Name: El examen de selección tímica positivo y negativo por citometría de flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: Aprenda a examinar el desarrollo de células T mediante citometría de flujo en ratones geneticamente modificados. Este método permite identificar poblaciones linfocitarias y estudiar genes críticos para la generación del repertorio T.

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Los autores desean dar las gracias a Bing Zhang por su asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (RP-86595). TAB es un Investigador CIHR Nueva y Académico AHFMR. QH es apoyado por una beca de CIHR Canadá Posgrado - Doctorado y una beca de AIHS tiempo completo. SAN es apoyado por una beca de la reina Elizabeth II de Posgrado. AYWS con el apoyo de una beca NSERC Postgrado - Doctorado.

Consulte la Figura 1 para un esquema general del protocolo experimental. 1. Disección <ol><li> Place acero estéril pantalla de malla en 60 x 15 mm plato Petri. Una unidad se necesita por muestra de tejido. </li><li> Añadir 5 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a cada placa. Mantenga los platos en hielo. </li><li> Eutanasiar ratones con CO 2. </li><li> Ratón segura a la superficie de la disección, la parte ventral hacia arriba. Spray de ratón con 70% de etanol para la esterilización y para asegurar que la piel es enredado abajo. </li><li> Usando tijeras quirúrgicas, comenzar la disección haciendo una incisión ventral en la piel abdominal justo por encima de los genitales. Extienda la incisión hacia arriba a la barbilla. </li><li> Desde la línea media, extender la incisión hacia abajo a lo largo de todas las extremidades. Tire hacia atrás la piel suelta y el pin a la superficie disección. </li><li> Coseche el timo: <ol><li> Levante la punta inferior del esternón para hacer una incisión.</li><li> Evitar el hígado, cortar el diafragma para separar las costillas y luego se corta la caja torácica a cada lado. Cortar hacia arriba costillas en cada lado, teniendo cuidado de evitar los pulmones y el corazón. </li><li> Tire suavemente de la caja torácica espalda con pinzas. El timo es un órgano blanco, bilobulado situado por encima del corazón. Con el borde plano de la pinza para agarrar la parte inferior de los lóbulos, tire suavemente el timo y lo coloca en la pantalla de malla. </li></ol></li><li> Se recoge el bazo: <ol><li> El bazo es un rojo, en forma de tabla de surf órgano situado en el lado izquierdo de la cavidad abdominal del ratón, por debajo del hígado. </li><li> Hacer una incisión en la cavidad abdominal. Retire con cuidado el bazo con un par de pinzas, utilizando el par de segundos para provocar el tejido conectivo. Coloque el bazo en una pantalla de malla separada. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de células <ol><li> El uso de un émbolo de una jeringa de 3 ml, molerórganos en la malla hasta que el tejido conectivo y sólo restos de grasa. Enjuague con HBSS malla de la cápsula tres veces. Utilice un émbolo nuevo para cada muestra de tejido. <ol><li> Otras opciones para la homogeneización de tejido se puede utilizar en lugar de este método. </li></ol></li><li> Contar las células usando un hemocitómetro. </li><li> Precipitar las células por centrifugación a 335 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Esplenocitos Resuspender en 500 l de tampón de lisis ACK (0,15 M NH 4 Cl, 10 mM KHC0 3, 0,1 mM Na 2 EDTA, pH 7,2) durante 10 min a