Name: Determinación de subconjuntos de células T reguladoras en murino timo, pancreático drenaje del nodo de linfa y bazo mediante citometría de flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Aprende a preparar suspensiones de células únicas de timo, bazo y ganglios linfáticos pancreáticos en ratones para citometría de flujo. Este método permite identificar subconjuntos de células T reguladoras de forma económica y accesible.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El presente estudio fue apoyado financieramente por el Consejo de investigación sueco, EXODIAB, la Fundación sueca de la Diabetes, el sueco niño Diabetes fondo, SEB Diabetesfonden y O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Autores también quisieran gracias por Ola Carlsson y Stellan Sandler por sus soportes y discusiones.

El Comité local de ética animal en Universidad de Uppsala aprobó la experimentación animal.
1. recolección de órganos de animales
<ol><li>Los ratones de sacrificio mediante dislocación cervical.</li>
	<li>Coloque las glándulas timo y bazo en viales de centelleo de 20 mL o en tubos cónicos de 15 mL con 5 mL de Hanks´ equilibrada solución de sal (HBSS). PDLNs lugar en micro tubos de 1,5 mL con 1 mL de RPMI 1640. Utilice todo timo y bazo y el PDLNs. Nota: Órganos deben conservarse en hielo durante todo el procedimiento y el investigador debe tratar de ser rápido y preparar suspensiones de la célula, especialmente cuando la manipulación de tejido tímico pues tímicas células inmunes pueden ser degradadas rápidamente a altas temperaturas.</li>
</ol>2. célula aislamiento de timo y bazo
<ol><li>Apriete bien el timo y el bazo con un par de pinzas para liberar las células inmunes. Deseche la cápsula restante del timo y bazo.</li>
	<li>Transferir la suspensión de células a un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 433 x g durante 5 min a 4 ° C para formar un pellet. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Para lisar los glóbulos rojos, suspender la suspensión de células en 5 mL de 0.2 M de NH4Cl e incubar a temperatura ambiente por 10 minutos invertir los tubos boca abajo suavemente cada 2 minutos añadir 5 mL de HBSS al final de la incubación para detener la lisis.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en aproximadamente 5 mL de HBSS. Llene los tubos con HBSS.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en aproximadamente 5 mL de HBSS. Llene los tubos con HBSS.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en 5 mL de la HBSS para timo y 10 mL para el bazo.</li>
	<li>Transferencia 1 mL de la suspensión de células tímicas y 500 μl de la suspensión de células esplénicas a 5 mL alrededor de tubos con tapas de filtro de la célula. Aplicar la suspensión de células a las tapas de filtro de la célula. Nota: Una malla de nylon de 35 μm se incorpora en la tapa. Aproximadamente 5 millones células se colectaron en cada tubo.</li>
</ol>3. célula aislamiento de PDLN
<ol><li>Colocar una malla metálica de 250 μm estéril en un tubo cónico de 15 mL en una parrilla. Lavar la malla con 1 mL de RPMI.</li>
	<li>Transferencia de los nodos de linfa a la malla metálica y moler a través de la malla utilizando un par de pinzas. Aplicar 1 mL de RPMI en la malla metálica para limpiar las células en el tubo. Repetir 3 veces más y sacar la malla.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en aproximadamente 5 mL de RPMI. Llene los tubos con RPMI.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en aproximadamente 5 mL de RPMI. Llene los tubos con RPMI.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en 2 mL de RPMI. Transferencia 2 mL de la suspensión de células a 5 mL alrededor de tubos con tapas de filtro de la célula. Aplicar la suspensión de células a las tapas de filtro de la célula.</li>
</ol>4. citometría de flujo
<ol><li>Centrifugue las suspensiones de células de timo, PDLN y bazo en 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Las células con los siguientes anticuerpos superficie en 100 μl de citometría de flujo tampón (tampón FACS) la coloración de la mancha: 0.75 anticuerpo μg/100 μl CD4 FITC conjugado, 0,60 CD8 APC H7 conjugado anticuerpos de μg/100 μl, anticuerpo 0.30 μg/100 μl CD25 conjugado con PE, 5 μl (1:20) Anticuerpo conjugado con APC de Nrp1. Incubar los tubos en hielo durante 40 minutos.</li>
	<li>Añadir 200 μL de tampón FACS a cada tubo. Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante. Repetir una vez más.</li>
	<li>Fijar y permeabilizar las células por Resuspender el pellet celular en 500 μl de tampón de fijación permeabilización (PFB). Nota: PFB se prepara mezclando 1 parte de fijación/permeabilización concentrado con 3 partes de diluyente de fijación/permeabilización.</li>
	<li>Mantener los tubos en la nevera a 4 ° C durante la noche. Nota: También funciona una incubación de 1 h.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en 500 μl de tampón de lavado permeabilización (PWB). Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante. Nota: PLP se prepara diluyendo permeabilización Buffer (10 x) a 1:10 en agua destilada.</li>
	<li>Las células con los siguientes anticuerpos intracelulares en 100 μl de PLP de la mancha: 0,30 anticuerpo μg/100 μl de conjugado con PE Cy7 Foxp3, 4 μL (1:25) Helios PacificBlue-conjugado anticuerpo. Incubar los tubos en hielo durante 1 hora.</li>
	<li>Añadir 500 μl de PLP a cada tubo. Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en 500 μl de PLP. Centrifugar los tubos a 433 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en 300 μL de tampón FACS.</li>
	<li>Analizar las células en un citómetro de flujo.</li>
	<li>Las células basadas en el área de dispersión lateral, altura y anchura y Forward Scatter-área, altura y anchura de la puerta. Ejecutar eventos 1 millón para el análisis.</li>
	<li>Exportar los archivos FCS de experimentos y analizarlos utilizando un software de analizador de citometría de flujo.</li>
</ol>

