Name: Metodología elastografía por resonancia magnética para la Evaluación de los tejidos Diseñado crecimiento Construct (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Aprende a evaluar propiedades mecánicas de tejidos diseñados mediante elastografía por resonancia magnética microscópica. Esta técnica no invasiva permite monitorear constructos adiposos y osteogénicos sin destruir las muestras.

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Esta investigación fue financiada en parte por el NIH-SR3 EB007299-02 y NSF Premio EPSCoR Primera.

1. Preparación de tejidos Construct El tejido de la construcción de proceso de preparación consta de tres etapas principales: la expansión de la población de células, la siembra de células en un andamio biomaterial, y la diferenciación a través del uso de químicos moléculas de señalización. El procedimiento para la preparación de constructo se basa en métodos realizados por Dennis et al., Hong et al., Y Marion y Mao 8,9,10. <ol><li> Después de la cultura y la expansión de la línea celular, las semillas de las células madre mesenquimales humanas (h MSC) sobre una esponja de gelatina (4 mm de diámetro, 3,5 mm de espesor) a una densidad de 1x10 6 células / ml para los huesos y 3x10 6 células / ml adiposo formación. </li><li> Para la diferenciación de las MSCs h en adiposo, se aplican los medios de inducción formados por adiposas dexametasona mM 1, 0,5 mM isobutil-metilxantina, 10 ug / ml de insulina humana recombinante, y 200 mM indometacina en medio celular expansiónvez que las células parecen confluir en el cadalso. Después de tres días, reemplazar los medios con 10 mg / ml de insulina humana recombinante en los medios de expansión para 24 horas y luego volver a los medios de inducción. Repetir el ciclo tres veces y luego cambiar sólo en los medios de mantenimiento cada dos días. </li><li> Para inducir la osteogénesis, preparar los medios de inducción osteogénicas haciendo una concentración final de dexametasona de 0,1 micras, 50 M de ácido L-ascórbico-2phosphate, y 10 mM de β-glicerofosfato medio celular en expansión. Vuelva a colocar los medios de comunicación con nuevas osteogénicas cada dos días. </li></ol> 2. Caracterización del actuador Caracterización del actuador es un paso vital para el experimento de la ERM. ERM se basa en la propagación de ondas mecánicas de cizallamiento para evaluar los valores locales de las propiedades mecánicas, por lo tanto, estas vibraciones mecánicas necesitan ser generado y caracterizado dentro del tejido de interés utilizando un actuador piezoeléctrico. Un exa ilustradaMPLE del proceso de caracterización se muestra en la Figura 3. El objetivo de este procedimiento es el de optimizar el movimiento del actuador con el fin de generar inofensivas ondas de corte con amplitudes significativas (~ 250 micras). <ol><li> Antes del experimento, se aplican 0,5% en gel de agarosa para encerrar el constructo en un tubo de ensayo de 10 mm. La temperatura del gel debe ser de aproximadamente 37 ° C para minimizar el daño a la construcción. </li><li> Después de permitir que los gel de agarosa cinco minutos para fijar a la temperatura ambiente, insertar la punta del motor piezoeléctrico de flexión en la superficie del gel. </li><li> Una el tubo que contiene la muestra y el actuador a un soporte rígido, y orientar el haz de láser Doppler la Vibrómetro hacia la punta del actuador mecánico. Ajustar el posicionamiento del sistema para optimizar la señal reflejada, utilice cinta reflectante si es necesario. </li><li> En base a la frecuencia de resonancia esperada del actuador mecánico, ajustar el generador de funciones para barrer el dgama de frecuencias eseado (es decir, 20 a 2000 Hz en este experimento) utilizando un voltaje de funcionamiento de 20 Vpp con una señal de ruido blanco. </li><li> Ver el espectro se caracteriza en el programa de Polytec Vibrosoft para identificar la frecuencia de resonancia del sistema y configurar el programa para la FFT y la velocidad como el