temperatura ambiente. Timocitos Resuspender a 20 x 10 6 células / ml en tampón FACS (PBS, 1% FCS, 0,02% de azida de sodio) y dejar de lado en el hielo. </li><li> Volver a la isotonicidad esplenocitos mediante la adición de 5 ml de HBSS. Pellet esplenocitos por centrifugación y se resuspende en 20 x 10 6 células / ml en tampón FACS. Si las células deben permanecer estériles, puede utilizar estéril RPMI + 10% de FCS. </li></ol> 3.Las células de tinción para citometría de flujo El objetivo de este protocolo es delinear estrategias para el análisis de selección positiva y negativa usando tipo salvaje (WT) y ratones HY CD4. Por consideraciones generales relacionadas con la citometría de flujo de diseño experimental, adquisición y análisis, nos referimos a los lectores una excelente revisión de Tung et al. 11 <ol><li> Alícuota de 4 x 10 6 timocitos por muestra de citometría de flujo a cada pocillo de una placa de 96-pocillos, así como 1 x 10 6 esplenocitos WT por control de compensación. Si el uso de ratones transgénicos, se debe incluir un ratón WT como un control en un experimento. </li><li> Bloquear los receptores Fc mediante la incubación de las células con anti-CD16/32 (clon 2.4G2) durante 10 min en hielo. </li><li> Girar la placa a 335 xg, a 4 ° C durante 5 min. Retire la tapa y disipar líquido de los pozos colocando el plato una vez, boca abajo en el fregadero. Resuspender cada pocillo en 200 l de tampón FACS. Repita el lavado. </li><li> Preparar cócteles de anticuerpos como se indica a continuación, utilizando la concentración óptima de cada anticuerpo sobre la base de la dilución en 200 l de tampón FACS por pocillo. La concentración óptima de cada anticuerpo se define como la concentración más baja necesaria para proporcionar la mayor separación de las poblaciones positivas y negativas. Si no existe una población negativa para un determinado anticuerpo, un anticuerpo isotipo deben ser incluidos. El volumen total por pocillo se puede reducir (por ejemplo a 100 l por pocillo) si se desea. <ol><li> PESO timo: anti-TCRβ, anti-CD4 y anti-CD8, anti-CD69 o anti-CD5 y anti-CD24 </li><li> HY timo CD4: anti-TCR HY (T3.70), anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 o anti-CD5, anti-CD24 Para obtener una mejor separación de CD69 y CD69 Mín poblaciones HI de los timocitos, se recomienda que un anticuerpo biotinilado anti-CD69 primaria ser utilizado, seguido de una tinción secundaria que contiene un fluorocromo conjugado estreptavidina. Nos üsí la misma estrategia para CD5 tinción. </li></ol></li><li> Se incuban las células con 200 l de cóctel de anticuerpos en tampón FACS durante 30 min en hielo en la oscuridad. </li><li> Coincidiendo con la tinción de anticuerpos cóctel, mancha cada control de compensación con un solo fluorocromo y conjugado de anticuerpos. Idealmente, la tinción de compensación implica los mismos anticuerpos tal como se utiliza en el cóctel de anticuerpos. Sin embargo, la tinción para cada antígeno individual puede no ser factible para grandes experimentos cuando muchos antígenos se está ensayando. Por lo tanto, la tinción de los anticuerpos anti-CD4 o anti-CD8 es recomendable debido a la alta expresión de estos antígenos, o el uso de perlas de compensación. Teñir en tampón FACS durante 30 min en hielo en la oscuridad. Agregar un control de compensación sin mancha. </li><li> Lavar las células dos veces con tampón FACS. </li><li> Resuspender las células en tampón