Name: Tomografía mediada por fluorescencia para la detección y cuantificación de la inflamación Intestinal murina relacionadas con macrófagos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Aprende a visualizar marcadores moleculares de actividad en enfermedad inflamatoria intestinal mediante tomografía mediada por fluorescencia en modelo murino. Este método permite el seguimiento longitudinal no invasivo de la inflamación intestinal.

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Agradecemos a la Sra. Sonja Dufentester, Sra. Elke Weber y Sra. Klaudia Niepagenkämper por la excelente asistencia técnica.

Todos los experimentos en animales fueron aprobados por el Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Renania del Norte-Westfalia, según la ley de protección Animal (Tierschutzgesetz).
1. materiales y montaje Experimental
<ol>
	<li>Cuidado de los animales.
	<ol>
		<li>Utilizar ratones pareados por edad y sexo de cualquier cepa DSS susceptibles (por ejemplo, C57BL/6) en el peso corporal de 20-25 g.</li>
		<li>Plan por lo menos cinco o más ratones por grupo experimental y la casa los ratones según las pautas de cuidado de los animales locales.</li>
		<li>Proporcionar un estándar roedor chow dieta y esterilizar el agua potable ad libitum.</li>
		<li>Retire el chow estándar y sustituirla por chow libre de alfalfa por lo menos tres días antes de la exploración para reducir endoluminal auto-fluorescencia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inducción de la colitis inducida por DSS aguda.
	<ol>
		<li>Disolver 2 g de DSS (peso molecular ~ 40.000 Da) en 100 mL de agua esterilizado para obtener un 2% (solución del peso/volumen).</li>
		<li>Llenar la fuente beber de los ratones exclusivamente con la solución DSS y estimar 5 mL de líquido por ratón por día. Proporcionar la misma agua potable sin DSS a los ratones de control10. Nota: Vigile los ratones diariamente hasta el final del experimento. Eutanasia a los ratones que perder más de 20% de su peso corporal inicial o que se convierten en moribunda (es decir, persistente encorvada postura, movimiento disminuido, respiración forzada, notablemente erectos capa) según Directivas locales en animal bienestar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparación de la tomografía de fluorescencia-mediada.
	<ol>
		<li>El anticuerpo deseado (por ejemplo, rata anti-ratón F4/80) con el colorante de la fluorescencia de la etiqueta (por ejemplo, Cyanine7, λexcitación: 750 nm, λ deemisión: 776 nm) como se describe en el protocolo del fabricante. Dializan anticuerpo purificado en una membrana de diálisis adecuada (tamaño de poro &#60; 50-100 kDa) contra 1 L de cloruro de sodio de 0.15 M para por lo menos 2 horas o durante la noche.<ol>
			<li>Transferencia de los anticuerpos a 1 L de 0,1 M NaHCO3 y dializo durante al menos 2 h.</li>
			<li>Disolver la cantidad necesaria de colorante fluorescente en dimetil sulfóxido (DMSO) (10.8 μl/mg de anticuerpo) y añadir a la solución de anticuerpo. Utilizar el tinte fluorescente en exceso molar 20-fold para lograr una relación de colorante a la proteína de 1:3.</li>
			<li>Incubar en la oscuridad a 4 ° C por 1 h. retirar el anticuerpo diálisis contra 1 L de sodio de 0.15 M o mediante una columna de desalación PD-10 y resolver en tampón fosfato salino (PBS) para aplicación en vivo .</li>
			<li>Determinar la concentración de anticuerpo final y etiquetado cociente por espectrofotometría.</li>
			<li>Medir la concentración de proteína en una absorción de 250-330 nm y considerar absorción adicional por el tinte. Corregir el máximo de absorción a 280 nm (proteína) en un 11% de la máxima absorción a 750 nm (siguiente paso) para el etiquetado de Cyanine7.</li>
			<li>Medir la dilución de la sustancia (típicamente 1:10) 250-800 nm y extraer la concentración de Cyanine7 en 750 nm.</li>
			<li>Determinar la proporción de proteína de tinte como: tinte anticuerpos = máxima absorción a 750 nm / 200.000 / (máxima absorción a 280 nm - 0,11 x máxima absorción a 750 nm) / 170.000.</li>
			<li>Mantener la solución de anticuerpo a 4 ° C y proteger de la luz para evitar la decoloración antes de la inyección.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Cargar el volumen de la solución de anticuerpo necesario en una jeringa estéril inmediatamente antes de la inyección y el escudo de la luz hasta que se utiliza.</li>
		<li>Determinar el momento óptimo de la inyección de la punta de prueba y el procedimiento, dependiendo de la farmacocinética de trazador.</li>