<ol><li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li>
<li>Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+Scurfin+in+CD4%2BCD25%2B+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).</li>
<li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li>
<li>Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+self-tolerance+maintained+by+activated+T+cells+expressing+IL-2+receptor+alpha-chains+%28CD25%29.+Breakdown+of+a+single+mechanism+of+self-tolerance+causes+various+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.</a> The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).</li>
<li>Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+regulatory+T+cells+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">How regulatory T cells work.</a> Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).</li>
<li>Thornton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Helios%2C+an+Ikaros+transcription+factor+family+member%2C+differentiates+thymic-derived+from+peripherally+induced+Foxp3%2B+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells.</a> The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).</li>
<li>Weiss, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin+1+is+expressed+on+thymus-derived+natural+regulatory+T+cells%2C+but+not+mucosa-generated+induced+Foxp3%2B+T+reg+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).</li>
<li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-1+distinguishes+natural+and+inducible+regulatory+T+cells+among+regulatory+T+cell+subsets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).</li>
<li>Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+analysis+of+Helios+and+Neuropilin-1+as+a+marker+to+detect+thymic+derived+regulatory+T+cells+in+naive+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice.</a> Scientific Reports. 5, 7767(2015).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+spleen+with+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-35+administration+counteracts+established+murine+type+1+diabetes--possible+involvement+of+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, 12633(2015).</li>
<li>Digre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+heparanase+enhances+T+lymphocyte+activities+and+intensifies+the+inflammatory+response+in+a+model+of+murine+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis.</a> Scientific Reports. 7, 46229(2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-tumoral+immune+cell+alterations+in+wild+type+and+Shb-deficient+mice+in+response+to+4T1+breast+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas.</a> Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este estudio, aislado de las células de las glándulas timo, PDLNs y bazos de ratones NOD e investigado la expresión de Helios y Nrp1 en CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg células mediante citometría de flujo. En el presente estudio, se utilizaron ratones NOD, que es un modelo murino de diabetes tipo 1. En un estudio anterior, hemos utilizado el cepas tipo salvaje ratón CD-1 y ratones C57BL/6 investigar si Helios o Nrp1 es un mejor marcador para distinguir las células tTreg de células ...

