Tomografía mediada por fluorescencia para la detección y cuantificación de la inflamación Intestinal murina relacionadas con macrófagos
December 15th, 2017
Sondas específicas de objetivo representan una herramienta innovadora para el análisis de los mecanismos moleculares, como la expresión de proteínas en diversos tipos de enfermedad (p. ej., inflamación, infección y tumorigenesis). En este estudio, describimos una evaluación tomográfica tridimensional cuantitativa de la infiltración de macrófagos intestinales en un modelo murino de colitis con F4/80-específica mediada por fluorescencia tomografía.
El objetivo general de este enfoque de imagen in vivo específico de la diana es visualizar los marcadores moleculares de la actividad de la enfermedad en la enfermedad inflamatoria intestinal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la enfermedad inflamatoria intestinal y la investigación terapéutica relacionada sobre la influencia de terapias experimentales o eventos celulares específicos en la inflamación. La principal ventaja de esta técnica es que la actividad de la enfermedad se puede monitorizar de forma longitudinal y no invasiva.
Aunque este método puede proporcionar información sobre los trastornos inflamatorios, también se puede aplicar para estudiar otras enfermedades, como el cáncer o las enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario. Para inducir la colitis, se debe llenar el suministro de agua potable de los ratones experimentales con dos gramos de sulfato de sodio de dextrano, o DSS, disueltos en 100 mililitros de agua potable esterilizada en autoclave, estimando cinco mililitros de agua por ratón por día. 24 horas antes de la exploración, cargue el cóctel de anticuerpos de interés en una jeringa estéril protegida de la luz e inyecte los anticuerpos por vía intravenosa en las venas de la cola de los animales de experimentación.
El día del experimento, use una maquinilla de afeitar eléctrica para afeitar el pelaje en la región abdominal de los animales de experimentación para minimizar la reflexión y absorción de la luz. Utilizando un maniquí que imita el tejido de un grosor y unas características de absorción definidos, llene el maniquí con un volumen específico de la solución de anticuerpos de interés y mida la fluorescencia en el dispositivo FMT. A continuación, en una tomografía veterinaria mediada por fluorescencia, o dispositivo FMT para animales pequeños, haga clic en Nuevo estudio e incluya los marcadores relevantes en la descripción del estudio, incluidos los parámetros de imagen y las dosis.
Crear grupos de estudio de acuerdo con el diseño experimental, dotando a cada grupo del número adecuado de animales. Cuando el sistema haya sido calibrado para las construcciones trazadoras, coloque el primer ratón anestesiado en posición supina en un casete de examen calentable a 42 grados Celsius. Inserte el casete en el sistema de imágenes y seleccione la muestra apropiada del grupo de estudio correspondiente.
Seleccione el trazador administrado para asegurarse de que los valores de la concentración del trazador se calculan correctamente y adquiera la imagen de reflectancia de fluorescencia en la longitud de onda adecuada para el escaneo. Haga clic en Adquirir imagen para delinear el campo de escaneo y confirmar que el campo de escaneo aparece como una superposición en la imagen de reflectancia de fluorescencia. Ajuste el campo de escaneo hasta que rodee la región de interés, teniendo cuidado de evitar errores o áreas de pelo restante.
En función del destino de la imagen, seleccione una resolución de campo de escaneo para establecer el número de puntos de datos de imagen dentro del campo de escaneo. A continuación, haga clic en Escanear para comenzar la adquisición de imágenes en la longitud de onda seleccionada. Al final de la exploración, retire al animal del casete para permitir que el animal se recupere por completo con monitoreo antes de regresar a su jaula.
A continuación, el TMF puede repetirse en varios puntos de tiempo según sea apropiado experimentalmente. Para analizar las imágenes adquiridas, abra el software de análisis de imágenes adecuado y seleccione los datos sin procesar para el primer escaneo. Con la herramienta de reconstrucción, cree mapas 3D de la distribución de fluorescencia.
Cuando todos los escaneos se hayan agregado al dataset de reconstrucción adecuado, abra el primer dataset de interés. Se mostrarán todas las exploraciones realizadas para el animal de experimentación individual seleccionado. Seleccione el análisis adecuado y haga clic en Cargar.
Aparecerá una reconstrucción en 3D de la distribución del trazador como una superposición de la imagen de reflectancia de fluorescencia adquirida inicialmente. A continuación, identifique los focos de acumulación de etiquetas inespecíficas en los mapas 3D reconstruidos y utilice la herramienta de medición para seleccionar la región de interés. A continuación, el software generará una intensidad de fluorescencia para la región de interés, así como mediciones de la cantidad picomolar del trazador para el que se calibró el escaneo.
En este experimento, se empleó un anticuerpo conjugado por fluorescencia contra el murino F4/80 para visualizar directamente los macrófagos activados. Se midió una acumulación significativamente elevada de trazador fluorescente mediante tomografía mediada por fluorescencia en el colon de los ratones colíticos en comparación con los animales de control no colíticos, lo que indica un aumento en la infiltración de monocitos y la diferenciación en macrófagos activos en los animales colíticos. Por el contrario, la aplicación de un anticuerpo IgG conjugado con fluorescencia inespecífica no provocó una respuesta de fluorescencia detectable en el abdomen o el intestino en el grupo de control colítico o no cólico, lo que demuestra la especificidad de la interacción sonda-objetivo del anticuerpo F4/80.
Las mediciones ex vivo de la acumulación de trazadores dirigidos a F4/80 en colones explantados verifican aún más el origen colónico de la acumulación de señales de trazadores F4/80 detectada in vivo. De hecho, las cantidades calculadas de anticuerpos unidos se correlacionan bien con el número determinado histológicamente de macrófagos infiltrantes, lo que confirma que las imágenes in vivo con trazadores específicos pueden ser indicativas de la actividad local de la enfermedad. Una vez dominado, esto se puede realizar y analizar en un par de minutos si se realiza correctamente.