		<li>Anestesiar los ratones usando 1.5-2.5% inhalado isoflurano en oxígeno o colocarlas firmemente en un limitador dedicado para la inyección de la vena de la cola de los anticuerpos etiquetados.</li>
		<li>Para los anticuerpos del cuerpo entero, inyectar el anticuerpo marcado por lo menos 24 h antes de la exploración, como visualización anti-ratón F4/80 macrófago murina colitis. Inyectar a ratones por vía intravenosa (i.v.) a través de la cola de la vena con anticuerpo marcado en un importe equivalente a 2.0 nmol de tinte.</li>
		<li>Uso igualmente etiquetado anticuerpos inespecíficos (p. ej., rat IgG u otro isotipo correspondiente a la herencia del anticuerpo primario) como control de isotipo en dosis equivalentes a las de la sonda específica. Nota: Los resultados de en vivo exploraciones después de la inyección del compuesto de control puede servir como referencia para la interpretación de la sonda específica de datos.</li>
		<li>Use una afeitadora eléctrica para afeitar la piel animal en la región abdominal para reducir al mínimo la absorción y reflexión de la luz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. técnicos
<ol>
	<li>Utilice un dispositivo de tomografía de fluorescencia-mediada veterinaria (FMT) para animal pequeño fluorescencia ( figura 4).</li>
	<li>Crear un nuevo estudio para cada proyecto haciendo clic en el "nuevo estudio" botón e incluir en la descripción del estudio de los marcadores relevantes, incluyendo los parámetros de imagen y dosis para referencia futura.</li>
	<li>Dentro de este estudio, crear grupos de estudio según el diseño del estudio respectivo (por ejemplo, para el control de isotipo inespecíficas y trazador específico) haciendo clic en el "nuevo grupo de estudio" botón. Equipar a cada grupo de estudio con el respectivo número de animales.</li>
	<li>Calibrar el sistema para las construcciones de trazador.<ol>
		<li>Realizar la calibración para cada lote de marcadores para normalizar la variación en el etiquetado y permitir la medición cuantitativa de los datos de la OI.</li>
		<li>Seguir la dirección del fabricante del instrumento para la calibración de cada sistema individual; sobre la selección de "añadir nuevo rastreador", el sistema proporcionará a una guía a través de los pasos. Proporcionar la dilución de la solución de anticuerpo aplicado y la concentración absoluta calculada del trazador en la sonda.</li>
		<li>Para FMT, utilice un fantasma imitando tejido de características definidas del espesor y la absorción (que se asemejan a tejidos vitales) y llenarlo con un volumen específico de la solución de anticuerpo utilizado. Esta medida en el dispositivo de la FMT. Nota: El sistema utiliza la medida de referencia de la sonda suministrada, junto con la concentración determinada para calcular las concentraciones de indicador absoluto de medidas futuras en vivo .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utilice un cassette de examen calentable con una temperatura de 42 ° C. Nota: Esto evita que los ratones se hipotérmica durante el examen.</li>
</ol>
3. animal anestesia
<ol>
	<li>Utilizar un flujo continuo de 1.5-2% vol % isoflurano (2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) y 1.5 L O2/min para anestesiar los ratones.</li></ol>Utilizar sistemas de inhalación especialmente diseñado para la anestesia de roedor (isoflurano vaporizador) para controlar fácilmente la profundidad anestésica y para minimizar la exposición del personal.
	<li>Colocar el ratón en la cámara de prueba de fugas inducción y encienda el vaporizador para el suministro de isoflurano (100% (v/v), 5 vol % oxígeno, 3 L/min). Controlar el ratón hasta que quede inconsciente y reclinada.</li>
	<li>Coloque en el cassette de examinación de la tomografía, con inhalación isoflurano continua mediante cono de nariz en una dosis de 100% v/v, 1,5 vol % oxígeno, 1, 5 L/min para minimizar los artefactos de movimiento durante el examen. Para procedimientos que duran más de 5 minutos, aplicar ungüento oftálmico en los ojos de ratón para prevenir daño de la córnea.</li>
	<li>Evaluar la profundidad anestésica por comprobación de los reflejos. Coloque el ratón en su parte posterior; Si la anestesia es suficiente, el ratón no debe dar vuelta alrededor. Apriete el ratón suavemente entre sus dedos; Si la anestesia es suficiente, la pierna no será retirada (etapa de tolerancia quirúrgica).</li>