eje y. </li><li> Para la medición de desplazamiento, ajuste el actuador para entregar una sinusoide continua en la frecuencia de resonancia indicado utilizando un voltaje de operación de 200 Vpp, y observar el desplazamiento generado se entrega a la superficie del gel. Establecer Vibrosoft para mostrar la FFT con el desplazamiento como el eje y. </li></ol> 3. Adquisición de imágenes <ol><li> Después de completar la caracterización del actuador, poner la muestra y el actuador en el centro del escáner de RMN. Para los experimentos de constructos de tejido, utilizar una bobina de RF pequeño y más sensible (es decir, 10 mm en este experimento) para la transmisión y recepción de la señal RF. (El procedimiento se muestra utiliza una T 9,4imán taladro vertical equipado con gradientes de triple eje, 100 g / cm). </li><li> Adquirir una imagen de explorador para la identificación de la ubicación de construcción. </li><li> Establecer los parámetros para la adquisición. Un típico in vitro sagital exploración tendrá un tiempo de repetición de 1000 ms, tiempo de eco de 20-40 ms, grosor de corte de 0.5-1.0 mm, y campo de visión de 12x10 mm 2 con un tamaño de la matriz de 128x128 pixels. </li><li> Para los parámetros elastografía, ajustar la frecuencia de actuador para el valor determinado por la calificación vibrómetro láser Doppler. En el presente estudio, un par bipolar se necesitaba con una amplitud gradiente de 50 g / cm. Otros parámetros para ajustar incluyen el retraso que se debe establecer en cero milisegundos para la adquisición inicial. </li><li> Cambiar el generador de funciones a modo de ráfaga y ajustar los parámetros del generador de funciones para que coincida con los de los parámetros de adquisición de elastografía incluyendo la frecuencia y el número de ciclos. Además, establece la funciónción generador para ser disparado externamente. </li><li> Para obtener una imagen sagital, establezca la sensibilización de movimiento para estar en la dirección de corte positivo y comenzar la búsqueda. Tras la adquisición, comprobar la imagen y cambiar la sensibilización a la dirección de corte negativo. </li><li> Ejecutar el programa MATLAB que llevará a cabo la división complejo para la generación de la imagen de onda de corte. </li><li> Evaluar la imagen de la presencia de ondas de corte y objetos posibles, tales como ajuste de fase. </li><li> Si no hay ajustes a la imagen es necesario, ajustar el tamaño del parámetro de la matriz de ocho valores igualmente espaciados que van desde cero segundos para un periodo completo de la frecuencia de resonancia caracteriza. </li><li> Adquirir una exploración en ambas las orientaciones rebanada positivos y negativos. </li><li> Una vez que las imágenes se adquieren, utilizan un programa en MATLAB diseñada para la generación de los datos de ondas de corte de una serie de imágenes. </li></ol> 4. Experimento ERM Procesamiento de Imágenes <ol><li> Thpaso e final de la ERM es calcular la rigidez a cortante de las imágenes de ondas de corte. Colocar los datos en el programa de MATLAB que se evaluará el conjunto de datos en tres dimensiones (2 espacial, un temporal). </li></ol> Nota: Al asumir una onda transversal plana, las ecuaciones de movimiento que permite desacoplar la estimación de los módulo complejo con valores de cizalladura como una función del desplazamiento y su Laplaciano. El algoritmo se aproxima segundas derivadas espaciales con diferencias finitas y calcula el módulo de cizallamiento sobre una base pixel por pixel. A partir de este número complejo, muchos parámetros mecánicos se puede deducir tales como la velocidad de onda de corte, atenuación de la onda, la rigidez de cizallamiento, la elasticidad de cizallamiento, la viscosidad de cizallamiento, etc El algoritmo también permite la selección de las regiones de interés para los que la desviación media y estándar de cada parámetro se calcula. <ol start="2"><li> Los parámetros de imagen deben ser especificado al comienzo del programa. Además, ªlímite