Seguimiento de los cambios de equilibrio en la estructura del ARN por "peroxidación" y "oxidativo" Huella de radicales hidroxilo

El objetivo general del siguiente experimento es determinar cómo se pliegan las moléculas de ARN utilizando la huella de radicales hidroxilo. Esto se logra mediante el etiquetado final, la purificación en gel y el preplegamiento del ARN, lo que garantiza la integridad de confirmación del ARN antes del plegamiento mediado por magnesio como siguiente paso, los reactivos de Fenton se mezclan para generar radicales hidroxilo, que posteriormente pueden escindir la columna vertebral del ARN de acuerdo con su accesibilidad al solvente. A continuación, los productos de escisión de ARN se separan mediante electroforesis en gel de acrilamida desnaturalizante y se visualizan mediante autorradiografía.

Las integrales de banda se cuantifican mediante un software de análisis de huellas semiautomatizado. El objetivo final es generar isotermas de plegamiento que reflejen la formación de la estructura terciaria del ARN. Esto se logra escalando las integrales de banda normalizadas a la saturación fraccional.

Las isotermas se pueden ajustar posteriormente a la ecuación de Hill. La principal ventaja de la huella hidroxi es que se obtiene información de la estructura terciaria del ARN utilizando productos químicos baratos debido a la mayor actividad en los radicales hidroxi de tamaño pequeño son sondas perfectas para distinguir entre nucleótidos accesibles al solvente y enterrados. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología estructural del ARN.

Por ejemplo, ¿cómo emplean los ribosomas los iones metálicos para alcanzar su confirmación activa? La huella de radicales hidroxi se puede utilizar para comprender los fundamentos de la especificidad y el reconocimiento del ARN. Además de revelar información sobre la estructura terciaria del ARN, este método se puede utilizar para determinar los sitios precisos de unión a proteínas en el ARN o en las moléculas de ADN.

Los principales desafíos de este método son evitar la degradación de la muestra por la ribonucleasa y optimizar la concentración de hierro para obtener la cantidad correcta de escisión de ARN. Además, el análisis detallado de los intervalos de banda puede ser bastante complicado. El principal beneficio de este video es ayudar a la audiencia a comprender las etapas de planificación y la ejecución exitosa del experimento de huella de radicales hidroxi. Antes del inicio de este protocolo, prepare toda la huella en reactivos como se describe en el protocolo escrito.

Acompañando a este video, el ARN se puede producir DFOs cuatro relacionados y etiquetados como se describe allí. Purifique el ARN marcado radiactivamente mediante electroféresis en gel desnaturalizante. Recupere el ARN purificado mediante dos extracciones posteriores en gel utilizando acetato de sodio 0,3 molar.

A continuación, precipite el ARN mezclando 0,5 mililitros de la solución acuosa con un mililitro de etanol. Incubar la mezcla durante un minuto en hielo seco Después de girar la muestra, deseche el supinado. Lave el pellet de ARN con etanol al 70%.

Retire el supinato después de una centrifugación adicional y seque el pellet al vacío. A continuación, disuelva las muestras de ARN marcadas con P 32 purificadas. En 330 microlitros de tampón de reacción única, pipetee 30 microlitros de la solución de ARN en un nuevo tubo de reacción.

Precipite el ARN con etanol y luego seque el pellet al vacío una vez seco, este pellet se puede utilizar para generar la escalera de referencia como se describe en el procedimiento escrito para naturalizar la solución de ARN tamponada restante calentando a 95 grados Celsius durante dos minutos. Llame las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos y siga con un centrifugado rápido para devolver el condensado a la solución. Para comenzar el experimento de la huella, coloque 27 tubos de reacción para obtener suficientes muestras para llenar un gel de electroforesis de 30 pocillos.

Después de incluir las escaleras y el control escindido, determine las concentraciones finales de hierro y magnesio de modo que estén espaciadas uniformemente en una escala logarítmica en varios órdenes de magnitud alrededor de la preparación del punto medio de la titulación de los iones de magnesio en un tampón de reacción de un tiempo se describe en el texto por separado. Incubar el ARN y las soluciones de iones de magnesio a 50 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, mezcle 10 microlitros de la solución de ARN con 90 microlitros de la cantidad correspondiente de solución de magnesio y hierro.

Para alcanzar un volumen final de 100 microlitros, incubar cada mezcla durante 30 minutos a 50 grados centígrados. Posteriormente, permita que las soluciones se equilibren a 25 grados centígrados durante una hora mientras se produce el plegamiento del ARN. Mientras tanto, inmediatamente antes de iniciar la huella del radical hidroxilo en reacción, prepare la mezcla de reacción fantasma como se describe en el protocolo escrito.

Prepare la reacción de peroxidación pipeteando dos gotas de microlitros de hierro, EDTA, ascorbato de sodio y peróxido de hidrógeno en la parte superior interna del tubo de reacción que contiene la solución de ARN para que las gotas no se toquen. Inicie la reacción de pisada mediante una mezcla vigorosa. Después de 15 segundos, detenga la reacción agregando 300 microlitros de etanol frío puro.