4. fluorescencia-mediada de la tomografía
Nota: Adaptar los datos siguientes, que son específicos para el sistema FMT utilizado en este estudio (véase la Tabla de materiales) para dispositivos de imágenes de reflectividad de fluorescencia alternativos o sistemas de FMT, según sea necesario.
<ol>
	<li>Coloque el ratón anestesiado en su parte posteriora en el cassette de la examinación.</li>
	<li>Realizar el procedimiento.<ol>
		<li>Inserte el cartucho en el sistema de proyección de imagen y cierre inmediatamente para asegurar la anestesia continua. Seleccionar la muestra apropiada en el grupo de estudio creado previamente. Seleccionar el trazador administrado desde el menú desplegable para asegurar que los valores para la concentración del trazalíneas se calculan correctamente.</li>
		<li>Adquirir imagen de reflectancia de fluorescencia a la longitud de onda adecuada (720 nm de Cyanine7) para la planificación de la exploración y resumen el campo de exploración haciendo clic en el botón "adquirir imagen".</li>
		<li>Ver que el campo de análisis aparece como una superposición de la imagen de reflectancia de fluorescencia. Ajustar a la región de interés (por ejemplo, colon o abdomen), evitando el aire o las áreas de la piel restante. Dependiendo el destino de la imagen, establecer al número de imagen de puntos de datos dentro del campo de exploración, eligiendo entre la gruesa mediana y fina resolución de campo de exploración en el menú de la derecha. Nota: Tenga en cuenta que un campo de exploración bien podría ofrecer mejor resolución espacial a costa de un tiempo significativamente largo análisis.</li>
		<li>Iniciar la adquisición de datos/imagen a la longitud de onda seleccionada haciendo clic en "scan". Nota: El tiempo de exploración para una exploración semifino del abdomen entero será alrededor de 5 min; en este tiempo, cada punto de datos por separado es iluminado por el laser de la excitación y la fluorescencia resultante se registra.</li>
		<li>Retirar el animal del cassette de imágenes al final de la exploración y dejar el animal a recuperarse completamente antes de colocarlo en la jaula.</li>
		<li>Repita la FMT si se considera necesario en varios puntos del tiempo durante el experimento (por ejemplo, los días 0, 5 y 9-10 (final del experimento)), pero la acumulación de anticuerpos en el cuerpo, por lo tanto aumento de la señal de fluorescencia de fondo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. post-análisis
<ol>
	<li>Coloque el ratón en una jaula separada en una toalla de papel bajo una lámpara de calentamiento luz roja y controlar el ratón signos de malestar o angustia hasta recuperación completa. Coloque el ratón en su respectiva jaula cuando está totalmente despierto.</li>
	<li>Eutanasia a los ratones al final del experimento por la entrega de CO2 para el aislador a una dosis de 100% (v/v), 100% vol y 3 L/min. No la llene la cámara con CO2, como una súbita exposición a altas concentraciones de CO2 puede causar señal de socorro. Verificar la muerte después de que el ratón ha dejado de respirar de un modo secundario subsecuente de la eutanasia como rápida dislocación cervical.</li>
	<li>Explante el colon por laparotomía abdominal y realizar un análisis ex vivo de colon explanted, como se explica en pasos 4.2.1 - 4.2.4. Abra cada colon longitudinalmente con tijeras quirúrgicas Metzenbaum y enjuagar con solución salina antes de preparar para su análisis posterior.</li>
	<li>Utilice un bisturí para cortar un fragmento de 0.5 cm del colon distal y colocar inmediatamente en un tubo criogénico de 1,5 mL. Congelación en nitrógeno líquido y almacenar a-70 ° C hasta su uso posterior (por ejemplo,mieloperoxidasa (MPO) medidas).</li>
	<li>Utilizar un palo de madera y enrollar el colon longitudinalmente abierto restante de distal al extremo proximal, con la hacia fuera de la mucosa ("técnica de brazo de gitano"), para análisis histológicos. Colocar la preparación en un fijador (véase la Tabla de materiales) y congelar a-80 ° C14.</li>
</ol>
6. interpretación y reconstrucción de datos
<ol>
	<li>Utilice la herramienta reconstrucción del respectivo software imagen para crear mapas en 3D de la distribución de la fluorescencia a partir de los datos de imágenes raws; las exploraciones se agregan automáticamente a la herramienta de reconstrucción, cuando a la exploración, la función "Agregar a cola de reconstrucción" está seleccionada.<ol>
