Un ensayo para detectar el estallido oxidativo en los discos foliares de Arabidopsis tras la inmunitaria

Obtener discos foliares de Arabidopsis thaliana. Sumérjalos en pocillos de microplacas que contengan agua doblemente destilada para evitar la desecación.

Incube los discos para permitir la recuperación de la herida.

Después de la incubación, retire el agua. Agregue una mezcla de reacción que contenga péptidos derivados de bacterias, enzima peroxidasa de rábano picante y luminol.

Con un lector de microplacas, mida la luminiscencia a lo largo del tiempo.

Los receptores de reconocimiento de patrones, o PRR, en las células vegetales, se unen a los péptidos bacterianos, que son patrones moleculares asociados a microbios.

Además, el PRR se asocia con su correceptor, experimentando fosforilación mutua, activando proteínas quinasas similares a receptores y causando una afluencia de calcio intracelular.

Esto, a su vez, activa el homólogo de la oxidasa respiratoria transmembrana, o proteínas RBOH.

El RBOH activado cataliza la producción de especies reactivas de oxígeno extracelulares, o ROS, causando un estallido oxidativo. Además, ROS se convierte en peróxido de hidrógeno.

La peroxidasa de rábano picante utiliza peróxido de hidrógeno para oxidar el luminol en un estado excitado, emitiendo luminiscencia al volver al estado fundamental.

Mida la luminiscencia para monitorear la rápida explosión oxidativa después del reconocimiento de patrones microbianos.

A las 4 a 5 semanas después de la germinación, use un punzón de biopsia afilado de 4 milímetros para eliminar un disco de hoja por planta de Arabidopsis, evitando la vena media y teniendo cuidado de limitar las heridas. Recoja los discos en pocillos individuales de una placa de luminómetro de 96 pocillos no utilizada que contenga 100 microlitros de agua doblemente destilada por pocillo en el lado axial hacia arriba para evitar la desecación.

Si evalúa varios elicitores, retire un segundo disco de hoja de la misma hoja para cada tratamiento de elicitor y cubra la placa con la tapa para permitir que los discos de la hoja se recuperen durante la noche a temperatura ambiente. A la mañana siguiente, configure los parámetros del lector de microplacas en un tiempo de integración de 1,000 milisegundos en intervalos de 2 minutos durante un período de 40 a 60 minutos para capturar el estallido oxidativo dinámico.

A continuación, utilice una pipeta multicanal para sustituir el agua de cada pocillo por 100 microlitros de solución de reacción recién preparada, incluida una reacción de control sin provocación para cada genotipo para evaluar los niveles de especies de oxígeno de reacción basal en ausencia de provocación. Luego, inmediatamente, mida la emisión de luz para todas las longitudes de onda en el espectro visible en el lector de microplacas.