Las células reguladoras T (Treg) son críticas para la homeostasis del sistema inmune. Las células TReg se definen por la expresión de antígenos de superficie CD4 y CD25 y el factor de transcripción forkhead de caja P3 (Foxp3)2,1,3. Sakaguchi et al demostró primero que CD25 se expresa constitutivamente en las células supresoras de T en ratones4, que proporciona una observación pionera para la identificación de las células Treg humanas. Las células TReg desempeñan un papel central en la tolerancia inmunológica ejerciendo una capacidad represiva a través de una variedad de mecanismos, incluyendo citólisis a través de la secreción de granzymes para inducir apoptosis, consumo de citoquinas y la inhibición a través de la expresión de citotóxicos Linfocitos T antígeno 45. Además, pueden secretar citoquinas inhibitorias como transformación de factor de crecimiento beta (TGF-β), interleucina-10 (IL-10) y IL-355. Las células TReg pueden naturalmente derivar el timo, en cuyo caso se señalan las células Treg (tTreg) derivadas tímicas, o puede ser inducidas en los órganos periféricos en que caso se llaman periférica inducida por las células Treg (pTreg).
Helios, un miembro de la familia de factores de transcripción Ikaros, fue divulgado para ser un marcador para distinguir entre las células tTreg y células de pTreg6. Más tarde, otros dos grupos informaron que la neuropilina 1 (Nrp1), un receptor III semaphorin, podría servir como un marcador de superficie para tTreg las células bajo ciertas condiciones7,8. Sin embargo, Singh et al han demostrado que Helios es un mejor marcador en este contexto en ingenuo ratones9.
Los subconjuntos de células Treg juegan un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis del sistema inmune y en la protección contra la infección y autoinmunidad. Por lo tanto, es importante determinar los números y proporciones de estas poblaciones en los tejidos linfoides y no linfoides. Para lograr esto, uno tiene que preparar suspensiones de la célula de estos órganos. Un número de protocolos ha sido descrito o utilizados en estudios anteriores. Principalmente, se han utilizado automáticas disociadores en informes previamente publicados10,11. Utilizando disociadores automáticas es conveniente y ahorro de tiempo, pero es un procedimiento costoso. Por lo tanto, hemos utilizado un método manual para preparar suspensiones de la célula de murinas glándulas timo, nodos de linfa de drenaje pancreáticos (PDLNs) y bazos de ratones de (cabeceo) diabéticos no obesos normoglucémicos y aislado las células de estos órganos. Este método se ha utilizado en nuestros anteriores estudios y se encontró que el método manual para la preparación de la suspensión de células individuales es tan eficiente como disociador automático método9,12,13,14. Además, hemos utilizado la citometría de flujo para determinar las proporciones de CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg células y los subconjuntos de Treg células tTreg y pTreg. Las células tTreg y pTreg fueron distinguidas con Helios y Nrp1 como marcadores para células de tTreg. Por lo tanto, nuestros resultados indican que el método manual para la preparación de las células funciona eficientemente y las suspensiones preparadas unicelular pueden utilizarse además para estudios mediante citometría de flujo.

<table><tbody><tr><td>Ratones</td><td></td><td></td> NOD <td>Empanado interno</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Statens veterin&auml; rmedicinska anstalt</td><td>991750</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>EMD Millipore</td><td>1011450500</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3 / Juego de tampones de tinción de factor de transcripción</td><td>ThermoFisher</td><td>00-5523-00</td><td>contiene concentrado de fijación/permeabilización, diluyente de fijación/permeabilización y tampón de permeabilización (10x)</td></tr><tr><td>tampón de tinción de citometría de flujo eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal CD4 (RM4-5), FITC, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0042-85</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal CD25 (PC61.5), PE, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>12-0251-83</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen&nbsp; APC-H7 Rata anti-Ratón CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>560182</td><td></td></tr><tr><td>Neuropilin-1 de ratón Anticuerpo conjugado con APC</td><td>R& D Systems</td><td>FAB5994A</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo monoclonal FOXP3 (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>25-5773-82</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-ratón/humano Anticuerpo Helios</td><td>BioLegend</td><td>137220</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo, con filtro de células Tapón a presión</td><td>CORNING</td><td>352235</td><td>A 35 &micro; m La malla de nailon está incorporada en el tapón a presión de doble posición</td></tr><tr><td>Tubo 15 mL, 120 mm x17 mm, PP</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Micro tubo 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Viales de centelleo desechables</td><td>WHEATON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citometría de flujo</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo software de análisis</td><td>Inivai Technologies</td><td>Flowlogic</td><td></td></tr></tbody></table>

determinación de subconjuntos de células t reguladoras en murino timo, pancreático drenaje del nodo de linfa y bazo mediante citometría de flujo