		<li>De lo contrario, seleccione las imágenes en el menú desplegable bajo el respectivo estudio grupo de estudio, haga clic derecho en la exploración y seleccione "añadir a la reconstrucción".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para su posterior análisis, cargar un conjunto de datos en el software de análisis. En el menú desplegable en la barra superior, seleccionar el estudio correspondiente y luego seleccione el grupo de estudio y el animal individual en el menú de la derecha; se mostrarán todos los escaneos de este animal. Seleccione la correcta exploración y haga clic en "cargar". Nota: La reconstrucción 3D de la distribución del indicador aparecerá en la izquierda como una superposición de la imagen de reflectancia de fluorescencia inicialmente adquirido. El modelo puede girar y magnifica para el análisis más fácil.</li>
	<li>Identificar focos de acumulación de etiqueta inespecíficos (p. ej., hígado o la orina de la vejiga) en mapas 3D reconstruidos y distinguir de los tejidos diana (por ejemplo, del intestino o del intestino).</li>
	<li>De la barra superior, seleccione la forma de retorno de la inversión más adecuada para el destino. Tejido de la blanco de la etiqueta como regiones de interés (ROI) mediante la colocación de los respectivos instrumentos de medición en el software de análisis; el software proporcionará una intensidad de fluorescencia para el retorno de la inversión, así como (pico-) cantidades molares del trazador que la exploración ha sido calibrada para.</li>
	<li>Seleccione la cantidad total de trazador en el ROI adecuado, normalizado por el tamaño ROI, como el equivalente más adecuado para la evaluación de la actividad de la enfermedad en correlación con el infiltrado inflamatorio (histología). Nota: Otras características del ROI pueden ser elegidos si es apropiado como representante del modelo en particular.</li>
</ol>
7.Ex Vivo Análisis
<ol>
	<li>Hematoxilina y eosina y tinción de inmunofluorescencia.
	<ol>
		<li>Desparafinizar secciones colocándolas en 70% de etanol (EtOH) por 2 min; enjuague luego con agua destilada. Tinción con hematoxilina en solución por 5 minutos y posteriormente enjuagar con agua caliente del grifo durante 10 minutos.</li>
		<li>Enjuague con agua destilada, contratinción con solución de eosina durante 2 min. y enjuagar nuevamente con agua destilada.</li>
		<li>Lugar en el 70% EtOH, 96% EtOH, 99% EtOH y xileno (2 veces) de 2 minutos cada uno para deshidratar y para eliminar las secciones. Montar con medio de montaje resinosas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tinción de inmunofluorescencia.
	<ol>
		<li>Utilizar las secciones de tejido previamente obtenidos ("brazo de gitano") para la tinción de inmunofluorescencia y preparar cryo-corte secciones de 7 μm.</li>
		<li>Bloquear secciones colon acetona-fijos y congelados en suero de rata de 5.0% por 10 min e incubar durante una noche con diluido (1/500 v/v) biotinilado primaria rata anti-F4/80 anticuerpo del ratón. Las secciones de lavado tres veces en solución salina tamponada con Tris (TBS) e incubar con estreptavidina-FITC (1: 100 v/v) en PBS y la BSA (0.1% w/v) durante la noche a 4 ° C.</li>
		<li>Lávese las secciones en TBS y mancha con 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1: 1000 v/v) para lograr contraste. Analizar las imágenes de fluorescencia debajo de un microscopio confocal (ver la Tabla de materiales, 40 aumentos; cubo N2.1 de filtro con filtro de excitación 515-560) y contar las células F4/80-positivas por campo de alta potencia. Nota: Considerar el uso de anticuerpos del mismo clon y formato al combinar en vivo FMT y post mortem histología análisis como inmunohistoquímica o inmunofluorescencia, tinción, dependiendo el objetivo. Para la detección de macrófagos F4/80-positive en vivo y ex vivo, se utilizaron diferentes formatos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mediciones en muestras de colon de MPO.
	<ol>
		<li>Uso recién obtenidos, PBS-aclarado dos puntos muestras o muestras descongeladas para mediciones de MPO. Todas las muestras de pesar y homogeneizar el tejido en tampón de lisis en el ELISA kit (véase la Tabla de materiales) en un volumen de 20 μl de tampón de lisis por mg de tejido.</li>
		<li>Someter a ultrasonidos por 15 s (frecuencia de sonicación: 20 kHz, potencia: 70 W) y centrifugar las muestras durante 10 minutos a 200 x g a 4 ° C.</li>
		<li>Uso un ELISA disponible comercialmente kit (véase la Tabla de materiales) según la descripción de la fabrica. Llevar a cabo la prueba por duplicado.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aunque las técnicas médicas de imagen han evolucionado rápidamente en los últimos años, todavía estamos limitados en nuestra capacidad para detectar procesos inflamatorios o tumores, así como otras enfermedades, en sus primeras etapas de desarrollo. Sin embargo, esto es crucial para el crecimiento del tumor comprensión, invasión, metástasis desarrollo y procesos celulares en el desarrollo de trastornos inflamatorios y enfermedades degenerativas, cardiovasculares e inmunológicas. Mientras que las técnicas de imagen tradic...