Los pasos de preparación, incluida la producción de trazadores específicos basados en anticuerpos, suelen durar de dos a tres días. A la hora de planificar un procedimiento experimental como este, es importante incluir controles adecuados y fiables, tanto para el anticuerpo como para el modelo de enfermedad animal. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la colonoscopia o la citometría de flujo, para responder preguntas adicionales y validar y cuantificar los datos.
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Visión general
Este estudio presenta un enfoque de imagen in vivo específico para visualizar marcadores moleculares de la actividad de la enfermedad en la enfermedad inflamatoria intestinal. Utilizando una evaluación tomográfica tridimensional cuantitativa, la investigación se centra en la infiltración de macrófagos intestinales en un modelo murino de colitis.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Inmunología
- Enfermedad inflamatoria intestinal
Antecedentes
- Las sondas específicas para objetivos son herramientas innovadoras para analizar mecanismos moleculares.
- Se pueden usar para estudiar la expresión de proteínas en varias enfermedades.
- Este método permite el monitoreo longitudinal y no invasivo de la actividad de la enfermedad.
- Se puede aplicar a trastornos inflamatorios, cáncer y enfermedades relacionadas con el sistema inmunológico.
Propósito del estudio
- Visualizar marcadores moleculares de la actividad de la enfermedad en la enfermedad inflamatoria intestinal.
- Abordar preguntas clave en la investigación terapéutica relacionada con la inflamación.
- Evaluar la influencia de la terapéutica experimental en la inflamación.
Métodos utilizados
- Inducción de colitis mediante sulfato de dextran sódico (DSS).
- Administración de un cóctel de anticuerpos por vía intravenosa en ratones experimentales.
- Tomografía mediada por fluorescencia para la imagen de la infiltración de macrófagos.
- Monitoreo longitudinal de la actividad de la enfermedad in vivo.
Principales resultados
- Visualización exitosa de la infiltración de macrófagos intestinales.
- Demostró la capacidad de monitorear la actividad de la enfermedad de manera no invasiva.
- Proporcionó información sobre la dinámica de la inflamación en la colitis.
- Se identificaron posibles aplicaciones para el estudio de otras enfermedades.
Conclusiones
- El enfoque de imagen específico para objetivos es efectivo para estudiar la enfermedad inflamatoria intestinal.
- Este método puede mejorar la comprensión de los mecanismos de la enfermedad y los efectos terapéuticos.
- La investigación futura puede expandir su aplicación a otras enfermedades inflamatorias y relacionadas con el sistema inmunológico.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Non-invasive longitudinal imaging of macrophage infiltration enables early detection of inflammatory responses in preclinical models, reducing reliance on terminal endpoints and supporting mechanistic de-risking of anti-inflammatory therapeutics. Quantitative 3D fluorescence-mediated tomography provides predictive confidence in target engagement and disease-modifying effects, informing go/no-go decisions in IBD and immune-mediated disease programs. This approach enhances translational continuity by aligning in vivo imaging readouts with histopathological validation, improving portfolio triage and resource allocation in discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing F4/80-positive macrophage accumulation as a functional readout of intestinal inflammation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through specific probe-target interactions, demonstrated by lack of signal with non-specific IgG controls.
- Predictive Value: Correlates in vivo tracer accumulation with ex vivo antibody binding and histologic macrophage counts, strengthening target confidence for immunomodulator screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative 3D fluorescence maps and picomolar tracer measurements, enabling reproducible compound screening in colitis models.
- Scalability: Facilitates longitudinal monitoring across time points, reducing animal use and increasing statistical power in therapeutic efficacy studies.
- Platform Reuse: Compatible with downstream validation via colonoscopy or flow cytometry, supporting integrated workflows for target validation and biomarker alignment.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models intestinal inflammation through DSS-induced colitis, a widely used system for studying IBD pathogenesis and therapeutic response.
- Translational Continuity: Links non-invasive imaging to histologic endpoints, enabling risk-adjusted advancement decisions based on concordant in vivo and ex vivo data.
- Mechanistic De-risking: Tracks monocyte infiltration and macrophage differentiation dynamics, providing insight into cellular mechanisms of action for experimental therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
Fluorescence-mediated tomography fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for immune-modulating compounds in gastrointestinal inflammation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying macrophage infiltration as a pharmacodynamic readout of pathway modulation in colitis models.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (fluorescence intensity, tracer concentration) that enable comparison across treatment groups and time points.
- Analytics: Provides reconstructable 3D datasets and region-of-interest measurements that facilitate statistical analysis of treatment effects on immune cell localization.
- Translational Research: Connects in vivo imaging to ex vivo validation, strengthening biomarker alignment and preclinical continuity for IBD-targeted candidates.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable imaging capability applicable across immune cell tracking, stem cell studies, and oncology models beyond intestinal inflammation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through specific, quantifiable imaging of macrophage activity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via calibrated tracer quantification and longitudinal intra-individual tracking.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on non-invasive disease activity monitoring, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through concordant imaging and histologic data, refining advancement criteria in immunomodulator pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence imaging, tracer preparation, and small animal handling for intravenous injection and anesthesia protocols.
- Dependent on access to a small animal fluorescence-mediated tomography system with appropriate wavelength selection and reconstruction software.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols, tracer dosing, and region-of-interest analysis for consistent data interpretation.
- Involves adaptation considerations across model systems, including fur removal and abdominal imaging optimization to minimize signal interference.
- Includes practical limitations such as the 2–3 day tracer preparation timeline and the need for appropriate isotype and disease controls to ensure specificity.