superior de la electrónica elastograma se puede ajustar para optimizar el contraste en la muestra. </li></ol> Nota: El programa ofrece los resultados intermedios (la onda después de filtros de paso bajo, ola tras el filtrado de dirección, temporal, FFT, perfiles de línea, etc) que ayudan al usuario calcular la fidelidad de la recuperación. <ol start="3"><li> Algunos parámetros se pueden ajustar sobre la base de esta información, tales como los niveles de filtros de paso bajo, la frecuencia temporal del movimiento, la dirección de propagación de la onda, etc La desviación estándar de un parámetro en una región específica de interés es también un indicador de la calidad del cálculo. </li></ol> 5. Los resultados representativos Figura 4 notas el cambio en las propiedades mecánicas a lo largo de cuatro semanas de desarrollo y construcción osteogénico adipogénica. ERM se realizó en 730 a 820 Hz. Mientras tanto las esponjas sembradas comenzó aproximadamente a las 3 kPa, osteogenic tejidos dirigidos dado lugar a una rigidez de 22 kPa, mientras que, los tejidos adiposos dirigido disminución de la rigidez a 1 kPa. Por otra parte, las construcciones osteogénicas mostró una notable disminución en el tamaño en comparación de principio a fin del estudio. Las propiedades adicionales derivadas de estudio elastografía se muestran en la Tabla 1. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. El proceso de adquisición de imágenes para elastografía por resonancia magnética. Durante la adquisición de la imagen, una secuencia de impulsos (a) controla la sincronización (b) del generador de funciones con los pulsos gradientes bipolar del equipo de resonancia magnética. Después de la adquisición de los gradientes bipolar activarse en orientaciones positivas y negativas, (c) una imagen de onda de corte se produce utilizando compleja división. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Diagrama de flujo del proceso de ERM para el motor de los tejidosconstrucciones Nimrais. En primer lugar, las células (a) son primero crecido y ampliado para el tamaño de la población esencial para el proyecto diseñado. Entonces las células se siembran (b) en un andamio biomaterial y reactivos químicos se aplican a la señal de diferenciación. Los andamios se caracterizan con MRE, cuya primera etapa (c) es la determinación de la frecuencia de resonancia del actuador acoplado a la construcción. Imágenes siguientes, MRI (d) son adquiridos para generar una imagen de onda de corte (e). Finalmente, un algoritmo se aplica para dar un elastograma (f) que los mapas de la rigidez de la construcción. Al mismo tiempo, las construcciones son seccionadas para la evaluación histológica (g) con el fin de validar la diferenciación. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Procedimiento actuador caracterización. El andamio gelatina está encerrada por un 0,5% en gel de agarosa. Para caracterizar el movimiento se transfiere a la muestra un ruido blanco se envía primero en el sistema(1a) y el movimiento resultante se detecta usando un láser Doppler Vibrómetro (1b). Una vez que la frecuencia de resonancia está determinada, una señal continua sinusoide a la resonancia (2a) se envía para determinar el desplazamiento (2b) transferido al medio ambiente gelatina. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Construir mapa de desarrollo a lo largo período de cuatro semanas. Adipogenic (A) y osteogénico (O) constructos se muestran de izquierda a derecha con una magnitud correspondiente y las imágenes de cizallamiento de onda, elastograma, y ​​la rigidez cortante promedio. El mapa de colores para los elastograma corresponde con el esquema de colores del gráfico de barras y barras de error representan la desviación estándar dentro de la región cada constructo de interés. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618Table1.jpg" alt="Tabla 1"/&gt; Tabla 1. Propiedades mecánicas de los constructos adiposo y osteo durante un período de cuatro semanas de crecimiento.

