquí, describimos un completo flujo de trabajo para el análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmunes entre las células de T humanas primarias y células presentadoras de antígeno. El método se basa en imágenes por citometría de flujo, que permite la adquisición y evaluación de varias imágenes de miles de células en un período relativamente corto de tiempo.

Análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmune en el sistema humano utilizando imágenes de citometría de flujo

En este sentido, describimos un microscopio de luz para visualizar el infiltrado de leucocitos CD45 + cardíaco en un modelo murino de miocarditis fulminante aséptica, que es inducido por el tratamiento de la toxina diftérica intratraqueal de ratones CD11c.DTR.

Visualización Cuantitativa del Infiltrado de Leucocitos en un Modelo Murino de Miocarditis Fulminante por Microscopía de Hoja Ligera

Este estudio utiliza una técnica de microscopía (LSFM) de hoja de luz fluorescencia iluminación doble cara combinada con la compensación óptica para estudiar el corazón murino.

Hoja de luz fluorescencia microscopía para el estudio del corazón murino

El protocolo introdujo aquí permite la caracterización de la capacidad de pulmón homing de linfocitos humanos primarios en condiciones inflamatorias en vivo. La infiltración pulmonar de células inmunes humanas eventualmente transferidas en un modelo murino de inflamación alérgica puede ser reflejada y cuantificada mediante microscopía de fluorescencia de luz hoja de tejido pulmonar químicamente limpia.

Avanzadas de la proyección de imagen de pulmón Homing de linfocitos humanos en un Experimental en modelo Vivo de inflamación alérgica basada en microscopia de luz hoja

El objetivo de este protocolo es mostrar cómo utilizar la microscopía de hoja de luz de celosía para visualizar la dinámica de receptores de superficie en células vivas. Aquí se muestran los receptores de células T en CD4+ células T primarias.

Visualización de la dinámica del receptor de células T de superficie de cuatro dimensiones mediante la microscopía de hoja de luz de celosía

Este protocolo describe en detalle cómo construir un microscopio de fluorescencia de hoja de luz de un solo objetivo y su uso para visualizar redes de citoesqueletos.

Diseño y construcción de un microscopio de fluorescencia de lámina de luz personalizable de un solo objetivo para la visualización de redes de citoesqueletos

Aprende a visualizar células inmunes humanas en matrices de colágeno tridimensionales mediante microscopía de hoja de luz. Este protocolo permite rastrear la migración celular con alta resolución y mínima fototoxicidad.

Microscopía de luz de hoja para la visualización tridimensional de las células inmunes humanas

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