Name: Seguimiento de los cambios de equilibrio en la estructura del ARN por peroxidación y oxidativo Huella de radicales hidroxilo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 41 s
Description: Aprende a cuantificar la formación de la estructura terciaria del ARN mediante footprinting de radicales hidroxilo. Este método utiliza reactivos de Fenton y electroforesis en gel para estudiar la accesibilidad del solvente.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Salud-SR1 GM085130 y National Science Foundation MCB0929394. Agradecemos a la Dra. Marion Schmidt por su hospitalidad y por permitirnos filmar en su laboratorio.

1. Preparación de los reactivos Huella <ol><li> Preparar un tampón de reacción 10x con 100 mM cacodilato de sodio, 1 mM EDTA y 1 M KCl. Ajustar el pH a 7.4. Filtro de la memoria intermedia con un 0,2 M de acetato de dispositivo de filtro (Nalgene). Nota: no ARN pipeta directamente en el buffer 10x. </li><li> Prepare la mezcla de reacción de titulación para cada reacción, como se indica en la Tabla 1. El volumen de la mezcla de la valoración (1x buffer y Mg (II) a la concentración deseada) debe ser de 90 l, antes de añadir 10μl de ARN en tampón 1x. </li><li> Preparar un buffer de RNasa T1 digestión que contiene urea 6.63M, citrato de sodio 20 mM, 1 mM EDTA, 0,25 mg / l tRNA, 0,025% cyanol xileno, y 0,025% de azul de bromofenol. Este buffer se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de 6 meses. </li><li> La reacción de Fenton requiere recién preparada las soluciones acuosas de 250 mM Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2, 250 mM EDTA y 500 mM de sodio L-ascorbato. Las concentraciones en el capítulo 10.5 son las más adecuadas para los experimentos de equilibrio en un tampón de cacodilato de sodio, tales como que no se eliminan los radicales y diversas concentraciones de iones divalentes. </li><li> Los reactivos para la reacción de la huella peroxidativo (1.5.1) y oxidativo (1.5.2). <ol><li> La peroxidación reacción de Fenton requiere recién preparada las soluciones acuosas de 100 mM Fe-EDTA, y 50 mM de sodio L-ascorbato y el 1,5% H 2 O 2. La solución de Fe-EDTA se prepara mezclando Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 con EDTA a tener 1,1 veces el exceso de EDTA sobre el hierro. </li><li> Justo antes de iniciar la reacción de escisión oxidativa (3.4.2), crear la mezcla de reacción de Fenton mediante la combinación de 2 l de Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 (250 mm), 2,2 l de EDTA (250 mM), 62,5 l L-ascorbato sódico (500 mM), 22,5 l buffer de reacción 10x y 135,5 l de H 2 O para llegar a la concentración final en la mezcla de reacción de huellas (3.4.2) de 0.10 mM, 0,11 y 6,61 mM, respectivamente. </li></ol></li></ol> 2. ARN preparación para el experimento Huella <ol><li> ARN puede ser producido por la norma en la transcripción in vitro de seis plantillas de ADN o, si menor de 50 nucleótidos, pueden comprar (por ejemplo, en Integrated DNA Technologies, www.idtdna.com). Siga los procedimientos recomendados para la limpieza de laboratorio para mantener la integridad de las muestras de ARN durante los experimentos huella 7. </li><li> 8 de desfosforilación in vitro ARN transcrito es necesaria antes de etiquetado P 32 del extremo 5 'del ARN. 10 pmol de RNA son finales etiquetados por kinasing. 