<ol><li>Xu, H., Othman, S. F., Magin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+tissue+engineering+using+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Monitoring tissue engineering using magnetic resonance imaging.</a> J. Biosci. Bioeng. 106, 515-527 (2008).</li>
<li>Xu, H., Othman, S. F., Hong, L., Peptan, I. A., Magin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+microscopy+for+monitoring+osteogenesis+in+tissue-engineered+construct+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance microscopy for monitoring osteogenesis in tissue-engineered construct in vitro.</a> Phys. Med. Biol. 51, 719-732 (2006).</li>
<li>Othman, S. F., Xu, H., Royston, T. J., Magin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+magnetic+resonance+elastography+%28microMRE%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Microscopic magnetic resonance elastography (microMRE.</a> Magn. Reson. Med. 54, 605-615 (2005).</li>
<li>Muthupillai, R., Lomas, D. J., Rossman, P. J., Greenleaf, J. F., Manduca, A., Ehman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+elastography+by+direct+visualization+of+propagating+acoustic+strain+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance elastography by direct visualization of propagating acoustic strain waves.</a> Science. 269, 1854-1857 (1995).</li>
<li>Othman, S. F., Curtis, E. T., Plautz, S. A., Pannier, A. P., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+elastography+monitoring+of+tissue+engineered+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance elastography monitoring of tissue engineered constructs.</a> NMR Biomed. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Oliphant, T. E., Manduca, A., Ehman, R. L., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex-valued+stiffness+reconstruction+for+magnetic+resonance+elastography+by+algebraic+inversion+of+the+differential+equation%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Complex-valued stiffness reconstruction for magnetic resonance elastography by algebraic inversion of the differential equation.</a> Magn. Reson. Med. 45, 299-310 (2001).</li>
<li>Ringleb, S. I., Chen, Q., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L., An, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+shear+wave%3A+comparison+to+a+dynamic+shear+material+test%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Quantitative shear wave: comparison to a dynamic shear material test.</a> Magn. Reson. Med. 53, 1197-1201 (2005).</li>
<li>Hong, L., Peptan, I., Clark, P., Mao, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+adipose+tissue+engineering+by+human+marrow+stromal+cell+seeded+gelatin+sponge%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Ex vivo adipose tissue engineering by human marrow stromal cell seeded gelatin sponge.</a> Ann. Biomed. Eng. 33, 511-517 (2005).</li>
<li>Dennis, J. E., Haynesworth, S. E., Young, R. G., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenesis+in+marrow-derived+mesenchymal+cell+porous+ceramic+composites+transplanted+subcutaneously%3A+effect+of+fibronectin+and+laminin+on+cell+retention+and+rate+of+osteogenic+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Osteogenesis in marrow-derived mesenchymal cell porous ceramic composites transplanted subcutaneously: effect of fibronectin and laminin on cell retention and rate of osteogenic expression.</a> Cell Transplant. 1, 23-32 (1992).</li>
<li>Marion, N. W., Mao, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells and tissue engineering.</a> Methods Enzymol. 420, 339-361 (2006).</li>
<li>Rydberg, J., Grimm, R., Kruse, S., Felmlee, J., McCracken, P., Ehman, R. L. Fast spin-echo magnetic resonance elastography of the brain. Proceedings of the International Society of Magnetic Resonance in Medicine, Glasgow, Scotland, , 1647-1647 (2001).</li>
<li>Kruse, S. A., Grim, R. C., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L. Fast EPI based 3D MR elastography of the brain. Proceedings of the International Society for Magnetic Resonance in Medicine, Seattle, Washington, , 3385-3385 (2006).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.