Los modelos animales son ampliamente utilizados en la investigación científica, y existen muchos procedimientos no invasivos para monitor actividad de la enfermedad y la vitalidad, como la cuantificación de los cambios de peso o el análisis de sangre, orina y heces. Sin embargo, estas son sólo parámetros de sustituto indirecto que también están sujetos a variabilidad interindividual. Con frecuencia deben complementarse análisis post mortem de muestras de tejido, que impide la observación serial en momentos repetitivos y dirigir los procesos de observación del fisiológico o patológico en vivo. Sofisticadas técnicas de imagen pequeños animales han surgido, incluyendo la proyección de imagen seccional, imágenes ópticas y endoscopia, que permite la visualización directa de estos procesos y también permite análisis repetitivos de los mismos animales1 , 2 , 3. Además, la posibilidad de repetitivas controlar diferentes Estados de la enfermedad en el mismo animal podría disminuir el número de animales necesarios, que podría ser deseable desde un punto de vista de la ética animal.
Existen varias técnicas de proyección de imagen ópticas en vivo imágenes de fluorescencia. Originalmente, la proyección de imagen confocal fue empleada para estudiar la superficie y subsuperficie eventos fluorescente4,5. Recientemente, sin embargo, sistemas tomográficos que permiten la evaluación cuantitativa del tejido tridimensional han sido desarrollados6. Esto se ha logrado mediante el desarrollo de sondas fluorescentes que emiten luz en el espectro de infrarrojo cercano (NIR), con baja absorción, detectores sensibles y fuentes de luz monocromáticas7. Mientras que las técnicas de imagen cross-sectioning tradicional, tales como la tomografía computada (CT), imágenes por resonancia magnética (MRI) o ultrasonido (US), en su mayoría dependen de parámetros físicos y visualizar la morfología, la proyección de imagen óptica puede proporcionar información adicional sobre los procesos moleculares subyacentes utilizando fluorescentes endógenos o exógenos sondas de8.
Avances en biología molecular han contribuido a facilitar la generación de sondas moleculares fluorescentes inteligentes y específicas para un número creciente de objetivos. Por ejemplo, captación mediada por receptor y la distribución en un área dada se pueden visualizar utilizando carbocyanine anticuerpos etiquetados derivado9. La abundancia de anticuerpos disponibles, que pueden ser etiquetadas como marcadores específicos en áreas de otra manera inaccesibles del cuerpo, proporciona penetraciones sin precedentes en los procesos moleculares y celulares en modelos de tumorigenesis y neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares, inmunológicas e inflamatorias7.
En este estudio, describimos el uso de la tomografía de fluorescencia-mediada en un modelo murino de la colitis. Dextrán sulfato de sodio (DSS)-colitis inducida es un modelo estándar del ratón inducida químicamente de la inflamación intestinal que se asemeja a inflamatoria intestinal (EII) de la enfermedad10. Es particularmente útil evaluar la contribución del sistema inmune innato para el desarrollo de la inflamación de intestino11. Puesto que el reclutamiento, activación y la infiltración de monocitos y macrófagos representan pasos cruciales en la patogenia de la EII, visualización de su contratación y la cinética de la infiltración son esenciales para monitorear, por ejemplo, el efecto de sustancias terapéuticas potenciales en un entorno preclínicos12. Describimos la inducción de colitis DSS y demostrar la caracterización de tomografía-mediada de la infiltración de macrófagos en la mucosa intestinal con fluorescencia molecular tomografía para la visualización específica del marcador de monocito/macrófago F4/80 13. Además, ilustramos procedimientos auxiliares y suplementarios, como anticuerpo etiquetado; la disposición experimental; y análisis e interpretación de las imágenes obtenidas, en correlación con lecturas convencionales tales como índices de actividad de la enfermedad, fluyen cytometry y análisis histológico e inmunohistoquímica. Se discuten las limitaciones de esta técnica y las comparaciones con otras modalidades de imágenes.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Reactivos</Dieta > alta</td> sin alfalfa Harlan Laboritories, Madison, EE. UU. 2014 Bepanthen ungüento oftalmológico Bayer, Leverkusen, Alemania 80469764 Sulfato de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dextrano sódico (DSS)</td><td>TdB Consulatancy, Uppsala, Suecia</td><td>DB001</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Eosin Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemania <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>E 4382</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemania</td><td>E 9884</td><td></td></tr><tr><td>Florene 100V/V</td><td>Abbott, Wiesbaden, Alemania</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Alemania</td><td>HHS32-1L</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compuesto Tissue Tek&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sakura, Zoeterwonde, Países Bajos</td><td>4583</td><td>fijador para análisis histológicos</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato, PBS</td><td>Lonza, Verviers, Bélgica</td><td>4629</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio 0,9%</td><td>Braun, Melsungen, Alemania</td><td>5/12211095/0411</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio en polvo</td><td>Sigma Aldrich Deisenhofen, Alemania</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Dieta estándar</td><td>Altromin, Lage, Alemania</td><td>1320</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, Leiden, Países Bajos</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Hemoccult (prueba de papel de guayaco)</td><td>Beckmann Coulter, Alemania</td><td>3060</td><td></td></tr><tr><td>Biotina rata-anti-ratón anti-anti-F4/80</td><td>anticuerpo Serotec, Oxford, Reino Unido</td><td>MCA497B</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-rata-anti-ratón anti-GR-1&nbsp;</td><td>BD Pharmingen, Heidelberg, Alemania</td><td>553125</td><td></td></tr><tr><td>Sondas moleculares Streptavidin-Alexa546</td><td>, Darmstadt, Alemania</td><td>S-11225</td><td>Excitación/emisión máxima:&nbsp; 556/573nm</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD11b rata-anti-ratón TC</td><td>Calteg, Burlingame, EE. UU.</td><td>R2b06</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-ratón F4/80 purificado</td><td>BioLegend, Londres, Reino Unido</td><td>123102</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemania</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-rata-ratón-anti-ratón conjugado con FITC</td><td>BD Pharmingen, Heidelberg, Alemania</td><td>553104</td><td></td></tr><tr><td>tampón FACS</td><td>BD Pharmingen, Heidelberg, Alemania</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Cy7 NHS Ester</td><td>GE Healthcare&nbsp; Europa, Friburgo, Alemania</td><td>PA17104</td><td></td></tr><tr><td>MPO ELISA</td><td>Immundiagnostik AG, Bensheim, Alemania</td><td>K 6631B</td><td></td></tr><tr><td>Cy5.5 marcado anticuerpo anti-ratón F4/80</td><td>BioLegend, Londres, Reino Unido</td><td>123127</td><td>listo para usar Anticuerpos marcados (alternativa)</td></tr><tr><td>Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5</td><td>eBioscience, Waltham, EE. UU.</td><td>45-4801-80</td><td>Anticuerpos marcados listos para usar (alternativa)</td></tr><tr><td>DMSO (sulfóxido de dimetilo)</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemania</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemania</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemania</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Albúminas séricas bovinas (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemania</td><td>A4612</td><td></td></tr><tr><td>Tris Solución salina tamponada (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemania</td><td>SRE0032</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Sistema de citometría de flujo</td><td>Calibur BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FMT 2000 Sistema de imágenes in vivo</td><td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, EE. UU</td><td>. FMT2000</td><td></td></tr><tr><td>software de análisis de imágenes True Quant 3.1</td><td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, EE. UU</td><td>. incluido en FMT2000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente Leica DMLB</td><td>Leica,&nbsp; 35578 Wetzlar, Alemania&nbsp;</td><td>DMLB</td><td></td></tr><tr><td>Bandelin Sonopuls HD 2070</td><td>Bandelin, 12207 Berlín, Alemania</td><td>HD 2070</td><td>homogeneizador ultrasónico</td></tr><tr><td>Bisturí desechable n.º 10</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemania</td><td>Z692395-10EA</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Metzenbaum 14cm</td><td>Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Alemania</td><td>22398330</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Luer Lock 5ml</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemania</td><td>Z248010</td><td></td></tr><tr><td>jeringas</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Alemania</td><td>Z192368&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de halcón 50ml</td><td>BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica</td><td>352070</td><td></td></tr></tbody></table>