9 La solución debe ser despejado con éxito después de la inactivación de la fosfatasa. </li><li> Purificar el ARN marcado radiactivamente mediante electroforesis en gel de desnaturalización. El ARN se recupera por dos posteriores extracciones de gel con 0,3 M de acetato de sodio (pH 5,5). ARN se precipita mediante la mezcla de 0,5 ml de solución acuosa con 1 ml de etanol y la posteriorincubación durante 1 minuto en hielo seco. Giro de la muestra a 4 º C, 12500 rpm durante 0,5 horas. Descartar el sobrenadante y lavar el ARN precipitado con etanol al 70%. Aspirar el sobrenadante después de centrifugación adicional y seco en pelets en el vacío. </li><li> Disolver los 32 P-etiquetados muestras de ARN en 330 ul de 1x Buffer.Pipet 30 l de la solución de ARN en un tubo de reacción, el precipitado con etanol y el ARN en seco en el vacío, mantenga este tubo para la generación de la escala de referencia (paso 3.5). Desnaturalizar la solución tampón de ARN por calentamiento a 95 ° C durante 2 min. Fresco de las muestras a temperatura ambiente durante 15 min y dar una vuelta rápida para reducir la condensación en las tapas de los tubos de nuevo el producto. </li></ol> 3. El experimento de Huella <ol><li> El peine de electroforesis determina el número máximo de puntos de datos por gel analítica. Nosotros usamos un peine y 30. La escalera de referencia ocupa dos pozos y el control de uncleaved. Prepare 27 tubos de reacción. El final de Mg (II) Concentradoscomplementos deben ser espaciados uniformemente en una escala logarítmica que abarca varios órdenes de magnitud cerca del punto medio de valoración. </li><li> Por otra parte, se incuba el ARN y las soluciones de Mg (II) a 50 ° C durante 5 min. Mezclar 10 l de solución de ARN con 90 l de la cantidad correspondiente de Mg (II) en 1x buffer para alcanzar un volumen final de 100 microlitros. Incubar las soluciones durante 30 minutos a 50 ° C. </li><li> Deje que las soluciones de equilibrio a 25 ° C durante 1 hora, mientras que plegado tiene lugar. </li><li> Peroxidativo (3.4.1) o oxidativo (3.4.2) la reacción hidroxilo huella radical. <ol><li> Iniciar la reacción de peroxidación mediante la colocación de las gotas de 2 l de Fe-EDTA (100 mM), 2 l de sodio L-ascorbato (50 mM) y 2 l H 2 O 2 (1,5%), separadas unas de otras en el interior de la parte superior de la reacción tubo que contiene la solución de ARN e iniciar la reacción de la huella de una mezcla vigorosa. Detener la reacción después de 15 segundos mediante la adición de 300 l de etanol absoluto frío. A su vez los tubos de 3.5 veces. Precipitado, lavar ysecar el pellet como en el paso 2.4. </li><li> Inicie el footprintingreaction oxidativo de radicales hidroxilo mediante la adición de 5 l de la mezcla de reacción recién preparada Fenton (1,6). Incubar durante 30 min a 25 ° C. Añadir 300 l de etanol absoluto frío para detener la reacción y mezclar girando el tubo 3-5 veces. Precipitado, lavar y secar el pellet, como se indica en el paso 2.4. </li></ol></li><li> Generar una RNasa T1 muestra de referencia digerir acuerdo con los procedimientos estándar de 10 con la solución preparada en el paso 1.3. </li><li> Disolver pellets de ARN en 8 l de gel de carga de tintes II (Ambion) y el ARN se vuelve a suspender confirmar mediante el contador Geiger. </li><li> Prepare una desnaturalización, gel de poliacrilamida al 8% de secuenciación de acuerdo con protocolos estándar. 11 muestras de carga, incluyendo dos referencias y un control. Separar fragmentos de ARN a 60 W - 75 W durante 2,5 horas. Exponer gel seco a una pantalla de fósforo de almacenamiento durante la noche. Exploración pantalla de fósforo con un sistema de imagen para autorradiografía sin película, por ejemplo,. Tormenta 865 (GE Healthcare) o tifón (GE Healthcare). Transferencia de archivos gel imagen en tu ordenador. </li></ol> 4. Análisis de Datos <ol><li> La reactividad del radical hidroxilo de cada nucleótido se determina mediante la cuantificación de la intensidad de cada banda en el gel de análisis. Descargue, instale y abra SAFA, un fácil utilizar el software de código abierto para montar una sola banda y cuantificación. 