En este procedimiento, el proceso de ERM para construcciones de ingeniería tisular se demuestra de preparación de células para la generación de una elastograma. Mediante la aplicación de un método no destructivo evaluación mecánica a la tubería ingeniería de tejidos, ahora es posible evaluar los cambios en las construcciones de ingeniería a lo largo de múltiples etapas de desarrollo. Además, ERM complementa otros métodos de resonancia magnética para el tejido de vigilancia construcciones de ingeniería tales como la difu...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del Material </td><td> Tipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> MSCGM Bullet-Kit </td><td> Reactivo </td><td> Lonza </td><td> PT-3001 </td><td> Almacenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> 1X DPBS </td><td> Reactivo </td><td> Invitrogen </td><td> 21600-010 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% de tripsina-EDTA </td><td> Reactivo </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td> Almacenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> La dexametasona </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2915 </td><td></td></tr><tr><td> 3-isobutil-1-metilxantina </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I5879 </td><td> Almacenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> La insulina bovina páncreas </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td><td> Almacenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> La indometacina </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I7378 </td><td></td></tr><tr><td> Β-glicerofosfato </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9891 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido L-ascórbico 2-fosfato </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8960 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Andamio </td><td> Pharmacia &amp; Upjohn Co. </td><td> 09-0315-08 </td><td></td></tr><tr><td> Las células madre mesenquimales </td><td> Línea Celular </td><td> Lonza </td><td> PT-2501 </td><td></td></tr><tr><td> 9.4T MR escáner </td><td> Equipo </td><td> Agilent </td><td></td><td> 400MHz BM </td></tr><tr><td> 10 mm bobina Litz </td><td> Equipo </td><td> Doty Científico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vibrómetro láser Doppler </td><td> Equipo </td><td> Polytec </td><td> PDV-100 </td><td></td></tr><tr><td> Vibrosoft (20) </td><td> Software </td><td> Polytec </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Generador de funciones </td><td> Equipo </td><td> Agilent </td><td> AFG 3022B </td><td></td></tr><tr><td> Amplificador </td><td> Equipo </td><td> Piezo inc </td><td> EPA-104-115 </td><td></td></tr><tr><td> Piezo flexión del motor </td><td> Equipo </td><td> Piezo inc. </td><td> T234-A4Cl-203X </td><td></td></tr><tr><td> PC-Linux </td><td> Equipo </td><td> Procesador: Intel Core 2 Duo E8400 Memoria: 2G </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PC-Windows </td><td> Equipo </td><td> Procesador: Intel Core 2 Duo E8400 Memoria: 2G </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MATLAB </td><td> Software </td><td> Mathworks, Inc </td><td></td><td> 2009b </td></tr></tbody></table>

metodología elastografía por resonancia magnética para la evaluación de los tejidos diseñado crecimiento construct

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Ensayos mecánicos tradicionales a menudo da como resultado la destrucción de la muestra, y en el caso de los tejidos a largo plazo diseñado construir estudios, el uso de la evaluación destructiva no es aceptable. Una alternativa propuesta es el uso de un proceso de imagen llamado elastografía por resonancia magnética. La elastografía es un método no destructivo para determinar el resultado de ingeniería mediante la medición de los valores locales de propiedad mecánica (es decir, complejo módulo de corte), que son esenciales para la identificación de marcadores de la estructura y funcionalidad de un tejido. Como un medio no invasivo para la evaluación, el seguimiento de las construcciones de ingeniería con técnicas de imagen como la resonancia magnética (RM) se ha visto un creciente interés en la última década 1. Por ejemplo, los de resonancia magnética (RM) las técnicas de difusión y relaxometría han sido capaces de caracterizar los cambios en las propiedades químicas y físicas durante el desarrollo de ingeniería tisular 2. El método propuesto enel protocolo siguiente, se utiliza elastografía microscópico resonancia magnética (μMRE) como una técnica no invasiva MR basado para medir las propiedades mecánicas de los tejidos blandos pequeñas 3. MRE se consigue mediante el acoplamiento de un actuador mecánico sónica con el tejido de interés y el registro de la propagación de la onda de cizallamiento con un escáner de RM 4. Recientemente, μMRE ha sido aplicada en la ingeniería de tejidos para adquirir información de crecimiento esencial que tradicionalmente se midió utilizando técnicas mecánicas destructivas macroscópicas 5. En el procedimiento siguiente, elastografía se logra mediante la formación de imágenes de construcciones de ingeniería con una modificación Hahn spin-eco secuencia junto con un actuador mecánico. Como se muestra en la Figura 1, la secuencia modificada de adquisición de imágenes se sincroniza con la transmisión de ondas de corte exteriores; posteriormente, el movimiento es sensibilizado a través del uso de la oscilación de los pares bipolares. Tras la recogida de las imágenes con movimiento positivo y negativo sensibilización, compleja división de los datos se encuentra una imagen de onda de corte. Entonces, la imagen se evaluó utilizando un algoritmo de inversión para generar un mapa rigidez cortante 6. Las mediciones resultantes en cada voxel se ha demostrado una correlación significativa (R 2&gt; 0,9914) con los datos recolectados a través de un análisis mecánico dinámico 7. En este estudio, la elastografía se integra en el proceso de desarrollo de los tejidos para el control de células madre mesenquimales humanas (h MSC) la diferenciación en las construcciones y adipogenic osteogénico, como se muestra en la Figura 2.