tomografía mediada por fluorescencia para la detección y cuantificación de la inflamación intestinal murina relacionadas con macrófagos

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Modelos murinos de enfermedad son indispensables para la investigación científica. Sin embargo, muchas herramientas de diagnostico como la endoscopia o la proyección de imagen tomográfica no se emplean rutinariamente en modelos animales. Lecturas experimentales convencionales a menudo se basan en análisis post mortem y ex vivo , que evitar las citas de seguimiento intra individuales y aumentan el número de animales de estudio necesitada. Tomografía mediado fluorescencia permite la evaluación no invasiva, repetitiva, cuantitativa, tridimensional de sondas fluorescentes. Es muy sensible y permite el uso de los fabricantes de moleculares, que permite la detección específica y la caracterización de distintas dianas moleculares. En particular, las puntas de prueba específicas representan una herramienta innovadora para el análisis de genes de activación y de la proteína en inflamación, enfermedades autoinmunes, infección, enfermedad vascular, migración celular, tumorigénesis, etcetera. En este artículo, ofrecemos instrucciones paso a paso en esta sofisticada tecnología de proyección de imagen para el en vivo detección y caracterización de la inflamación (es decir, la infiltración de macrófagos F4/80-positivo) en un modelo murino utilizado de inflamación intestinal. Esta técnica podría utilizarse también en otras áreas de investigación, como seguimiento de la célula o células madre inmune.

