El examen de selección tímica positivo y negativo por citometría de flujo

El objetivo general del siguiente experimento es examinar su desarrollo en ratones mediante citometría de flujo. Esto se logra mediante la preparación de suspensiones unicelulares del ratón, el timo y el bazo. Como segundo paso, los timocitos y citos se tiñen con un cóctel de anticuerpos para la identificación de poblaciones específicas.

En última instancia, la frecuencia y el número de varias poblaciones de linfocitos se pueden evaluar mediante análisis de citometría de flujo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el desarrollo de células T, como qué genes y vías son importantes para generar un repertorio de células T funcional pero tolerante a las células. Aunque este método puede proporcionar información sobre el desarrollo de células T en el timo, también se puede aplicar en el examen del desarrollo de otras células inmunitarias.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades en el diseño de sus cócteles de anticuerpos para la citometría de flujo. Antes de comenzar la disección, coloque una pantalla de malla de acero estéril en una placa de Petri de 60 por 15 milímetros. Luego agregue cinco mililitros de HBSS al plato y guarde el plato en hielo para cosechar el timo.

Primero, use un par de pinzas para levantar la punta inferior del esternón y revelar el diafragma. A continuación, evitando el hígado, corte el diafragma para separar la caja torácica y luego corte la caja torácica en dirección ascendente a cada lado. Teniendo cuidado de evitar los pulmones y el corazón.

Ahora use las pinzas para tirar suavemente de la caja torácica hacia atrás. El timo es un órgano bilobulado blanco situado por encima del corazón. Use el borde plano de las pinzas para agarrar la parte inferior de los lóbulos.

A continuación, extraiga suavemente el timo y colóquelo en una de las pantallas de malla previamente preparadas. Para extraer el bazo, haga una incisión a través del peritoneo para exponer la cavidad abdominal. El bazo es un órgano rojo con forma de tabla de surf ubicado en el lado izquierdo de la cavidad abdominal del ratón, debajo del hígado.

Luego, use un par de pinzas para extraer el bazo y otro para separar el tejido conectivo. A continuación, coloque el bazo disecado en una pantalla de malla separada. Ahora use el émbolo de una jeringa de tres mililitros para moler cada órgano en su pantalla de malla hasta que solo queden el tejido conectivo y la grasa, pipetear las células y el HBSS en un tubo cónico de 15 mililitros.

A continuación, enjuague cada malla con HBS S3 nuevas veces. A continuación, granule las células durante cinco minutos a 335 veces G y cuatro grados centígrados. Después de aspirar el sobrenadante resus, suspender los citos en 500 microlitros de un tampón de lisis CK durante 10 minutos a temperatura ambiente mientras se reproducen los glóbulos rojos esplénicos.

Suspenda los timocitos a 20 veces 10 por las seis células por mililitro en tampón de fax y déjelos a un lado en hielo. Ahora agregue cinco mililitros de HBSS para devolver los citos a la isotonicidad después de girar las células nuevamente, resus suspender el pellet libre de glóbulos rojos a 20 veces 10 a la sexta celda por mililitro en el tampón de fax. Comienza este paso de Ali Watting.

Cuatro veces 10 al sexto de los TIMOCITOS reservados por muestra de citometría de flujo a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. A continuación, agregue citos a los pocillos de una placa de 96 pocillos para los controles de compensación. A continuación, bloquee los receptores FC en cada una de las muestras celulares mediante incubación con anti CD 1632 durante 10 minutos en hielo.

Ahora gire el plato y luego disipe el líquido de los pocillos golpeando el plato una vez boca abajo en un fregadero, luego vuelva a suspender cada pocillo en 200 microlitros de tampón de fax y repita el lavado. A continuación, incubar las muestras experimentales con 200 microlitros de cóctel de anticuerpos o anticuerpos conjugados con fluorocromo único para los controles de compensación. Todo en el búfer de fax en el hielo en la oscuridad.

Después de 30 minutos, lavar las células dos veces con tampón de fax y luego, después de volver a suspender las celdas en el tampón de fax, transfiera las muestras a los tubos de fax en modelos transgénicos TCR fisiológicos y ratones de tipo salvaje. La selección positiva comienza en la etapa brillante de doble positivo antes de pasar a la etapa de opaco de doble positivo. Después de que el antígeno se encuentre con los timocitos opacos doble positivos, luego ingrese a una etapa baja de CD cuatro CD ocho positivo de transición antes de convertirse en CD cuatro.

Los timocitos monopositivos o CD ocho simples positivos se caracterizan por su alta expresión de TCR y la pérdida de CD 24. Mientras que el perfil de CD ocho por CD cuatro puede revelar defectos en la selección positiva, el examen de TCR beta por CD 69 o CD cinco puede proporcionar más información sobre dónde se encuentra el defecto. Tanto el CD 69 como el CD 5 se regulan al alza después de la estimulación del TCR con interacciones más fuertes que conducen a una mayor expresión de estos marcadores.