12, 13 Siga las instrucciones del manual del usuario. En pocas palabras, la carga de la secuencia de ARN como. Txt seguido de la imagen como un archivo de gel. Gel. Ajustar la intensidad de la banda, definir los carriles, elija un carril de anclaje, y realizar una alineación gel. Asignación de bandas de nucleótidos ocurre en referencia a la escalera de RNasa T1 digestión. Cuantificar las integrales de banda y usar la función de normalización / colorplot para normalizar y asignar los residuos potencialmente invariante. Guardar el resultado como un archivo. Txt. </li><li> SAFA salidas de una hoja de cálculo que contiene las columnas que representan los carriles en el gel y las filas que representan entegrated banda de densidad de las bandas individuales correspondientes a los fragmentos de ARN. En primer lugar, identificar los sitios de protección que muestran un cambio notable en la accesibilidad de disolvente mediante la comparación del perfil de la protección derivada de la no Mg (II) de la muestra con el perfil de el punto final de Mg (II) de concentración (50 mM en nuestro ejemplo). Cuanto más bajo sea el valor, más protegido es el nucleótido está en contra del ataque de los radicales hidroxilo y viceversa. </li><li> Crear isotermas plegado de las integrales de banda normalizado de las personas o grupos de nucleótidos frente a Mg (II) de concentración. Las isotermas son individualmente a escala de la saturación fraccional por fi = L + (U - L) • <img src="files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="Y"> donde f denota la densidad integrada de la banda (s) que se analiza, L y U representan los límites inferior y superior de la transición y <img src="/files/ftp_upload/3244/3244y.jpg" alt="Y" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Y"> es la saturación fraccional. 14 Los datos se ajustan utilizando una l no linealEste programa de análisis de cuadrados (Usamos ya sea de origen (OriginLab) o GraphPad (GraphPad Software, Inc.).) a la ecuación de Hill (1), <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244eq1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="La ecuación 1"> donde K d es el equilibrio constante de disociación, [M] corresponde a la concentración de la variable que interviene en la reacción de plegamiento, Mg (II) en este ejemplo, y H n es el coeficiente de Hill. Este procedimiento de escalas de la transición a la saturación fraccional, determina su punto medio y proporciona una prueba fenomenológica de si la transición es sigmoidal. Isotermas derivadas de geles de secuenciación (Figura 3), que fueron analizados por SAFA (Figura 3B) y el ajuste como se describe anteriormente se muestran en la Figura 3C. Las isotermas de saturación fraccional se muestra en la Figura 3 se generaron por la escala en una hoja de cálculo de los valores generados por la SAFA contra el mejor ajuste de los límites superior e inferior (U y L) con la fracción de la ecuación = valor / (U - L) - L / (U - L). </li></ol> 5. Los resultados representativos: La Figura 3 muestra los resultados representativos de P4-P6 ARN • Experimentos huella OH. La imagen de gel (izquierda) indica que una división de fondo) es mínimo (carril derecho), b) la asignación de un solo nucleótido es posible gracias a las bandas bien definidas en el carril de la T1 (RNasa T1 se unirá en cada G), y c) el radical hidroxilo la fragmentación inducida por el ARN está muy por encima del fondo. La transición de bajo a alto Mg (II) está afiliada con la disminución de la densidad de la banda integrada de individuos y grupos de bandas que indican la formación de la estructura del ARN terciario. Individuales o grupos de nucleótidos contiguos cuya división cambios de forma concomitante se conoce como "protección". Las protecciones • OH características de la Mg (II) mediada plegado de la ARN P4-P6 corresponden muy de cerca a las regiones inaccesibles solvente de la molécula de observar en su estructura cristalina. 