Gire los tubos de tres a cinco veces. Finalmente, precipitar, lavar y secar el pellet como se realizó anteriormente como alternativa a la reacción per oxidativa, la reacción oxidativa del hidroxilo se realizaría agregando cinco microlitros de la mezcla de reacción Fenton recién preparada a las muestras. Incubar la reacción oxidativa durante 30 minutos a 25 grados centígrados.

Luego agregue 300 microlitros de etanol puro en frío para apagar la reacción y mezcle girando los tubos. Una vez más, precipitar. Lave y seque el pellet una vez finalizada la reacción oxidativa o oxidativa.

Disuelva los gránulos de ARN seco en ocho microlitros de colorante de carga de gel dos. Confirme que el ARN marcado con P 32 se resuspende mediante el uso de un contador geer, prepare un gel de secuenciación desnaturalizante al 8% de poliacrilamida de acuerdo con los protocolos estándar. Usando un peine de 30 pocillos, cargue las muestras, incluyendo dos referencias y un control escindido.

Separe los fragmentos de ARN a 60 a 75 vatios durante dos horas y media. Exponga el gel seco a una pantalla de fósforo de almacenamiento durante la noche. Escanee la pantalla de fósforo con un sistema de imágenes para radiografías automáticas sin película.

A continuación, transfiera el archivo de imagen de gel al ordenador para su análisis. Para comenzar el análisis de datos, abra Safa y software de código abierto para el ajuste y la cuantificación de una sola banda. Cargue la secuencia de ARN como un archivo TXT de puntos seguido de la imagen de gel como un archivo de gel de puntos.

Defina los carriles y ajuste las intensidades de las bandas. A continuación, elija un carril de anclaje y realice una asignación de alineación de gel de las bandas a los nucleótidos que se produce en referencia a los ARN T una escalera de digestión. Cuantifique las intensidades de banda y utilice la función de gráfico de color de barra diagonal de normalización para normalizar y asignar residuos potencialmente invariantes.

Guarde la salida como un archivo txt. SFA genera una hoja de cálculo que contiene columnas, que representan carriles en el gel y filas que representan las integrales de banda individuales correspondientes al fragmento de ARN. En primer lugar, se deben identificar los sitios de protección que muestran un cambio notable en la accesibilidad al solvente comparando el perfil de protección derivado de la muestra de iones sin magnesio con el perfil de la concentración de iones de magnesio del punto final.

Cuanto menor sea el valor, más protegido estará el nucleótido contra el ataque de los radicales hidroxilo y viceversa. A continuación, cree curvas de transición de banda, intensidades individuales o grupos de nucleótidos frente a la concentración de magnesio y hierro utilizando un formato de hoja de cálculo y escale individualmente estas transiciones a la función de saturación fraccional como se describe en la parte de texto de este protocolo. Como paso final, ajusta los datos a la ecuación de la colina.

Este análisis escala la transición a la saturación fraccional, determina el punto medio de la transición y proporciona una prueba fenomenológica de si una transición es sigmoidal. Estos son los resultados representativos de los experimentos de huella de radicales hidroxilo P cuatro P seis RRNA. Las isotermas se derivaron de los geles de secuenciación analizados por Safa y luego se ajustaron como se describe en la sección de análisis.

La imagen de gel indica que la escisión de fondo es mínima y que la asignación de un solo nucleótido es posible debido a las bandas bien definidas en el carril T. La fragmentación del ARN inducida por radicales hidroxilo está muy por encima del fondo. La transición de iones de bajo a alto contenido de magnesio se asocia selectivamente con la disminución de la intensidad de los individuos y grupos de bandas que indican la formación de ARN.

La protección de la estructura terciaria se refiere a uno o grupos de nucleótidos contiguos cuyos cambios de escisión concomitantemente intensidades de banda se cuantifican y normalizan mediante análisis de Saffer. El resultado es un gráfico térmico que visualiza el grado de protección contra los radicales hidroxilo. La transición de color describe el cambio de accesibilidad tras la adición de magnesio y hierro: de blanco a rojo muestra nucleótidos más accesibles, mientras que de blanco a azul muestra nucleótidos más protegidos.

Cada grado de sombreado está asociado a un valor numérico, que se puede trazar como una curva de protección y analizar mediante un modelo vinculante como la ecuación de Hill. En este ejemplo, la constante de disociación de equilibrio de afiliada a la protección 1 5 3 a 1 5 5 es aproximadamente el doble que el valor correspondiente de la protección 1 6 3 a 1 6 4. Este experimento de huella de radicales hidroxi se puede realizar en un día y medio si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar guantes y una bata de laboratorio para evitar cualquier contaminación por ARN. Además, la concentración final de hierro depende del sistema experimental. Por lo tanto, recomendamos realizar un experimento de dosis-respuesta antes de la huella siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como la huella de radicales hidroxi resueltos en el tiempo, para responder preguntas adicionales. Por ejemplo, ¿en qué punto crítico del tiempo las moléculas de ARN alcanzan una confirmación mal plegada o activa después de su desarrollo? Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología estructural exploraran las interacciones terciarias moleculares inter y provisionales de los ácidos nucleicos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar la formación de la estructura terciaria de las moléculas de ARN. No olvide que el caate y la segunda etapa del fósforo son precauciones peligrosas, como el uso de guantes y gafas de protección, así como el uso de blindaje de plexiglás mientras se realiza este procedimiento.