En este gráfico de TCR beta por CD 69 en un ratón de tipo salvaje, la marcha TCR R beta baja CD 69 negativa representa una población de timocitos dobles positivos de preselección. Mientras que esta marcha TCR beta intermedia CD 69 positiva representa una población de transición directamente después de la participación de TCR y consiste en células brillantes dobles positivas con algunas células bajas dobles positivas opacas y CD cuatro positivas CD ocho bajas. Aquí, la marcha TCR R beta alta CD 69 positiva ilustra la población de células directamente después de la selección positiva, que consiste en células dobles positivas opacas CD cuatro positivas, CD ocho bajas y CD cuatro células positivas simples.

Por último, esta marcha negativa para CD 69 beta alto de TCR muestra una población más madura de células que consiste principalmente en células CD cuatro y CD ocho positivas simples. La ausencia de las poblaciones TCR R beta intermedia CD 69 positiva y TCR R beta alta CD 69 positiva puede ser indicativa de cambios en la selección positiva alterada en la proporción de CD cuatro positivo único y CD ocho. Las células positivas individuales dentro de la población negativa para TCR beta alto CD 69 pueden sugerir alteraciones en el compromiso del linaje.

La pérdida de las poblaciones TCR beta alta CD 69 positiva y TCR beta alta CD 69 negativa puede reflejar problemas de supervivencia después de la selección positiva. El examen de TCR beta por CD cinco es otra estrategia para identificar poblaciones de selección pre y post positiva. Estas dos primeras poblaciones consisten principalmente en timocitos brillantes dobles positivos.

La población baja de TCR beta CD cinco baja representa la preselección de timocitos doble positivos, y la población intermedia TCR beta CD cinco intermedia está formada por las células que inician la selección positiva. La generación alterada de esta población o de la anterior sugiere una selección positiva defectuosa. Sin embargo, la población alta de TCR R beta intermedio CD 5 representa timocitos en proceso de selección positiva y consiste principalmente en doble positivo opaco y CD cuatro positivo.

CD ocho timocitos bajos. La población de TCR beta alta CD cinco alta consiste principalmente en selección post positiva. Los timocitos positivos simples cambian en la proporción de CD cuatro, positivos simples y CD ocho.

Las células individuales positivas dentro de esta población, a pesar de las poblaciones precedentes normales, pueden sugerir alteraciones en el compromiso del linaje. Además, la ausencia de esta población puede indicar una disminución de la supervivencia de los timocitos después de la selección positiva, ya que la selección negativa implica la deleción de pequeñas poblaciones específicas de antígenos. Los defectos en este proceso se observan mejor utilizando ratones transgénicos TCR en HY CD, cuatro micones, los timocitos que expresan el transgénico H-Y-T-C-R se pueden detectar con el anticuerpo monoclonal T 3.7.

El H-Y-T-C-R reconoce el antígeno HY específico masculino presentado dentro del MHC Clase uno db. Por lo tanto, los ratones machos HY CD cuatro se someten a una selección negativa de timocitos H-Y-T-C-R positivos, como lo indica una reducción en el número de timocitos T tres coma 70 positivos dobles positivos, y una disminución más dramática en el número de citos T 3.7 CD 8 positivo, un solo número de citos positivos. Por el contrario, los ratones hembra HY CD cuatro se someten a una selección positiva para generar células T 3.7 CD ocho positivas únicas.

Si bien una reducción en el número de thas positivos dobles es indicativa de selección negativa, la ausencia de timocitos positivos simples específicos del antígeno es la medida más precisa. Un examen más detallado de los pocos T tres punto 70 CD positivos ocho timocitos positivos simples en ratones machos HY CD cuatro revela que la mayoría son células inmaduras altas CD 24. Si bien la mayoría de los timocitos T tres punto 70 CD 8 positivos únicos en la hembra HY CD cuatro han alcanzado la madurez y tienen un CD 24 bajo, lo que proporciona un apoyo adicional, esa selección negativa ocurre en ratones machos HY CD cuatro.

Una advertencia de los modelos transgénicos de TCR es que es difícil caracterizar aún más la selección positiva mediante la identificación de poblaciones basadas en la expresión de TCR y CD 69 o CD cinco debido a la alta expresión de TCR a lo largo del desarrollo de CYTE, los ratones hembra HY CD cuatro tienen una gran población de timocitos T tres punto 70 positivos dobles positivos que se someten a una selección positiva. Como lo indica un aumento en la población positiva para CD 69 en comparación con el tipo salvaje, la selección negativa implica un estímulo TCR de mayor afinidad que la selección positiva. Esto se indica por una mayor expresión de CD 69 en timocitos T tres punto 70 positivos dobles positivos en ratones machos HY CD cuatro, lo que resulta en un desplazamiento del pico del histograma hacia la derecha.

Tendencias similares se observan con la expresión de CD cinco cuando se analiza la selección tímica en ratones manipulados genéticamente. El examen de la expresión de CD 69 o CD 5 puede determinar si el defecto radica en la señalización de TCR o en un resultado posterior de la estimulación de TCR. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos horas y media para la preparación y tinción de las células, más una hora adicional para la recopilación de datos en el citómetro de flujo.

Si se realiza correctamente, cada mouse adicional agregará aproximadamente 30 minutos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular los timocitos con cuidado y asegurarse de haber planificado la estrategia de tinción de antemano. Siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros ensayos, como los ensayos de eliminación o los ensayos de producción de citoquinas, para responder a preguntas adicionales, como si los timocitos exportados funcionan correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar el desarrollo del sitio tímico mediante citometría de flujo.