FACS y la transferencia a tubos de FACS. </li><li> Adquirir muestras en citómetro de flujo. Incluye la adquisición de FSC y FSC-A-W para unllow de discriminación doblete. </li></ol> 4. Análisis de citometría de flujo de datos - Non-TCR ratones transgénicos Usamos FlowJo por citometría de flujo de análisis de datos. Refiérase a la Figura 2A para la estrategia de activación periódica para no TCR ratones transgénicos. <ol><li> Usando FSC-A por SSC, puerta electrónica en el &quot;linfocitos&quot; de la población. </li><li> Dentro de la &quot;linfocitos&quot; de la población, el uso FSC-A por el FSC-W electrónicamente a la puerta de la FSC-W población lo excluir dobletes celulares y aggregrates. Esta es la &quot;camiseta&quot; de la puerta. </li><li> Con los acontecimientos de la &quot;camiseta&quot; puerta, parcela CD8 por CD4. Dibuja puertas para DN, aburrido DP, DP brillante, CD4 + CD8 poblaciones lo, CD4SP CD8SP y como se muestra en la Figura 2B. </li><li> En las puertas CD4SP y CD8SP, crear TCRβ por CD24 parcelas. Utilice la herramienta de gating cuadrante para dibujar puertas como se muestra en la Figura 2C. </li><li> Crear una new argumento de la &quot;camiseta&quot; puerta: TCRβ de CD69. Dibujar puertas A, B, C, D tal como se representa en la Figura 2D. </li><li> Crear otra parcela de la &quot;camiseta&quot; puerta: TCRβ por CD5. Dibujar puertas i, ii, iii, iv como se representa en la figura 2E. Esta es otra estrategia para el examen de selección positiva. </li><li> Aplicar DN, aburrido DP, DP brillante, int CD4, CD4SP y puertas CD8SP de debajo de &quot;singlete&quot; a puertas i, ii, iii, iv, A, B, C, D (Figura 2 D, E). </li><li> Calcular el número de células en un determinado subconjunto de multiplicar celularidad de órganos por la frecuencia de cada puerta posterior hasta llegar a la población objetivo. Por ejemplo, el número de TCRβ hi-CD69 CD8SP timocitos sería determinado por el timo celularidad x% bhi TCR CD69-(fracción D) x CD8SP%. <ol><li> Contando ya tiene en cuenta que las células vivas y muertas por lo que no se incluye el lymphoc &quot;YTE &quot;puerta en sus cálculos. </li></ol></li></ol> 5. Análisis de citometría de flujo de datos - TCR ratones transgénicos Consulte la Figura 3A para la estrategia de puerta para TCR ratones transgénicos. <ol><li> Siga los pasos 4,1 y 4,2 como en la sección anterior. </li><li> Bajo el &quot;singlete&quot; puerta, crear un T3.70 por parcela SSC y la puerta en la T3.70 + población celular a analizar antígenos específicos de células T (Figura 3B). En algunas circunstancias, puede ser de interés para comparar esta población a la no específica de antígeno (T3.70-) población de células T. </li><li> Dentro de la población T3.70 +, dibujar DN, DP, CD4SP y CD8SP puertas (Figura 3C). <ol><li> Para las muestras de control WT, dibujar estas puertas bajo la &quot;camiseta&quot; puerta o crear una T3.70-gate, ya que habrá muy pocos T3.70 + células. </li></ol></li><li> Bajo la puerta CD8SP, crear unaT3.70 por CD24 trama. Utilice la herramienta de gating cuadrante para dividir las células en cuatro poblaciones (Figura 3F). </li><li> Crear un histograma que representa superpuesto expresión de CD69 en el compartimiento de DP de ratones WT y T3.70 + compartimiento DP de CD4 HY ratones (Figura 4A). Repetir para examinar la expresión de CD5 (Figura 4B). </li><li> Calcular el número absoluto de células en cada subconjunto de interés como en 4,8. </li></ol>