15 Doblado las moléculas de ARN c uno tiene extensiones muy diferentes (es decir, qué tan cerca a un segundo plano la declinación banda densidades) de protección contra el contacto superior que no se han relacionado con el fenómeno de clara estructurales o dinámicas. Por lo tanto, algunas moléculas de ARN se muestran bien definidas las transiciones estructurales, como se muestra en la Fig. 3, y otros no. Intensidades de las bandas se cuantificó y se normalizó por la SAFA 12 análisis (Figura 3B). La salida es un "térmico" complot visualizar el grado relativo de la protección contra • OH. La transición de colores describe el cambio de la accesibilidad en Mg (II) Además. Blanco a rojo o azul muestra nucleótidos más accesible o más protegidas, respectivamente. Cada grado de sombreado está afiliado a un valor numérico que se pueden representar como una curva de protección (Figura 3C) y se analizaron mediante un modelo de unión, como la ecuación de Hill (1). La constante de equilibrio de disociación afiliado con la protección del 153-155 es aproximadamente el doble que el valor correspondiente de protección 163-164. CONTENIDO "&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Producción de radicales hidroxilo y P4-P6 plegamiento del ARN. A) Fe (II) cataliza la generación de radicales hidroxilo a partir de peróxido de hidrógeno. Ascorbato reduce Fe (III) de vuelta a hierro ferroso. B) En ausencia de Mg (II), sin estructura terciaria P4-P6 se ​​forma, lo que los radicales hidroxilo para penetrar y romper todas las posiciones de columna vertebral accesible. Además de la Mg (II) inicia plegamiento de P4-P6, permitiendo sólo la columna vertebral accesible solvente para ser cortado por los radicales hidroxilo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Esquema de un experimento de la huella de radicales hidroxilo. A Dephophorylation) y 32 P 5 'final de etiquetado de ARN. B) La purificación de 32 P-RNA marcado en un gel de poliacrilamida. C) La escisión de la banda de ARN, tras la extracción de ARN, y precipitación con etanol. D) Prefolding yplegamiento del ARN. E) La adición de recién preparada mezcla de reacción de Fenton para generar radicales hidroxilo. F) ARN separación fragmento de desnaturalización electroforesis en gel de poliacrilamida. G) La cuantificación de fragmentos de ARN por el software de SAFA. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3244/3244fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Análisis de fragmentos de ARN después de la reacción peroxidativa huella Fenton. (A) El ARN fue expuesto a los radicales hidroxilo y los productos de degradación se resolvieron mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida (PAGE). La imagen muestra los productos de peroxidación de separación con la creciente concentración de Mg (II). Carriles de referencia y control están etiquetados. Este archivo de imagen es la entrada para el programa SAFA que cuantifica el volumen de cada banda. (B) El 'térmico' trama generada por la SAFA. (C) Una hoja de cálculo de los valores relacionados con la densidad de la banda integrada a la salida número de nucleótidos de SAFA es analizada por un modelo de unión, como el Cerro equatien (1). Regiones de protección fueron escogidos de acuerdo con el aumento de la densidad de banda integral en función de Mg (II) de concentración. El K d es el Mg (II) concentración en la que se dobla la mitad de la ARN en el sitio se está supervisando. El coeficiente de Hill, n H, es una medida de la pendiente de la curva que da información sobre la cooperatividad de unión y proporciona una estimación más baja para el número de iones de magnesio que participan en el plegamiento de este sitio en particular. <img alt="Tabla 1" src="/files/ftp_upload/3244/3244table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabla 1"> Tabla 1. Representante para la generación de volúmenes de muestras de ARN que contiene diferentes Mg (II) las concentraciones.