El procedimiento muestra la metodología de la elastografía por resonancia magnética para supervisar el desenlace de ingeniería de tejido adiposo y las construcciones de ingeniería tisular a través de osteogénicas evaluación no invasiva local de las propiedades mecánicas mediante la elastografía por resonancia magnética microscópica (μMRE).

Metodología elastografía por resonancia magnética para la Evaluación de los tejidos Diseñado crecimiento Construct

Las pruebas mecánicas tradicionales suelen provocar la destrucción de la muestra y, en el caso de los estudios de constructos de ingeniería de tejidos a largo plazo, el uso...

Para examinar construcciones de tejidos diseñados, las pruebas mecánicas tradicionales, que a menudo resultan en la destrucción de la muestra, no son aceptables. Este método utiliza la elastografía por resonancia magnética microscópica o micro MRE como una técnica no invasiva para medir las propiedades mecánicas de tejidos blandos pequeños. Primero, las células se siembran sobre un andamiaje de biomaterial para generar el tejido.El tejido se suspende en gel de aros, y la punta de un actuador se coloca dentro del gel. Luego, para caracterizar el movimiento del actuador, este se transfiere a la muestra y se detecta mediante un láser. Doppler viter.La muestra y el actuador se transfieren a un imán y a resonancia magnética. Se adquieren imágenes de elastografía. El análisis de las imágenes resultantes muestra el cambio en la rigidez al corte para ambos constructos osteogénicos y adipogénicos.Primero tuvimos la idea de esta técnica y observamos la fotografía de residencia magnética para su uso en el diagnóstico de enfermedades, y nos dimos cuenta de que podría extenderse a la ingeniería de tejidos. La principal ventaja de esta técnica frente a otras técnicas existentes, como las pruebas mecánicas, es que aplica la tecnología no invasiva de resonancia magnética a las propiedades mecánicas principales de los tejidos. Las aplicaciones de esta técnica se extienden a la ingeniería de tejidos porque el conocimiento de las propiedades mecánicas garantizará su adecuación para los usos previstos en la ingeniería de hueso y cartílago.Aunque estos métodos proporcionan información valiosa sobre la ingeniería de tejidos, también pueden utilizarse para diagnosticar enfermedades en diferentes órganos, como la fibrosis hepática, la lesión cerebral traumática o el cáncer cerebral, por ejemplo. La demostración visual de este método es fundamental porque incluye pasos difíciles de aprender, así como el conocimiento previo de la ingeniería de tejidos y la imagenología por ritmo de magnitud. Gars. El proceso de preparación del constructo tisular consta de tres etapas principales: expansión de la población celular, siembra de células sobre un andamio de biomaterial y diferenciación mediante el uso de moléculas señalizadoras químicas.Después del cultivo y la expansión de la línea celular, siembre las células madre mesenquimales humanas o CMMH sobre una esponja de gelatina a una densidad de una vez 10 a la seis células por mililitro para la formación ósea. Aproximadamente tres días después, las células deben aparecer confluentes sobre el andamio para inducir la diferenciación. Retire el medio y sustitúyalo por medio de inducción adipogénica.Luego, incubar las células a 37 grados Celsius con 5 % de dióxido de carbono después de tres días. Reemplazar el medio con medio de mantenimiento, que consiste en medio de expansión que contiene 10 microgramos por mililitro de insulina recombinante humana. Después de incubar durante 24 horas, reemplazar el medio de mantenimiento con medio de inducción.Repita este ciclo tres veces. Cambie el medio de mantenimiento cada dos días durante cuatro semanas para inducir la osteogénesis. Sustituya por medio osteogénico fresco cada dos días durante toda la duración del estudio.Aquí el estudio tiene una