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El protocolo presentado aquí puede ser utilizado para examinar la selección positiva y negativa en no-TCR transgénicos y ratones transgénicos TCR. Este protocolo describe la tinción de antígenos de superficie. Para un análisis más detallado de los mecanismos moleculares, a menudo es necesario para realizar la tinción intracelular. Usamos la BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit para la mayoría de las proteínas intracelulares y el Kit de BD Biosciences Foxp3 de tinción para los factores de transcripción. Por lo general, ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Solución salina equilibrada de Hank HyClone </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30030.02 </td><td></td></tr><tr><td> Pantallas metálicas de malla </td><td> Cedarlane </td><td> CX-0080-E-01 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de Petri (60 x 15 mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 877221 </td><td></td></tr><tr><td> Jeringuillas (3 ml) </td><td> BD Biosciences </td><td> 309657 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos cónicos (15 ml) </td><td> Sarstedt </td><td> 62.554.205 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Zeiss - Primo Star </td><td> 415500-000-00XX </td><td></td></tr><tr><td> Hemocitómetro </td><td> HausserCientífico </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> Placa de 96 pocillos </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> Pipeta multicanal </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-829 </td><td></td></tr><tr><td> Suero de ternero fetal </td><td> PAA </td><td> A15-701 </td><td></td></tr><tr><td> Salina tamponada con fosfato </td><td> Fisher Scientific </td><td> SH3025802 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio azida </td><td> IT Baker Chemical Co. </td><td> V015-05 </td><td></td></tr><tr><td> FcR reactivo de bloqueo </td><td></td><td></td><td> Clone 2.4G2 </td></tr><tr><td> Anti-ratón HY TCR </td><td> eBioscience </td><td> XX-9930-YY * </td><td> Clone T3.70 </td></tr><tr><td> Mouse anti-CD4 </td><td> eBioscience </td><td> XX-0042-YY * </td><td> Clone RM4-5 </td></tr><tr><td> Lanti-ratón CD8 </td><td> eBioscience </td><td> XX-0081-YY * </td><td> Clone 53-6.7 </td></tr><tr><td> Anti-CD24 de ratón </td><td> eBioscience </td><td> XX-0242-YY * </td><td> Clone M1/69 </td></tr><tr><td> Anti-ratón TCRβ </td><td> eBioscience </td><td> XX-5961-YY * </td><td> Clon H57-597 </td></tr><tr><td> Anti-CD69 de ratón biotinilado </td><td> eBioscience </td><td> 13-0691-AA * </td><td> Clone H1.2F3 </td></tr><tr><td> Anti-ratón biotinilado CD5 </td><td> eBioscience </td><td> 13-0051-YY * </td><td> Clone 53-7.3 </td></tr><tr><td> Estreptavidina </td><td> eBioscience </td><td> XX-4217-YY * </td><td></td></tr><tr><td> Citómetro de flujo </td><td> BD Biosciences - FACS Canto </td><td> 338962 </td><td></td></tr><tr><td> FACS tubos </td><td> BD Biosciences </td><td> 352052 </td><td></td></tr><tr><td> La citometría de flujo de software de análisis </td><td> TreeStar - FlowJo </td><td> FlowJo v7 / 9 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone medio RPMI - 1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30027.01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * XX varía según el fluorocromo y YY varía según el tamaño del vial. </td></tr></tbody></table>