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No hay conflictos de interés declarado.

La huella radical hidroxilo es una herramienta valiosa para evaluar el área de superficie accesible disolvente de los ácidos nucleicos. Formación cualitativa y cuantitativa de la estructura terciaria 14 se puede seguir en función de parámetros como el tipo de iones y la concentración, pH, temperatura, proteínas de unión o plegamiento factores de co-. La atractiva combinación de un protocolo sencillo y de bajo costo y la accesibilidad resulta solvente y la información de plegado en un nivel de nucleótido único...

<table><tbody><tr><td>Nombre</td><td>Empresa</td><td>N.º de catálogo</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato sódico (¡Precaución! Tóxico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4945-25g</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Agua tratada con DEPC</td><td>Ambion</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Acetato sódico (3 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Ambion</td><td>AM9902</td><td></td></tr><tr><td>Citrato sódico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R-7876</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbato sódico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7631-25g</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;(SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; · 6 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1543-500g</td><td></td></tr><tr><td>RNasa T1</td><td>Fermentas</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno (30 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>349887</td><td></td></tr></tbody></table>

seguimiento de los cambios de equilibrio en la estructura del arn por &quot;peroxidación&quot; y &quot;oxidativo&quot; huella de radicales hidroxilo

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

Las moléculas de ARN desempeñan un papel esencial en la biología. Además de transmitir la información genética, el ARN puede plegarse en estructuras terciarias única que cumple un papel biológico específico, como regulador, carpeta o un catalizador. Información acerca de la formación terciaria de contacto es esencial para entender la función de moléculas de ARN. Radicales hidroxilo (OH •) son las sondas único de la estructura de los ácidos nucleicos, debido a su alta reactividad y tamaño pequeño. 1 Cuando se utiliza como una sonda de huellas, los radicales hidroxilo mapa de la superficie accesible al soluto de la columna vertebral fosfodiéster del ADN y el ARN 1 2 con tan fina como la resolución de un solo nucleótido. La huella radical hidroxilo se puede utilizar para identificar los nucleótidos dentro de una superficie de contacto intermolecular, por ejemplo, en el ADN en proteínas y complejos de un ARN-proteína. Equilibrio 3 y 4 cinética transiciones se puede determinar mediante la realización de la huella de radicales hidroxilo en función de un solutien la variable o la hora, respectivamente. Una característica clave de la huella es que la exposición limitada a la sonda (por ejemplo, &quot;un solo ataque cinética&quot;) se traduce en la toma de muestras uniformes de cada nucleótido del polímero. 5 En este artículo, video, utilizar el dominio P4-P6 de la ribozima de Tetrahymena para ilustrar la preparación de ARN de la muestra y la determinación de Mg (II) mediada por las isotermas de plegado. Se describe la utilización del conocido protocolo de hidroxilo huella radical que requiere de H 2 O 2 (a esto lo llamamos el &quot;peroxidación&quot; protocolo) y un valor, pero no se conoce ampliamente, alternativa que utiliza naturalmente, O 2 disuelto (llamamos a esto &quot;el oxidativo &quot;protocolo). Una visión general de la reducción de datos, la transformación y los procedimientos de análisis se presenta.

Este protocolo describe la forma de cuantificar el Mg (II)-dependiente de la formación de la estructura del ARN superior mediante dos métodos de huella radical hidroxilo.

Seguimiento de los cambios de equilibrio en la estructura del ARN por &quot;peroxidación&quot; y &quot;oxidativo&quot; Huella de radicales hidroxilo

Las moléculas de ARN desempeñan un papel esencial en la biología. Además de transmitir la información genética, el ARN puede plegarse en estructuras terciarias únicas que cumplen...

