El uso de fibroblastos humanos primarios para la Supervisión de fenotipos mitocondriales en el campo de la enfermedad de Parkinson

El objetivo general de los siguientes experimentos es estudiar los fenotipos mitocondriales asociados a enfermedades en fibroblastos humanos utilizando la técnica de imagen de células vivas. Esto se logra obteniendo primero una biopsia de piel y preparándola para el cultivo de tejidos. En primer lugar, los fibroblastos humanos se propagarán a partir de la muestra de piel en las dos primeras semanas.

A continuación, los fibroblastos se separan y se siembran en pocillos de vidrio con cámara. Después de 24 a 48 horas, se aplican matrices de imágenes de células vivas para evaluar la morfología de la función mitocondrial o la autofagia mediante la técnica de imágenes de células vivas. En última instancia, el análisis basado en software de las imágenes puede revelar parámetros mitocondriales morfológicos y funcionales en fibroblastos humanos vivos.

La principal ventaja de utilizar fibroblastos primarios de pacientes portadores de mutaciones asociadas a la enfermedad en comparación con los modelos celulares ya existentes, como las líneas celulares tumorales, es que los fibroblastos reflejan características patológicas importantes de la enfermedad humana sin manipulación genética previa basada en niveles de proteínas endógenas. Estas técnicas pueden ayudar a identificar signos tempranos de la enfermedad de Parkinson, como alteraciones en la función y dinámica mitocondrial, y a definir nuevas estrategias terapéuticas, comenzando con una biopsia de tejido fresco, que se ha tomado mediante un punzón de biopsia. Coloque la muestra en un primer plato con PBS y proceda con tres pasos de lavado transfiriéndolo a los tres platos siguientes llenos de PBS.

Corte el espécimen de la biopsia en pedazos pequeños. Coloque dos o tres piezas en un matraz T 25 transfiriéndolas con una pipeta. Junto con el PBS, prepare entre dos y cuatro matraces a partir de una sola biopsia.

Reemplace con cuidado el PBS con una pequeña cantidad de medio de cultivo para que las muestras puedan adherirse al fondo del matraz. Incubar las células hasta que los primeros fibroblastos crezcan fuera de la muestra epidérmica. Si se encuentran problemas de crecimiento, agregue factor de crecimiento de fibroblastos para mejorar el crecimiento de la célula.

Una vez que la fluidez alcanza el 50 al 70%, las células están listas para su uso. Si no se planea ningún experimento, los fibroblastos deben congelarse. Por lo tanto, reemplace los medios de cultivo con enzimas de ADN después de lavar las células con PBS e incubarlas.

Recoger las células desprendidas en cultivo, medio y centrífuga. La suspensión de la célula. Vuelva a suspender el pellet celular obtenido en FCS con DMSO y congélelo en una cámara de isopropanol a menos 80 grados centígrados.

Los experimentos con fibroblastos humanos generalmente deben realizarse en líneas celulares con menos de 10 pasajes. Compare siempre líneas del mismo número de paso e idealmente use varias líneas celulares genéticamente homogéneas diferentes para compararlas con controles sanos. Comience el experimento lavando los fibroblastos unidos una vez con PBS y luego incube con enzimas de ADN proteolítico para liberar las células.

Cuente sus células con una cámara de conteo y siembre de 50 a 70,000 células en cada pocillo de su cubreobjetos de cuatro cámaras sin recubrimiento. Después de 24 a 48 horas, se puede realizar el experimento de imágenes de células vivas. Asegúrese de que el microscopio de imágenes de células vivas esté equipado con una incubadora que controle la temperatura y los niveles de dióxido de carbono durante la adquisición de imágenes.

Se debe mantener una atmósfera de 37 grados centígrados y un 5% de dióxido de carbono. Obtenga imágenes de las células con un aumento de 63 x o más utilizando microscopía confocal, de barrido láser o de fluorescencia con la técnica aome, como se muestra aquí. La autofluorescencia de los fibroblastos con un número de paso más alto suele dificultar el análisis por fax.

Por lo tanto, el método preferido es la obtención de imágenes de células vivas. Microscopía De 24 a 48 horas después de sembrar las células en el cubreobjetos con cámara, cambie el medio a uno con un tinte dependiente de MMP debido al trabajo de sensibilidad a la luz. En condiciones de luz disminuida.

Incubar las células protegidas de la luz durante 15 minutos. A continuación, sustituya la solución de tinción por nuestro medio PMI sin fenol. Rojo, proceda sin un paso de lavado e inmediatamente obtenga una imagen de las células al obtener imágenes de los fibroblastos.

Evite el fotoblanqueo eligiendo un único tiempo de exposición entre 200 y 300 milisegundos para todas las imágenes. La adquisición de imágenes bajo configuraciones estandarizadas es muy importante, ya que no se podrían hacer comparaciones basadas en la intensidad si las configuraciones son diferentes entre líneas celulares. Cuando se obtienen imágenes por primera vez de fibroblastos teñidos positivamente, se visualiza una señal clara de TMRE.

Después de obtener imágenes de este campo de visión, se produce el inevitable blanqueo de fotos, mantenga el siguiente campo visual adecuadamente lejos de la sección de fotos blanqueadas utilizando el software de imagen J disponible públicamente. Analice las imágenes sin conexión. Comience seleccionando la celda de interés con una herramienta de selección.