el examen de selección tímica positivo y negativo por citometría de flujo

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

Un sistema inmunológico saludable requiere que las células T responden a antígenos extraños sin dejar de ser tolerante a antígenos propios. Reordenamiento aleatorio del receptor de células T (TCR) α y β loci genera un repertorio de células T con una gran diversidad en la especificidad de antígeno, tanto para uno mismo y extranjeros. Selección del repertorio durante el desarrollo en el timo es crítico para la generación de células T segura y útil. Los defectos en la selección tímica contribuir al desarrollo de trastornos autoinmunes e inmunodeficiencia 1-4. Progenitores de células T entrar en el timo como dobles negativas (DN) timocitos que no expresan CD4 o CD8 co-receptores. Expresión de la αβTCR y ambos receptores co-ocurre en el doble positiva (DP) etapa. Interacción de la αβTCR con el auto-péptido-MHC (pMHC) presentados por células tímicas determina el destino de la timocitos DP. Interacciones de alta afinidad conducir a la selección negativa y la eliminaciónción de las materias autorreactivas timocitos. Interacciones de baja afinidad resultado en la selección positiva y el desarrollo de las células CD4 o CD8 individuales positivos (SP) células T capaces de reconocer antígenos extraños presentados por auto-MHC 5. La selección positiva puede ser estudiada en ratones con un anticuerpo policlonal (tipo salvaje) repertorio TCR mediante la observación de la generación de células T maduras. Sin embargo, no son ideales para el estudio de selección negativa, que implica la supresión de pequeñas poblaciones específicas de antígeno. Muchos sistemas modelo se han utilizado para estudiar la selección negativa, pero varían en su capacidad para recapitular los eventos fisiológicos 6. Por ejemplo, la estimulación in vitro de timocitos carece del entorno del timo que está íntimamente involucrada en la selección, mientras que la administración de antígeno exógeno puede conducir a la supresión no específica de los timocitos 7-9. En la actualidad, las mejores herramientas para estudiar en la selección negativa vivo son ratones que expresan una transgenic TCR específico para el auto-antígeno endógeno. Sin embargo, muchos clásicos modelos transgénicos TCR se caracterizan por prematura expresión de la cadena TCRα transgénica en la etapa de DN, lo que resulta en la eyaculación de selección negativa. Nuestro laboratorio ha desarrollado el modelo HY CD4, en el que el transgénico HY TCRα está condicionalmente expresó en la fase DP, permitiendo la selección negativa que se producen durante la transición a DP SP como ocurre en ratones de tipo salvaje 10. Aquí se describe un flujo de citometría de protocolos para examinar la selección tímica positivo y negativo en el modelo de ratón HY CD4. Mientras que la selección negativa en las células CD4 HY ratones es muy fisiológico, estos métodos también se pueden aplicar a otros modelos transgénicos TCR. También se presentarán las estrategias generales para el análisis de la selección positiva en un repertorio policlonal aplicable a cualquier ratones genéticamente manipulados.

En fisiológicos TCR modelos transgénicos y ratones WT, la selección positiva se inicia en la etapa DP brillante antes de pasar a la etapa de DP aburrido después del encuentro de antígeno. Timocitos DP aburridos a continuación, introduzca un CD4 + CD8 etapa de transición antes de convertirse en lo CD4SP o timocitos CD8SP (Figura 2B). Timocitos maduros SP se caracteriza por la alta expresión de TCR y la pérdida de CD24 (Figura 2C). Mi...

Se presenta una citometría de flujo basado en el método para examinar el desarrollo de las células T<em&gt; In vivo</em&gt; Utilizando ratones genéticamente manipulados en un fondo de tipo salvaje o receptor de células T transgénicos.

El examen de selección tímica positivo y negativo por citometría de flujo

Un sistema inmunitario saludable requiere que las células T respondan a los antígenos extraños mientras mantienen la tolerancia a los autoantígenos. El reordenamiento aleatorio de las células T...

El objetivo general del siguiente experimento es examinar el desarrollo tímico en ratones mediante citometría de flujo. Esto se logra preparando suspensiones de células individuales a partir del timo y el bazo del ratón. Como segundo paso, los timocitos y linfocitos se tiñen con un cóctel de anticuerpos para la identificación de poblaciones tímicas específicas.Finalmente, la frecuencia y el número de diversas poblaciones de linfocitos pueden evaluarse mediante análisis citométrico de flujo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el desarrollo de linfocitos T, como qué genes y vías son importantes para generar un repertorio de células T funcional pero tolerante a las células propias. Aunque este método puede proporcionar información sobre el desarrollo de células T en el timo, también puede aplicarse en el estudio del desarrollo de otras células inmunitarias.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para diseñar sus cócteles de anticuerpos para citometría de flujo. Antes de comenzar la disección, coloque una malla de acero estéril en una placa de Petri de 60 por 15 milímetros. A continuación, agregue cinco mililitros de HBSS a la placa

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra una técnica basada en citometría de flujo que utiliza dos fluorocromos para identificar linfocitos T CD4+ y CD8+, linfocitos T γδ, linfocitos B, linfocitos citolíticos naturales (NK) y monocitos en linfocitos mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs). Al incubar las células con anticuerpos conjugados con fluorocromo contra los marcadores de superficie, los subconjuntos de células se identifican utilizando una estrategia óptima de activación por citometría de flujo.