El objetivo general del siguiente experimento es determinar cómo se pliegan las moléculas de ARN utilizando la técnica de huella de radicales hidroxilo. Esto se logra mediante la marcación en los extremos, la purificación en gel y el prepliegue del ARN, lo cual asegura la integridad conformacional del ARN antes del plegamiento mediado por magnesio. En una etapa posterior, se mezclan los reactivos de Fenton para generar radicales hidroxilo, los cuales pueden escindir posteriormente el esqueleto del ARN de acuerdo con su accesibilidad al solvente. A continuación, los productos de escisión del ARN se separan mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida y se visualizan mediante autorradiografía.Las integrales de las bandas se cuantifican mediante un software semiautomatizado de análisis de huellas. El objetivo final consiste en generar isotermas de plegamiento que reflejen la formación de la estructura terciaria del ARN. Esto se logra escalando las integrales de las bandas normalizadas a la saturación fraccional.Las isotermas pueden ajustarse posteriormente a la ecuación de Hill. La principal ventaja del footprinting con hidroxilo es que se obtiene información sobre la estructura terciaria del ARN utilizando productos químicos económicos, ya que debido a su mayor actividad y tamaño reducido, los radicales hidroxilo son sondas ideales para distinguir entre nucleótidos accesibles al disolvente y nucleótidos enterrados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología estructural del ARN.Por ejemplo, ¿cómo emplean los ribosomas iones metálicos para alcanzar su conformación activa? La huella de radicales hidroxilo puede utilizarse para comprender los fundamentos de la especificidad y el reconocimiento del ARN. Además de revelar información sobre la estructura terciaria del ARN, este método puede emplearse para determinar los sitios precisos de unión de proteínas en moléculas de ARN o ADN.Los principales desafíos de este método consisten en prevenir la degradación de la muestra por ribonucleasas y en optimizar la concentración de hierro para obtener la cantidad adecuada de escisión de ARN. Asimismo, el análisis detallado de los intervalos de las bandas puede resultar bastante complicado. La principal ventaja de este video es ayudar al público a comprender las etapas de planificación y la ejecución exitosa de un experimento de huella de radicales hidroxilo. Antes de comenzar este protocolo, prepare todos los reactivos para la huella tal como se describe en el protocolo escrito.Junto con este video, se puede producir ARN en DFOs cuatro relacionados y marcados en el extremo como se indica allí. Purifique el ARN marcado radiactivamente mediante electroforesis en gel desnaturalizante. Recupere el ARN purificado mediante dos extracciones sucesivas de gel utilizando acetato de sodio 0,3 molar.Luego precipite el ARN mezclando 0,5 mililitros de la solución acuosa con un mililitro de etanol. Incube la mezcla durante un minuto en hielo seco. Después de centrifugar la muestra, deseche el sobrenadante. Lave el pellet de ARN con etanol al 70%.Elimine el sobrenadante tras una centrifugación adicional y seque el precipitado al vacío. A continuación, disuelva las muestras de ARN marcadas con P 32 purificadas. En 330 microlitros de tampón de reacción al uno por ciento, pipete 30 microlitros de la solución de ARN en un nuevo tubo de reacción.Precipite el ARN con etanol y luego seque el pellet en vacío; una vez seco, este pellet puede utilizarse para generar la escalera de referencia según se describe en el procedimiento escrito para desnaturalizar la solución restante de ARN en tampón mediante calentamiento a 95 grados Celsius durante dos minutos. Incube las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos y realice una centrifugación rápida para recoger el condensado de vuelta en solución. Para comenzar el experimento de huella de proteasa, prepare 27 tubos de reacción con suficientes muestras para llenar una gel de electroforesis de 30 pozos.Después de incluir los marcadores y el control digerido, determine las concentraciones finales de iones magnesio y hierro de modo que estén espaciadas uniformemente en una escala logarítmica a lo largo de varios órdenes de magnitud alrededor del punto medio de la titulación. La preparación de los iones magnesio en un tampón de reacción 1x se describe por separado en el texto. Incube la solución de ARN y las soluciones de iones magnesio a 50 grados Celsius durante cinco minutos. Luego, mezcle 10 microlitros de la solución de ARN con 90 microlitros de la cantidad correspondiente de solución de iones magnesio y hierro.Para alcanzar un volumen final de 100 microlitros, incube cada mezcla durante 30 minutos a 50 grados Celsius. Posteriormente, deje que las soluciones se equilibren a 25 grados Celsius durante una hora mientras ocurre el plegamiento del ARN. Mientras tanto, inmediatamente antes de iniciar la reacción de huella de radicales hidroxilo, prepare la mezcla de reacción fantasma según se describe en el protocolo escrito.Prepare la reacción de peroxidación pipeteando dos gotas de dos microlitros cada una de ferro EDTA, ascórbato sódico y peróxido de hidrógeno en la parte superior interna del tubo de reacción que contiene la solución de ARN, de modo que las gotas no se toquen. Inicie la reacción de huella mediante mezcla vigorosa. Después de 15 segundos, detenga la reacción añadiendo 300 microlitros de etanol frío puro.Gire los tubos de tres a cinco veces. Finalmente, precipite, lave y seque el pellet como se realizó anteriormente. Como alternativa a la reacción peroxidativa, la reacción oxidativa de hidroxilación se realizaría añadiendo cinco microlitros de la mezcla recién preparada de la reacción de Fenton a las