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Nuestro sistema inmunológico consiste en una cantidad y variedad de células inmunes, incluyendo las células T reguladoras (Treg) de células. Las células TReg pueden dividirse en dos subconjuntos, las células Treg (tTreg) derivadas tímicas y periférica inducida por las células Treg (pTreg). Están presentes en diversos órganos de nuestro cuerpo y pueden distinguirse por marcadores específicos, como Helios y la neuropilina 1. Se ha reportado que las células tTreg son funcionalmente más represivas que las células pTreg. Por lo tanto, es importante determinar la proporción de células tTreg y pTreg la investigación de poblaciones celulares heterogéneas. En este documento, recogimos las glándulas timo, nodos de linfa de drenaje pancreáticos y bazos de normoglucémicos ratones diabéticos no obesos para distinguir las células de tTreg de pTreg las células mediante citometría de flujo. Preparamos manualmente suspensiones de la célula de estos órganos. Fluorocromo había conjugado de superficie CD4, CD8, CD25, y anticuerpos de la neuropilina 1 fueron utilizados para teñir las células. Se guardaron en el refrigerador durante la noche. Al día siguiente, las células se tiñeron con fluorocromo conjugado con anticuerpos intracelulares de Foxp3 y Helios. Estos marcadores fueron usados para caracterizar los dos subconjuntos de células Treg. Este protocolo muestra una forma sencilla pero práctica para preparar las células de timo murino, drenaje de ganglios linfáticos y el bazo páncreas y utilizarlos para análisis cytometric del flujo posterior.

Para investigar la expresión de Nrp1 y Helios en células tTreg y pTreg, preparamos las células de las glándulas timo, PDLNs y bazos de ratones del cabeceo de normoglucémicos y teñido con los marcadores de células Treg CD4, CD25, Foxp3, Helios y Nrp1 para citometría de flujo Análisis. Los resultados fueron analizados como se muestra en el representante gating estrategias (figura 1). Encontramos que la proporción de células de Helios+ entre CD4+...

Adjunto, presentamos un protocolo para preparar las células de ratón timo, páncreas drena a ganglios linfáticos y el bazo a un estudio más profundo estas células mediante citometría de flujo. Además, este protocolo se utiliza para determinar los subconjuntos de células T reguladoras mediante citometría de flujo.

Determinación de subconjuntos de células T reguladoras en murino timo, pancreático drenaje del nodo de linfa y bazo mediante citometría de flujo