Ensayo de citometría de flujo para identificar subconjuntos de células inmunitarias en células mononucleares de sangre periférica

Aquí se describe un método eficiente para el aislamiento, identificación y purificación de ratón las células epiteliales del timo (TEC). El protocolo puede ser utilizado para estudios de la función del timo para el desarrollo normal de células T, la disfunción del timo, y la reconstitución de células T.

El aislamiento, la identificación y purificación de células epiteliales del timo murino

Se describe la preparación de rebanadas tímicos que, en combinación con citometría de flujo, pueden ser usados ​​para modelar la selección positiva y negativa de desarrollar células T. Rebanadas tímicos también pueden ser adaptadas para el análisis in situ de la migración de timocitos, la localización, y la señalización a través de inmunofluorescencia y microscopía de dos fotones.

Preparación y aplicaciones de Organotípicos tímico Slice culturas

La superficie ocular normal expuesta consiste en córnea y conjuntiva. Las células epiteliales, las células caliciformes y las células inmunes están presentes en la conjuntiva. Aquí, se describe una técnica no invasiva de citología de impresión usando un dispositivo de citología de impresión y citometría de flujo para analizar células inmunes en la conjuntiva.

Una forma no invasiva de aislar y células fenotípicas de la conjuntiva

Aquí, un protocolo para el aislamiento y la caracterización de CD4+ T-cell se describe subconjuntos de sangre periférica humana. Purificada de CD4+ las células T son analizadas por citometría de flujo para determinar proporciones de subconjuntos de células helper T-folicular.

Aislamiento de CD4+ las células de T y análisis de circulación folicular T Helper (cTfh) subconjuntos de la célula del uso de sangre periférica citometría de flujo de 6 colores

Adjunto, presentamos un protocolo para preparar las células de ratón timo, páncreas drena a ganglios linfáticos y el bazo a un estudio más profundo estas células mediante citometría de flujo. Además, este protocolo se utiliza para determinar los subconjuntos de células T reguladoras mediante citometría de flujo.

Determinación de subconjuntos de células T reguladoras en murino timo, pancreático drenaje del nodo de linfa y bazo mediante citometría de flujo

Aquí, presentamos un protocolo de citometría de flujo para identificar CD4+ y CD8+ T las células, las células de T del γδ, células B, células NK y monocitos en sangre periférica mediante sólo dos fluorocromos en lugar de siete. Con este enfoque, se pueden grabar cinco marcadores adicionales en la mayoría los citómetros de flujo.

Discriminación de siete subconjuntos de células inmunes por dos fluorocromo citometría de flujo

Describimos aquí un análisis simple de la heterogeneidad del compartimento de células B inmunes murinas en el peritoneo, el bazo y los tejidos de la médula ósea por citometría de flujo. El protocolo se puede adaptar y extender a otros tejidos de ratón.

Caracterización citométrica de flujo del desarrollo de células B murinas

Este protocolo describe el aislamiento de timocitos doble negativos del timo de ratón seguido de transducción retroviral y cocultivo en el sistema de cocultivo de líneas celulares del estroma del estroma de médula ósea que expresa 4 en forma delta (OP9-DL4) para un análisis funcional adicional.

Cocultivo y transducción de timocitos murinos en células estromales que expresan 4 similares a Delta para estudiar oncogenes en leucemia de células T

Describimos protocolos para la preparación de suspensión unicelular de células epiteliales tímicas de ratón y la tinción de moléculas intracelulares para el análisis de citometría de flujo.

Preparación de suspensión unicelular de células epiteliales tímicas de ratón y tinción de moléculas intracelulares para análisis citométrico de flujo

Aprenda a examinar el desarrollo de células T mediante citometría de flujo en ratones geneticamente modificados. Este método permite identificar poblaciones linfocitarias y estudiar genes críticos para la generación del repertorio T.

El examen de selección tímica positivo y negativo por citometría de flujo

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