muestras. Incube la reacción oxidativa durante 30 minutos a 25 grados Celsius.Luego, agregue 300 microlitros de etanol frío puro para detener la reacción y mezcle invirtiendo los tubos. Precipite nuevamente. Lave y seque el pellet una vez finalizada la reacción peroxidativa u oxidativa.Disuelva los pellet de ARN secos en ocho microlitros de tampón de carga para geles número dos. Confirme que el ARN marcado con P 32 se ha resuspendido utilizando un contador Geiger. Prepare un gel de secuenciación desnaturalizante de poliacrilamida al 8 % según los protocolos estándar. Utilizando un peine de 30 pozos, cargue las muestras, incluyendo dos referencias y un control de escisión.Separar los fragmentos de ARN a 60-75 vatios durante dos horas y media. Exponer el gel seco a una pantalla fosfoensambladora durante la noche. Escanear la pantalla fosfoensambladora con un sistema de imagen para auto radiografía sin película.Luego transfiera el archivo de la imagen del gel al ordenador para su análisis. Para comenzar el análisis de datos, abra Safa, un software de código abierto para el ajuste y cuantificación de bandas individuales. Cargue la secuencia de ARN como un archivo de texto con extensión .txt, seguido de la imagen del gel como un archivo con extensión .gel.Defina las bandas y ajuste las intensidades de las bandas. Luego, elija una banda de referencia y realice una asignación de alineación del gel de bandas a nucleótidos en referencia al marcador de digestión de ARN T1. Cuantifique las intensidades de las bandas y utilice la función de gráfico de normalización/división por color para normalizar y asignar residuos potencialmente invariantes.Guarde la salida como un archivo txt. SFA genera una hoja de cálculo que contiene columnas, que representan carriles en el gel, y filas que representan las integrales individuales de las bandas correspondientes al fragmento de ARN. Primero, deben identificarse los sitios de protección que muestran un cambio notable en la accesibilidad al disolvente mediante la comparación del perfil de protección derivado de la muestra sin ion magnesio con el perfil de la concentración final de ion magnesio.Cuanto menor sea el valor, más protegido estará el nucleótido frente al ataque de los radicales hidroxilo, y viceversa. A continuación, cree curvas de transición de bandas, intensidades de nucleótidos individuales o grupos de nucleótidos frente a la concentración de hierro magnésico utilizando un formato de hoja de cálculo; escale individualmente estas transiciones a la función de saturación fraccional tal como se describe en la sección de texto de este protocolo. Como paso final, ajuste los datos a la ecuación de Hill.Este análisis escala la transición a la saturación fraccional, determina el punto medio de la transición y proporciona una prueba fenomenológica de si una transición es sigmoidea. A continuación se presentan resultados representativos de experimentos de huella de radicales hidroxilo en el ARNr P cuatro P seis. Las isotermas se derivaron a partir de geles de secuenciación analizados mediante Safa y luego se ajustaron según lo descrito en la sección de análisis.La imagen del gel indica que la escisión de fondo es mínima y que es posible la asignación de un solo nucleótido debido a bandas bien definidas en la pista de T. La fragmentación del ARN inducida por radicales hidroxilo está claramente por encima del fondo. La transición de bajos a altos iones de magnesio está selectivamente asociada con la disminución de la intensidad de bandas individuales y grupos de bandas, lo que indica la formación de ARN.La protección de la estructura terciaria se refiere a nucleótidos individuales o grupos de nucleótidos contiguos cuyo corte cambia simultáneamente las intensidades de las bandas, las cuales se cuantifican y normalizan mediante análisis saffer. El resultado es un gráfico térmico que visualiza el grado de protección frente a los radicales hidroxilo. La transición de color describe el cambio en la accesibilidad tras la adición de hierro magnésico: el cambio de blanco a rojo indica nucleótidos más accesibles, mientras que el cambio de blanco a azul indica nucleótidos más protegidos.Cada grado de sombreado está asociado con un valor numérico, que puede representarse como una curva de protección y analizarse mediante un modelo de unión, como la ecuación de Hill. En este ejemplo, la constante de disociación en equilibrio asociada a la protección 1 5 3 hasta 1 5 5 es aproximadamente el doble que el valor correspondiente de la protección 1 6 3 hasta 1 6 4. Este experimento de huella de radicales hidroxilo puede realizarse en un día y medio si se lleva a cabo correctamente.Al realizar este procedimiento, es importante recordar usar guantes y una bata de laboratorio para evitar cualquier contaminación con ARN. Además, la concentración final de hierro depende del sistema experimental. Por lo tanto, recomendamos realizar un experimento de respuesta a la dosis antes de la huella genómica siguiendo este procedimiento.Otros métodos, como la huella del radical hidroxilo resuelta en el tiempo, pueden realizarse para responder preguntas adicionales. Por ejemplo, ¿en qué momento crítico alcanzan las moléculas de ARN una conformación incorrecta o activa tras su desarrollo? Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología estructural exploraran interacciones terciarias moleculares inter e intermedias de los ácidos nucleicos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar la formación de la estructura terciaria de las moléculas de ARN. No olvide que el catión y la etapa con fósforo son peligrosas; se recomiendan precauciones como el uso de guantes y gafas de protección, así como el uso de blindaje de plexiglás mientras se realiza este procedimiento.