Evaluación de Colitis:
Colitis inducida por DSS es un químicamente inducido modelo murino de inflamación intestinal que se asemeja a la enfermedad inflamatoria intestinal humana y conduce a la pérdida de peso, sangrado rectal, ulceración superficial y daño de la mucosa en ratones susceptibles15. Es particularmente útil estudiar la contribución del sistema inmune innato para el desarrollo ...

Sondas específicas de objetivo representan una herramienta innovadora para el análisis de los mecanismos moleculares, como la expresión de proteínas en diversos tipos de enfermedad (p. ej., inflamación, infección y tumorigenesis). En este estudio, describimos una evaluación tomográfica tridimensional cuantitativa de la infiltración de macrófagos intestinales en un modelo murino de colitis con F4/80-específica mediada por fluorescencia tomografía.

Tomografía mediada por fluorescencia para la detección y cuantificación de la inflamación Intestinal murina relacionadas con macrófagos

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

El objetivo general de este enfoque de imagen in vivo específico para el blanco es visualizar marcadores moleculares de la actividad de la enfermedad en la enfermedad inflamatoria intestinal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la enfermedad inflamatoria intestinal y en la investigación terapéutica relacionada sobre la influencia de terapias experimentales o eventos celulares específicos en la inflamación. La principal ventaja de esta técnica es que la actividad de la enfermedad se puede monitorear de forma longitudinal y no invasiva.Aunque este método puede proporcionar información sobre trastornos inflamatorios, también puede aplicarse para estudiar otras enfermedades, como el cáncer o enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario. Para inducir colitis, llene el suministro de agua de bebida de los ratones experimentales con dos gramos de sulfato de sodio de dextrano, o DSS, disueltos en 100 mililitros de agua de bebida autoclavada, calculando cinco mililitros de agua por ratón por día. 24 horas antes del escaneo, cargue el cóctel de anticuerpos de interés en una jeringa estéril protegida de la luz e inyecte los anticuerpos por vía intravenosa en las venas de la cola de los animales experimentales.El día del experimento, utilice una afeitadora eléctrica para afeitar el vello en la región abdominal de los animales experimentales con el fin de minimizar la reflexión y absorción de la luz. Utilizando un fantasma que imita el tejido, de espesor y características de absorción definidos, llene el fantasma con un volumen específico de la solución de anticuerpo de interés y mida la fluorescencia en el dispositivo de tomografía mediada por fluorescencia (FMT). Luego, en un dispositivo de tomografía mediada por fluorescencia veterinaria, o dispositivo FMT para pequeños animales, haga clic en Nuevo Estudio e incluya los trazadores relevantes en la descripción del estudio, incluyendo los parámetros de imagen y las dosis.Cree grupos de estudio según el diseño experimental, dotando a cada grupo del número adecuado de animales. Una vez que el sistema haya sido calibrado para los constructos trazadores, coloque el primer ratón anestesiado en posición supina dentro de una cápsula de examen calentable a 42 grados Celsius. Inserte la cápsula en el sistema de imagen y seleccione la muestra apropiada del grupo de estudio correspondiente.Seleccione el trazador administrado para asegurar que los valores de la concentración del trazador se calculen correctamente, y adquiera la imagen de reflectancia de fluorescencia en la longitud de onda adecuada para el escaneo. Haga clic en Adquirir imagen para delimitar el campo de escaneo y confirme que el campo de escaneo aparezca como una superposición sobre la imagen de reflectancia de fluorescencia. Ajuste el campo de escaneo hasta que rodee la región de interés, teniendo cuidado de evitar errores o áreas con pelo residual.Según el objetivo de la imagen, seleccione una resolución de campo de escaneo para establecer el número de puntos de datos de imagen dentro del campo de escaneo. Luego, haga clic en Escanear para comenzar la adquisición de imágenes en la longitud de onda seleccionada. Al finalizar el escaneo, retire al animal del casete para permitir que se recupere completamente con monitoreo antes de devolverlo a su jaula.La TFM puede repetirse entonces en varios puntos temporales según lo requiera el experimento. Para analizar las imágenes adquiridas, abra el software adecuado de análisis de imágenes y seleccione los datos brutos del primer escaneo. Utilizando la herramienta de reconstrucción, cree mapas tridimensionales de la distribución de la fluorescencia.Cuando se hayan agregado todos los escaneos al conjunto de datos de reconstrucción correspondiente, abra el primer conjunto de datos de interés. Se mostrarán todos los escaneos realizados para el animal experimental seleccionado. Seleccione el escaneo adecuado y haga clic en Cargar.Una reconstrucción 3D de la distribución del trazador aparecerá como una superposición de la imagen de reflectancia de fluorescencia adquirida inicialmente. A continuación, identifique los focos de acumulación no específica de la etiqueta en los mapas 3D reconstruidos y utilice la herramienta de medición para seleccionar la región de interés. El software generará entonces la intensidad de fluorescencia para la región de interés, así como mediciones en picomoles de la cantidad del trazador para el cual se calibró el escaneo.En este experimento, se empleó un anticuerpo conjugado con fluorescencia contra F4/80 murino para visualizar directamente los macrófagos activados. Se midió una acumulación significativamente elevada de trazador fluorescente mediante tomografía mediada por fluorescencia en los colones de los ratones colíticos en comparación con los animales control no colíticos, lo que indica un aumento en la infiltración de monocitos y su diferenciación en macrófagos activos en los animales colíticos. Por el contrario, la aplicación de un anticuerpo IgG conjugado con fluorescencia no específico no provocó una respuesta fluorescente detectable en el abdomen o intestino, ni en el grupo colítico ni en el control no colítico, lo que demuestra la especificidad de la interacción entre la sonda y su blanco del anticuerpo F4/80.Las mediciones ex vivo de la acumulación de trazadores dirigidos contra F4/80 en colon extraído verifican aún más el origen colónico de la acumulación de señal del trazador F4/80 detectada in vivo. De hecho, las cantidades calculadas de anticuerpo unido se correlacionan bien con los números histológicamente determinados de macrófagos infiltrantes, confirmando que la imagenología in vivo con trazadores específicos puede ser indicativa de la actividad local de la enfermedad. Una vez dominado, este procedimiento puede realizarse y analizarse en cuestión de minutos si se lleva a cabo adecuadamente.Los pasos de preparación, incluida la producción de trazadores específicos basados en anticuerpos, suelen tardar de dos a tres días. Al planificar un procedimiento experimental como este, es importante incluir controles adecuados y confiables, tanto para el anticuerpo como para el modelo animal de la enfermedad. Después de seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como colonoscopia o citometría de flujo, para responder preguntas adicionales y para validar y cuantificar los datos.

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La tomografía de fluorescencia difusa ofrece un enfoque relativamente de bajo costo y alto potencial de toda la...