duración de cuatro semanas y se realiza elastografía por resonancia magnética cada semana. La elastografía por resonancia magnética depende de la propagación de ondas mecánicas de corte para evaluar los valores locales de las propiedades mecánicas. Por lo tanto, estas vibraciones mecánicas deben generarse y caracterizarse dentro del tejido de interés utilizando un actuador piezoeléctrico. Para preparar la muestra, transfiera el cultivo de tejido a un tubo de ensayo de 10 milímetros de diámetro que contenga una base sólida y una capa de gel AGROS al 0,5 %.Luego agregue gel acro tibio al 0,5 %. Para encapsularlo. Deje que el gel de agarosa se endurezca durante cinco minutos.A temperatura ambiente, inserte la punta del motor eléctrico de flexión piso en la superficie del gel. A continuación, conecte el tubo que contiene la muestra y el actuador a un soporte rígido. Oriente el haz del barómetro láser Doppler hacia la punta del actuador mecánico.Ajuste la posición del sistema para optimizar la intensidad de la señal reflejada, que se muestra en el barómetro. Para maximizar la reflexión, utilice cinta reflectante si es necesario, y configure el actuador para generar ondas de cizalladura inofensivas con amplitudes significativas de aproximadamente 250 micrones. Configure el generador de funciones para barrer el rango de frecuencias deseado utilizando un voltaje de operación de 20 voltios pico a pico con una señal de ruido blanco.Para este experimento, el rango de frecuencia deseado es de 20 a 2000 hercios. Para visualizar el espectro caracterizado en el programa Polytech Rsof, seleccione velocidad y visualización FFT. Comience a capturar la señal e identifique la frecuencia de resonancia del sistema en función de los picos del espectro.A continuación, para medir la deflexión del actuador, configure el actuador para que entregue un sinusoidal continuo a la frecuencia de resonancia caracterizada. Utilizando un voltaje de operación de 200 voltios pico a pico, denote el desplazamiento generado que entrega el actuador a la superficie del gel. Configure la fibra blanda para mostrar la FFT con el desplazamiento como eje Y. Una vez que el actuador haya sido caracterizado, coloque el tubo de ensayo que contiene la muestra y el actuador en una ranura de una bobina RF de 10 milímetros, y coloque la muestra y el actuador en el centro del escáner de MRI.Adquiera una imagen preliminar para la identificación de la ubicación del constructo. Una vez localizado el constructo de tejido, establezca los parámetros para la adquisición. Una exploración sagital típica in vitro tendrá un tiempo de repetición de 1000 milisegundos.Tiempo de eco de 20 a 40 milisegundos, espesor de corte de 0,5 a un milímetro y campo de visión de 12 por 10 milímetros cuadrados, con un tamaño de matriz de 128 por 128 píxeles. Para los parámetros de elastografía, ajuste la frecuencia del actuador al valor determinado mediante la caracterización láser Doppler vibracional. Para esta muestra, se necesita un par bi con una amplitud de gradiente de 50 gauss por centímetro y un retardo de MRE ajustado a cero.Cambie el generador de funciones al modo de ráfaga y ajuste los parámetros del generador de funciones para que coincidan con los parámetros de adquisición de elastografía, incluyendo la frecuencia y el número de ciclos. También configure el generador de funciones para que sea activado externamente. Para obtener una imagen sagital, establezca la sensibilización al movimiento en la dirección positiva del corte y comience la exploración tras la adquisición.Revise la imagen para evaluar la calidad de la señal en el constructo de tejido. Si la imagen parece demasiado oscura, ajuste los parámetros de RM y adquiera otra exploración. A continuación, cambie la sensibilización a la dirección negativa del corte.Transfiera los archivos desde el escáner de MRI a otro ordenador equipado con MATLAB y