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Investigación

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Biology

Biología

De alto rendimiento selectiva 2 'acilación hidroxilo analizados por extensión del cebador (FORMA) utiliza un software de predicción de estructura secundaria de producto químico nuevo sondeo de la tecnología, la transcripción inversa, electroforesis capilar y para determinar las estructuras de ARN de varios cientos a varios miles de nucleótidos en una sola resolución de nucleótidos.

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La reticulación cinética y el análisis del ADNc es un método que permite la investigación de la dinámica de las interacciones proteína-ARN en células vivas a alta resolución temporal. Aquí se describe el protocolo en detalle, incluido el crecimiento de células de levadura, la reticulación UV, la recolección, la purificación de proteínas y los pasos de preparación de la biblioteca de secuenciación de próxima generación.

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La oxidación fotoquímica rápida de proteínas es una técnica emergente para la caracterización estructural de proteínas. Diferentes aditivos solventes y ligandos tienen variadas propiedades de barrido hidroxilo radical. Para comparar la estructura proteica en diferentes condiciones, se requiere una compensación en tiempo real de los radicales hidroxilo generados en la reacción para normalizar las condiciones de reacción.

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Aprende a cuantificar la formación de la estructura terciaria del ARN mediante footprinting de radicales hidroxilo. Este método utiliza reactivos de Fenton y electroforesis en gel para estudiar la accesibilidad del solvente.

Seguimiento de los cambios de equilibrio en la estructura del ARN por "peroxidación" y "oxidativo" Huella de radicales hidroxilo

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