Guiada por tomografía computarizada dominio del tiempo de fluorescencia difusa tomografía en pequeños animales para la localización de biomarcadores de cáncer

Este video muestra una técnica para evaluar la infiltración de macrófagos intestinales en un modelo murino de colitis utilizando tomografía mediada por fluorescencia (FMT). Al inducir colitis en un ratón a través del sulfato de sodio de dextrano (DSS), se inyectan al animal anticuerpos que reconocen el marcador de glicoproteína F4/80 en los macrófagos infiltrados en el colon. A continuación, se obtiene una imagen del ratón en un dispositivo FMT en el que las señales de fluorescencia y...

Uso de la tomografía mediada por fluorescencia para evaluar la inflamación intestinal murina

Se describe un método de imagen no invasiva para distinguir las fases inflamatorias. El suministro sistémico de luminol revela zonas de inflamación aguda que dependen de la actividad MPO en neutrófilos. En contraste, la inyección de lucigenina permite la visualización de la inflamación crónica dependiente de la actividad Phox en los macrófagos.

In vivo método de imagen para distinguir la inflamación aguda y crónica

Pequeños técnicas de imagen permiten animales exámenes de diagnóstico de serie y las intervenciones terapéuticas en vivo. Recientemente, el alcance de las aplicaciones se ha ampliado significativamente y actualmente incluye la evaluación del desarrollo de tumores del colon, la cicatrización de heridas y el seguimiento de la inflamación. Este protocolo se ilustran estas diversas aplicaciones potenciales de la endoscopia murino.

Murino Endoscopia para En Vivo Healing Multimodal Imaging de Carcinogénesis y Evaluación de la herida y la inflamación intestinal

Mediante el uso de ratones reporteros transgénicos y marcadores fluorescentes inyectables, la microscopía confocal de disco giratorio intravital a largo plazo permite la visualización directa del comportamiento de las células mieloides en el adenoma intestinal en el modelo de cáncer colorrectal ApcMin/+.

Imágenes en tiempo real de las células mieloides en Dinámica Apc Min / + Intestinal Tumores de Spinning disco microscopía confocal

El uso de fluoróforos para la obtención de imágenes in vivo puede verse muy limitado por la opsonización, el aclaramiento rápido, la baja sensibilidad de detección y los efectos citotóxicos en el huésped. La encapsulación de fluoróforos en liposomas mediante hidratación y extrusión de película conduce a la extinción y protección de la fluorescencia, lo que permite obtener imágenes in vivo con una alta sensibilidad de detección.

Fluorescencia de extinción de un fluoróforo encapsulada en liposomas en infrarrojo cercano como herramienta para En Vivo Imagen Óptico

Describimos un protocolo para la obtención de imágenes híbridas, que combina la tomografía mediada por fluorescencia (FMT) con la micro tomografía computarizada (μCT). Después de la fusión y la reconstrucción, realizamos una segmentación interactiva de órganos para extraer mediciones cuantitativas de la distribución de fluorescencia.

Híbrido de imágenes μCT-FMT y análisis de imágenes

En este sentido, describimos un microscopio de luz para visualizar el infiltrado de leucocitos CD45 + cardíaco en un modelo murino de miocarditis fulminante aséptica, que es inducido por el tratamiento de la toxina diftérica intratraqueal de ratones CD11c.DTR.

Visualización Cuantitativa del Infiltrado de Leucocitos en un Modelo Murino de Miocarditis Fulminante por Microscopía de Hoja Ligera

Aprovechando la microscopía intravital, el método presentado aquí permite la visualización en tiempo real del desprendimiento de células epiteliales intestinales en animales vivos. Por lo tanto, la mucosa intestinal teñida tópicamente (acriflavina y rhodamineB-dextran) de ratones anestesiados se compara hasta una sola célula mediante microscopía confocal.

Un enfoque basado en microscopía intravital para evaluar la permeabilidad intestinal y el rendimiento del desprendimiento de células epiteliales

Este estudio presenta un método de imagen en 3D que utiliza tejidos intestinales de montaje completo y microscopía multifotónica para cuantificar el moco secretado, lo que permite un análisis volumétrico preciso y la visualización de la dinámica del moco en respuesta a estímulos como el cloruro de carbamoilcolina.

Cuantificación tridimensional del moco intestinal mediante imágenes de tejido de montaje completo

Aquí presentamos un protocolo para la imagen intravital de un Mycobacterium tuberculosis atenuado aprobado por BSL-2. Cepa en el pulmón murino utilizando una ventana pulmonar permanente. Este enfoque permite un análisis longitudinal con resolución de célula única de las interacciones tempranas huésped-patógeno, incluyendo la localización bacilar, la dinámica vascular y la captación de macrófagos dentro del mismo microambiente pulmonar.

Imagen intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado en el pulmón murino durante una infección intravascular temprana

Aprende a visualizar marcadores moleculares de actividad en enfermedad inflamatoria intestinal mediante tomografía mediada por fluorescencia en modelo murino. Este método permite el seguimiento longitudinal no invasivo de la inflamación intestinal.

Tomografía mediada por fluorescencia para la detección y cuantificación de la inflamación Intestinal murina relacionadas con macrófagos (Video) | JoVE Journal

Tomografía mediada por fluorescencia para la detección y cuantificación de la inflamación Intestinal murina relacionadas con macrófagos

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