Convierta la imagen en una imagen de ocho bits a través del menú de tipo de imagen. Reduzca todo el ruido no específico utilizando la función D speckle en el menú de la imagen. Elija la condición de incendio de las tablas de búsqueda en el menú de la imagen.

Cambie la función de umbral a la función por encima y ajuste el umbral hasta que las estructuras mitocondriales estén bien definidas. En el menú Analizar, seleccione la opción Analizar partículas para obtener un valor medio de gris para cada partícula mitocondrial detectable. Guarde la lista de resultados dada como una hoja de cálculo.

A continuación, cree un trazado de superficie. Utilice el gráfico de superficie 3D interactivo del complemento en la sección del complemento 3D. Ajuste el gráfico utilizando diferentes opciones de visualización, como cambiar los colores originales a LUT de espectro para dar la barra de escala de intensidad para el gráfico apropiado.

En un programa separado, abra la hoja de cálculo y calcule el promedio del valor medio de gris de las estructuras mitocondriales para medir la morfología mitocondrial en fibroblastos. 24 a 48 horas. Después de colocar las celdas en una cubierta de vidrio con cámara, reemplace el medio por uno que contenga MIT tracker green debido al trabajo de sensibilidad a la luz.

En condiciones de luz disminuida, incube las células protegidas de la luz durante 15 minutos. A continuación, lave suavemente las células una vez con PBS y sustituya el medio por RPMI fresco que carezca de rojo fenol. Ahora visualice inmediatamente las celdas como se describe en la sección anterior.

Al obtener imágenes de los fibroblastos para evaluar la morfología mitocondrial. Tenga en cuenta la configuración de parámetros convenientes para obtener imágenes de las estructuras mitocondriales con buena calidad. Preste atención a establecer el enfoque correcto y elija un tiempo de exposición adecuado.

Al igual que el análisis de imágenes anterior, utilice el mismo software para definir las regiones de interés. Convierta el tipo de imagen a ocho bits y reduzca el ruido mediante la función de moteado D. A continuación, en el menú de procesos y filtros, utilice el filtro de convolución para resaltar las estructuras mitocondriales.

Luego, como antes, ajuste el umbral para que la relación señal/ruido sea la adecuada. Dado que es un paso crítico establecer el umbral manualmente, es obligatorio trabajar con la mirada de cerca en los archivos de imagen originales y garantizar un procesamiento adecuado de la imagen. En el menú Analizar, seleccione la opción Analizar partículas para automatizar la identificación de estructuras mitocondriales en función del tamaño de píxel elegido.

A continuación, se pueden calcular varios parámetros mitocondriales, como el perímetro del área, los ejes menor y mayor o la circularidad. Estas mediciones se pueden configurar individualmente en el menú analizar, guardar la lista de resultados dada como una hoja de cálculo y abrir el archivo. Los análisis de la morfología mitocondrial se pueden llevar a cabo definiendo el factor de forma que indica el grado de ramificación de una red mitocondrial.

Del mismo modo, se puede calcular la relación de aspecto que define la longitud de las mitocondrias para medir la colocalización lisosomal mitocondrial de 24 a 48 horas después de sembrar los fibroblastos, cámbiela por una. Eso incluye mito tracker y lyo tracker. Preste atención a los trabajos protegidos de la luz.

Proceda a incubar las células durante 15 minutos en la oscuridad. A continuación, sustituya el medio por RPMI, que carece de rojo fenol, pero que sigue conteniendo la misma concentración de tinción lisosomal. Proceda inmediatamente a la obtención de imágenes confocales o a la microscopía de fluorescencia utilizando la técnica de aome, ya que las señales rojas indican lisosomas y las señales verdes.

Visualizar las estructuras mitocondriales. La colocalización lisosomal mitocondrial positiva se refleja mediante señales amarillas debido a la superposición de ambas tinciones individuales más adelante durante el análisis fuera de línea. Después de seleccionar una región de interés, una imagen de ocho bits y la opción de moteado Desp, elija el complemento Jacob como herramienta de análisis de colocalización.

Esta operación genera valores para cada uno de los canales y calcula el coeficiente de Pearson, el coeficiente de superposición y el coeficiente de hombre. Estos valores se utilizan para estimar la colocalización de lisosomas y mitocondrias. En particular, el coeficiente de Pearson mide la relación lineal entre dos variables.

La función mitocondrial en fibroblastos humanos vivos se evaluó mediante las técnicas de imagen descritas. En los ensayos funcionales, la señal de fluorescencia TMRE se correlaciona con el potencial de membrana mitocondrial. En condiciones normales de MMP, la fluorescencia de TMRE es significativamente mayor que en condiciones patológicas caracterizadas por una MMP reducida.

Esta intensidad de fluorescencia se midió calculando el promedio del valor medio de gris de cada estructura mitocondrial. El uso de la opción de trazado de superficie interactivo. En la imagen J se proporciona una ilustración de diferentes intensidades máximas en células teñidas con el rastreador MIT, se visualizaron las estructuras mitocondriales de fm verde independientemente de sus respectivos MMP.

La morfología se analiza a partir de figuras binarias. La colocalización lisosomal mitocondrial se determinó mediante células teñidas con MIT tracker green fm. Junto con el rastreador Lyo, la colocalización roja DND 99 se resalta con las flechas blancas.

También se utilizó el análisis de imágenes para determinar los coeficientes de Pearson de estos lapsos de superposición. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar la piel humana como modelo ex vivo como una herramienta importante para caracterizar las principales características patológicas de la disfunción mitocondrial durante la neurodegeneración.