Guiada por tomografía computarizada dominio del tiempo de fluorescencia difusa tomografía en pequeños animales para la localización de biomarcadores de cáncer

El objetivo general del siguiente experimento es producir imágenes de fluorescencia de la expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico en un modelo de ratón con glioma ortotópico. Esto se logra inoculando el hemisferio cerebral izquierdo de un ratón A IIC con proteína verde fluorescente que expresa células de glioma humano U2 51. Después de que el tumor ha crecido durante dos semanas, se inyecta al ratón un cóctel de dos trazadores fluorescentes.

A continuación, se obtienen imágenes del ratón en un sistema de rayos X para animales pequeños para recopilar los datos anatómicos necesarios para una reconstrucción precisa de la imagen. Los datos se utilizan para posicionar anatómicamente la fuente y detectar ubicaciones del sistema de tomografía óptica, y se utiliza un software personalizado para recopilar los datos de fluorescencia y construir la imagen final. En última instancia, este método puede construir una imagen de un tumor basada en su sobreexpresión del factor de crecimiento epidérmico utilizando imágenes de fluorescencia y rayos X, cuya precisión se puede comparar con imágenes de resonancia magnética con contraste.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la tomografía de fluorescencia de animales pequeños basada en dispositivos de acoplamiento de carga, es que la detección de conteo de fotones individuales mediante tubos fotomultiplicadores ofrece una sensibilidad y un rango dinámico mucho mayores para la detección de luz. En última instancia, este método se puede utilizar para monitorear y medir el éxito de las terapias moleculares mediante la medición de la expresión de sus objetivos, mientras que los tumores subcutáneos se obtienen fácilmente con métodos no tomográficos que utilizan imágenes de superficie. Este sistema está diseñado para obtener imágenes a través de tejido de hasta varios centímetros de grosor, lo que lo hace especialmente adecuado para la obtención de imágenes, contraste, administración de agentes y fugas en tumores cerebrales.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la expresión de biomarcadores del cáncer, también se puede aplicar a otros estudios de enfermedades como la infección, la obesidad o elementos del envejecimiento como el Alzheimer. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la naturaleza difusa de la propagación de la luz en el tejido biológico y la dificultad de usar la tomografía de rayos X para la reconstrucción con luz difusa. La demostración visual de este método es fundamental.

Dado que los pasos de recopilación de datos y reconstrucción de imágenes pueden ser difíciles de aprender, es importante asegurarse de que los datos recopilados del sistema fluorescente estén bien calibrados. El paquete de software casi rápido había sido diseñado para leer datos ópticos y usar las imágenes de tomografía de rayos X para crear una malla de elementos finitos, que se utiliza como plantilla espacial para la reconstrucción de fluorescencia. Para comenzar, coloque un ratón desnudo atímico anestesiado sobre un paño quirúrgico estéril y confirme la profundidad de la anestesia antes de proceder a limpiar y desinfectar la piel sobre el área de la incisión.

Con Betadine coloque un paño quirúrgico estéril sobre el sitio de la incisión con un bisturí, haga una pequeña incisión ligeramente a la izquierda de la línea media y 0,5 centímetros después de la línea intraocular. Limpie la superficie del cráneo eliminando cualquier tejido conectivo para que se puedan identificar los puntos de referencia. Una vez que el cráneo esté expuesto, use un taladro de alta velocidad con una broca estéril de un milímetro para hacer un agujero que esté dos milímetros a la izquierda de la línea central y dos milímetros detrás del bgma.

Cargue una jeringa Hamilton Micros con una aguja roma de calibre 27 con las células que se van a implantar. A continuación, coloque el ratón sobre un marco estereotáxico. A continuación, confirme un plano quirúrgico y estético profundo con un pellizco en el dedo del pie y vuelva a colocar el paño quirúrgico en el animal.

A continuación, fije la jeringa cargada en el marco estereotáxico. Coloque la jeringa sobre el orificio del cráneo e inserte la punta de la aguja tres milímetros por debajo de la superficie del cráneo. A continuación, retira la aguja un milímetro para crear un bolsillo.

El siguiente paso es inyectar lentamente las células en el hemisferio cerebral izquierdo durante un período de cinco minutos. Una vez completada la inyección, retire la aguja y frote el orificio con Betadine. Para evitar que las células crezcan fuera del lugar de la inyección, retire el ratón del marco estereotáxico y rellene el orificio expuesto con cera ósea precalentada.

Por último, cierre el sitio de la incisión con una sutura estéril de nylon. Regrese el ratón a una jaula caliente y vigile hasta que se recupere después de la recuperación, inyecte al ratón 130 microlitros de 0,1 miligramos por kilogramo de buprenorfina IP y permita que el tumor crezca durante 14 días antes de la toma de imágenes. El día de la toma de imágenes del ratón, inicie el sistema para permitir que los láseres y los detectores de luz se calienten durante aproximadamente 20 minutos.

Para evitar desviaciones y sensibilidad del sistema, coloque un difusor de línea de ingeniería de 100 grados por cuatro grados en el centro directo del pórtico de imágenes para dispersar los láseres de excitación entre los canales de detección del sistema con la misma intensidad. Ajuste el ángulo del difusor a mano para maximizar la cantidad de señal detectada por los cinco canales de recolección de luz. Siguiente lugar: densidad óptica.

Dos filtros de densidad neutra delante de todos los tubos fotomultiplicadores de detección de fluorescencia llamados PMTs y densidad óptica. Un filtro de densidad neutra frente a toda la detección de transmitancia. Los PMT recopilan 100 funciones de dispersión de pulso temporal o T psfs del láser, cada una con un tiempo de integración de un segundo para cada láser secuencialmente, normalizan cada TPSF por la referencia del láser, corrigen la deriva temporal en la referencia del láser y promedian todas las iteraciones para cada detector y cada láser por separado.