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

Este protocolo ayuda a investigar el papel de las células inmunitarias en determinados órganos en la salud y la patología. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de una técnica rentable ya que es una técnica manual. Demostrar el procedimiento estará Zhengkang Luo, un estudiante de doctorado de mi laboratorio.Para empezar, coloque las glándulas timicas y el bazo de ratones previamente eutanizados en phials de centelleo de 20 ml, o tubos cónicos de 15 ml, llenos de 5 ml de la solución de sal equilibrada de Hank. Coloque los ganglios linfáticos drenantes pancreáticos en microtubos de 1,5 ml llenos de 1 ml de RPMI-1640. Asegúrese de usar todo el timo y el bazo, y todos los PDLN.Mantenga los órganos sobre hielo durante todo el procedimiento. Usando un par de tijeras, apriete bien el timo y el bazo para liberar las células inmunitarias. Deseche las cápsulas timicas y esplénicas restantes.Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 433 veces g y a 4 grados centígrados durante cinco minutos, y deseche el sobrenadante. Para linsear los glóbulos rojos, vuelva a suspender la suspensión celular en 5 ml de cloruro de amonio molar 0,2 e incubar a temperatura ambiente durante diez minutos.Invierta los tubos suavemente cada dos minutos. Al final de la incubación, añadir 5 ml de HBSS para detener la lelisis. Centrifugar los tubos a 433 g y a 4 grados centígrados durante cinco minutos.Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en aproximadamente 5 ml de HBSS. A continuación, llene los tubos con HBSS. Repita este proceso, desde la centrifugación de las muestras hasta el llenado del tubo con HBSS, una vez.Centrifugar los tubos una vez más a 433 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en HBSS. Obtener 5 ml de tubos de fondo redondo con tapas de cola de células.Transfiera 1 ml de la suspensión de células timicas y 500 microlitros de la suspensión de la célula esplénica a los tubos aplicando la suspensión a las tapas de los despejadores celulares. En primer lugar, coloque un tubo cónico de 15 ml en un bastidor. Coloque una malla metálica estéril de 250 micrómetros sobre el tubo.Enjuagar la malla con 1 ml de RPMI. A continuación, transfiera los ganglios linfáticos a la malla metálica y use un par de pinzas para molerlos a través de la malla. Aplique 1 ml de RPMI en la malla para vaciar las células en el tubo.Repita este proceso de transferir y moler los ganglios linfáticos tres veces para cada muestra, y luego retire la malla. Centrifugar los tubos a 433 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en aproximadamente 5 ml de RPMI.A continuación, llene los tubos con RPMI. Repita este proceso, desde la centrifugación de las muestras hasta el llenado del tubo con RPMI, una vez. Centrifugar los tubos de nuevo a 433 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 2 ml de RPMI. Transfiera 2 ml de la suspensión celular en tubos de fondo redondo de 5 ml con tapas de celuladora. En primer lugar, centrifugar la suspensión celular del timo, el bazo y las muestras de PDLN a 433 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.Deseche el sobrenadante. Manchar las células con anticuerpos superficiales como se describe en el protocolo de texto, e incubar los tubos sobre hielo durante 40 minutos. A continuación, agregue 200 microlitros de búfer FACS a cada tubo.Centrifugar a 433 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos, y desechar el sobrenadante. Repita este proceso, agregando el búfer, centrifugando y descartando el sobrenadante, una vez. Vuelva a suspender el pellet celular en 500 microlitros de tampón de fijación de permeabilización para fijar y permeabilizar las células.Transfiera los tubos a un refrigerador a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, centrifugar los tubos a 433 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 500 microlitros de tamplización de permeabilización.Centrifugar las células de nuevo a 433 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Manchar las células con anticuerpos intracelulares, como se describe en el protocolo de texto. Incubar los tubos sobre hielo durante 1 hora.Después de esto, agregue 500 microlitros de tampinador de permeabilización a cada tubo. Centrifugar a 433 g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tamplización de permeabilización.Centrifugar una vez más a 433 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 300 microlitros de tampón FACS. Entonces, analice las células en un citometro de flujo, como se describe en el protocolo de texto.En este estudio, las células individuales se aíslan de las glándulas timicas, PDLNs y bazos de ratones NOD glucémicos normales, y se tiñen con marcadores celulares Treg, CD4, CD25, Foxp3, Helios y neuropilin-1 para el análisis citométrico de flujo. Los resultados se analizan y se muestran aquí como estrategias representativas de medición. La proporción de células Helios positivas entre las células Treg CD4 positivas, CD8 negativas, CD25-positivas se considera mayor que la de las células positivas de Nrp1 en los tres órganos.Más del 80% de las células Treg en el timo se ven para expresar Helios, que es más alto que en el PDLN, y el bazo. La proporción de células NrP1 positivas entre las células Treg positivas de Helios se observa que es mayor en el PDLN que en el timo o el bazo. La mayoría de las células Treg positivas de Nrp1 también expresan Helios, y la proporción de células Helios positivas entre las células Treg positivas de Nrp1 se observa que es más alta en el timo y el bazo que en el PDLN.Juntos, estos resultados indican que Helios es un mejor marcador para detectar células Treg que Nrp1. Los ganglios linfáticos son pequeños, pero algunos marcadores intracelulares requieren un gran número de células para dar una buena señal en la citometría de flujo. Otros métodos no se pueden realizar después de este procedimiento porque las celdas ya están manchadas y muertas.Pero los cuatro marcadores celulares del animal pueden ser reemplazados para estudiar otros tipos de células inmunitarias.

determination-regulatory-t-cell-subsets-murine-thymus-pancreatic

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este es un método rápido y completo de inmunofenotipo mieloide derivados de células supresoras (MDSC) y enriquecedora...

Preparación de células mieloides supresoras derivadas (MDSC) de ingenuo y de páncreas ratones portadores del tumor mediante citometría de flujo magnético y automatizado de células activadas clasificación (AutoMACS)

Se presenta una citometría de flujo basado en el método para examinar el desarrollo de las células...