ejecute el programa de MATLAB que realizará una división compleja para generar una imagen que muestre la propagación de ondas cortantes. Evalúe la imagen en busca de la presencia de ondas cortantes y posibles artefactos; se pueden trazar perfiles de línea de fase plegada para evaluar mejor la calidad y la amplitud de la onda. Si ocurre plegado, disminuya la amplitud del gradiente y realice una nueva adquisición.Si no son necesarios ajustes en la imagen. Ajuste el tamaño del arreglo de parámetros a ocho valores igualmente espaciados que abarquen desde cero segundos hasta un período completo de la frecuencia de resonancia caracterizada. Adquiera una exploración tanto en las orientaciones de corte positiva como negativa una vez que se hayan adquirido las imágenes.Utilice un programa MATLAB diseñado para generar los datos de la onda de cizalladura y la película correspondiente de la propagación de la onda en la muestra. Este es el archivo que se necesitará para estimar las propiedades mecánicas. El paso final de la MRE consiste en calcular la rigidez de cizalladura a partir de las imágenes de la onda de cizalladura.Comience colocando los datos en el programa MATLAB que evaluará el conjunto de datos tridimensional, especifique los parámetros de imagen, incluyendo el campo de visión, gradiente, amplitud y número de pares bipolares, y ejecute el código. El algoritmo permite la selección de regiones de interés para las cuales se calculan la media y la desviación estándar de cada parámetro. Dibuje los contornos del constructo tisular para seleccionar la región de interés.Se muestran la media y la desviación estándar de la rigidez, el módulo de almacenamiento y el módulo de pérdida dentro de la región de interés seleccionada. El programa también proporciona resultados intermedios, incluyendo la onda tras los filtros, la onda tras el filtrado direccional y los perfiles lineales, que ayudan a estimar la fidelidad de la recuperación. Para una estimación precisa, la onda filtrada debe ser suave.La desviación estándar de un parámetro en una región específica de interés también es un indicador de la calidad del cálculo; si es necesario, ajuste otros parámetros según sea necesario para obtener valores precisos de las propiedades mecánicas y observar los cambios en las propiedades mecánicas de los constructos diseñados a medida que se desarrollan. La prueba de ERM se aplicó durante un período de cuatro semanas. Este mapa de desarrollo de constructos muestra constructos adipogénicos indicados con la letra A y osteogénicos indicados con la letra O, con sus imágenes de magnitud correspondientes, imágenes de onda de cizallamiento, AEL y rigidez al corte promedio mostradas.El mapa de colores para las ELA corresponde con el esquema de colores de la barra. El gráfico y las barras de error representan la desviación estándar dentro de cada región de interés del constructo. Con el tiempo, los constructos adipogénicos se volvieron menos rígidos, lo que indica propiedades similares al tejido adiposo.De manera similar, los constructos osteogénicos se volvieron más rígidos durante el período de cuatro semanas, lo que indica una diferenciación similar a la ósea. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente dos horas si se lleva a cabo correctamente. Durante el intento de este procedimiento, es importante caracterizar completamente el actuador tras seguir este procedimiento. Métodos como el análisis bioquímico y la histología pueden utilizarse para responder preguntas como la confirmación del depósito mineral.No olvide que al trabajar con material celular humano y resonancia magnética, puede ser extremadamente peligroso y es fundamental tener conocimiento de las precauciones adecuadas de nivel de bioseguridad dos y de resonancia magnética. Se deben tomar precauciones al realizar estos procedimientos.

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