Estos TPS promedio son las funciones de respuesta del instrumento específico del detector que se utilizan en la reconstrucción óptica de la imagen 12 horas antes del procedimiento de imagen. Inyecte al ratón de prueba un cóctel de trazadores fluorescentes. La calibración precisa del sistema de tomografía fluorescente y la restricción del movimiento de los animales son los aspectos más difíciles de este procedimiento.

La reconstrucción de las imágenes está tan mal planteada que incluso pequeños errores en la recopilación de datos pueden conducir a errores significativos en la imagen reconstruida. Para garantizar que se recopilen datos precisos, inmovilizamos el mouse lo mejor posible y repetimos la calibración antes y después del escaneo para mejorar las posibilidades de obtener una calibración precisa cuando esté listo. Coloque al animal anestesiado sobre los soportes de fibra de vidrio de la cama de imágenes.

Después de colocar la cabeza en el cono de la nariz para la anestesia continua con gas, asegure los dientes en la barra de mordida y tape al animal. El ratón debe colocarse en el centro aproximado del pórtico de imágenes. Este posicionamiento se puede guiar girando el láser de excitación 180 grados alrededor del ratón, asegurando que el punto focal del láser ilumine un punto aproximadamente en el centro del ratón desde la perspectiva del láser en todos los ángulos.

Una vez colocados correctamente, se transfiere cuidadosamente la cama de imagen y el ratón al escáner micro CT y se recoge información anatómica a una resolución de 93 micrómetros isotrópica para toda la cabeza del ratón. Visualice la pila de imágenes de TC y elija los cortes que se van a visualizar con el sistema de tomografía de fluorescencia. Transfiera con cuidado la cama de imágenes y el ratón al sistema de tomografía de fluorescencia.

Elija el número de posiciones de la fuente para cada corte de imagen, el tiempo de integración para cada medición de TPSF, el número de iteraciones para cada posición de la fuente y la posición y el número de cortes de imagen deseados de la pila de imágenes CT creada anteriormente. A continuación, coloque los filtros frente a los PMT de detección de fluorescencia para bloquear toda la luz de excitación y la densidad óptica a los filtros de densidad neutra frente a los PMT de detección de transmitancia. Para evitar la saturación de esos detectores, ejecute el software de adquisición de datos que recopila fluorescencia y transmitancia t psfs en cada posición definida del detector de fuente en ambas longitudes de onda de excitación.

Para cada conjunto de T psfs recogidos, monitorice y registre la intensidad del láser con un canal PMT de referencia. Determine la superficie exterior del ratón y la ubicación de la cama de imágenes. Soporte varillas de las imágenes de TC y cree máscaras que cubran los confines del ratón y la varilla de imagen.

Por separado, use la máscara de ratón para producir una malla de elementos finitos del animal usando el software casi rápido. Localice las posiciones de la fuente y el detector del sistema de tomografía de fluorescencia en la superficie de la malla en función de las coordenadas de registro espacial micro CT y fluorescente. Elimine los puntos de datos ópticos asociados con las posiciones de la fuente o del detector que interactúan con la ubicación del lecho de imágenes.

Las varillas de soporte normalizan los datos recopilados en cada posición del detector de fuente por la referencia láser, corrigen la deriva temporal en la referencia láser y corrigen las sensibilidades del filtro, que se determinaron mediante pruebas experimentales en el momento de la compra. Tome la relación de nacimiento de los datos para cada posición del detector de fuente y multiplíquela con una simulación de modelo directo de transmitancia basada en la malla animal de elementos finitos para propiedades ópticas uniformes. Esto se hace para mitigar los errores asociados con el acoplamiento del tejido de la fuente o del detector, para calibrar los datos con el modelo y para ajustar los datos por otros aspectos de la discordancia de datos del modelo, construir un vector de datos compuesto por la diferencia escalada de los datos de la relación de nacimiento, recopilados en ambas longitudes de onda.

El factor de escala se elige para maximizar el contraste de unión de EGFR, realizar la reconstrucción de la imagen en el dominio del tiempo con los datos de diferencia calibrados utilizando el TPSF para cada canal de detección como entrada y crear mapas de fluorescencia del trazador dirigido mejorado por contraste observado. Este es un ejemplo de una reconstrucción de fluorescencia superpuesta con una imagen anatómica de TC registrada conjuntamente de un ratón con un tumor de glioma ortotópico U2 51. El centro de masa del glioma, determinado por la reconstrucción con fluorescencia, estaba a menos de un milímetro del centro de masa del tumor, determinado por resonancia magnética con contraste.

El software para la adquisición de datos está hecho a medida para este dispositivo, pero la mayoría de las técnicas de procesamiento de imágenes se pueden realizar utilizando el software casi rápido available@nearfasts.org. Por lo tanto, al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que tanto el sistema como los datos estén calibrados con precisión antes de la reconstrucción de la imagen. Esta calibración requiere que se tengan en cuenta la sensibilidad y las diferencias temporales entre los detectores después de la reconstrucción de la imagen de un trazador dirigido a un biomarcador.

Imágenes similares de un marcador no dirigido proporcionan un medio para corregir la captación no mediada por receptores. Esto permite cuantificar la cantidad de unión al trazador, así como la densidad del receptor in vivo después de su desarrollo. Esta técnica inspiró a otros investigadores a diseñar sistemas de tomografía de fluorescencia guiada por imágenes de rayos X y allanó el camino para la obtención de imágenes de cuerpo entero de animales más grandes.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo llevar a cabo un experimento de tomografía de fluorescencia difusa, que combina imágenes anatómicas de rayos X y sistemas de imágenes ópticas para obtener imágenes de biomarcadores de cáncer.