El examen de selección tímica positivo y negativo por citometría de flujo

En este video, describimos un protocolo para aislar células individuales de ganglios linfáticos de drenaje pancreático murino (PDLN) y la caracterización de células T reguladoras (Tregs) de la población de células individuales utilizando citometría de flujo. Las Tregs se identifican en función de la expresión positiva de los marcadores de superficie celular CD4, CD25 y Nrp1, junto con los factores de transcripción nuclear Foxp3 y Helios.

Identificación de subconjuntos de células T reguladoras de ganglios linfáticos drenantes pancreáticos murinos

Con funciones efectoras diferenciadas de otros subconjuntos de células T, las células Th17 se han implicado en el centro de la autoinmunidad inflamatoria. Este protocolo de diferenciación in vitro de Th17 en proporciona un medio para determinar si ingenuas linfocitos T CD4 + pueden diferenciarse en células Th17, y para examinar aún más su papel en la autoinmunidad y la respuesta del huésped.

Aislamiento y diferenciación de Th17 Naïve linfocitos T CD4

+ &gt; 'jove_content'Naïve se polarizan en varios subconjuntos dependiendo del entorno en el momento de la activación.  La diferenciación de los linfocitos T CD4+ naïve a varios subconjuntos efectores se puede lograr in vitro mediante la adición de estímulos del receptor de linfocitos T y señales específicas de citocinas.

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Este artículo describe espectral citometría, un nuevo enfoque en la citometría de flujo que utiliza las formas de los espectros de emisión para distinguir fluorocromos. Un algoritmo reemplaza compensaciones y puede tratar autofluorescencia como un parámetro independiente. Este nuevo enfoque permite el análisis adecuado de células aisladas de órganos sólidos.

Análisis de suspensiones celulares aisladas de tejidos sólidos por Spectral Citometría de Flujo

Este artículo ilustra un método eficaz para cuantificar las mitocondrias o lisosomas en las células vivas. La combinación de tintes específicos lisosomas o las mitocondrias con fluorescente conjugados anticuerpos contra marcadores de superficie permite la cuantificación de estos orgánulos en poblaciones de mezclado de la célula, como células primarias extraídas muestras de tejido, mediante el uso de Citometría de flujo multicolor.

Cuantificación de basados en citometría de flujo multicolor de las mitocondrias y los lisosomas en las células T

Aquí, presentamos un protocolo de citometría de flujo para identificar CD4+ y CD8+ T las células, las células de T del γδ, células B, células NK y monocitos en sangre periférica mediante sólo dos fluorocromos en lugar de siete. Con este enfoque, se pueden grabar cinco marcadores adicionales en la mayoría los citómetros de flujo.

Discriminación de siete subconjuntos de células inmunes por dos fluorocromo citometría de flujo

Aquí, describimos un protocolo de citometría de flujo detallado y reproducible para identificar subconjuntos de monocitos/macrofagos y células T utilizando ensayos de tinción extra e intracelular dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial, utilizando un modelo quirúrgico establecido de osteoartritis murina.

Análisis de citometría de flujo de subconjuntos de células inmunitarias dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial en un modelo de osteoartritis

Describimos aquí un análisis simple de la heterogeneidad del compartimento de células B inmunes murinas en el peritoneo, el bazo y los tejidos de la médula ósea por citometría de flujo. El protocolo se puede adaptar y extender a otros tejidos de ratón.

Caracterización citométrica de flujo del desarrollo de células B murinas

Este protocolo proporciona una estrategia de cocultivo in vitro para investigar los efectos de las células T reguladoras sobre la proliferación y diferenciación de las células T efectoras.

In Vitro Análisis funcional de células T reguladoras: enfoque en la proliferación y diferenciación

Aprende a preparar suspensiones de células únicas de timo, bazo y ganglios linfáticos pancreáticos en ratones para citometría de flujo. Este método permite identificar subconjuntos de células T reguladoras de forma económica y accesible.

Determinación de subconjuntos de células T reguladoras en murino timo, pancreático drenaje del nodo de linfa y bazo mediante citometría de flujo (Video) | JoVE Journal

Determinación de subconjuntos de células T reguladoras en murino timo, pancreático drenaje del nodo de linfa y bazo mediante citometría de flujo

Explorar más videos