Determinación de subconjuntos de células T reguladoras en murino timo, pancreático drenaje del nodo de linfa y bazo mediante citometría de flujo

Este protocolo ayuda a investigar el papel de las células inmunitarias en determinados órganos en la salud y la patología. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de una técnica rentable ya que es una técnica manual. Demostrar el procedimiento estará Zhengkang Luo, un estudiante de doctorado de mi laboratorio.

Para empezar, coloque las glándulas timicas y el bazo de ratones previamente eutanizados en phials de centelleo de 20 ml, o tubos cónicos de 15 ml, llenos de 5 ml de la solución de sal equilibrada de Hank. Coloque los ganglios linfáticos drenantes pancreáticos en microtubos de 1,5 ml llenos de 1 ml de RPMI-1640. Asegúrese de usar todo el timo y el bazo, y todos los PDLN.

Mantenga los órganos sobre hielo durante todo el procedimiento. Usando un par de tijeras, apriete bien el timo y el bazo para liberar las células inmunitarias. Deseche las cápsulas timicas y esplénicas restantes.

Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 433 veces g y a 4 grados centígrados durante cinco minutos, y deseche el sobrenadante. Para linsear los glóbulos rojos, vuelva a suspender la suspensión celular en 5 ml de cloruro de amonio molar 0,2 e incubar a temperatura ambiente durante diez minutos.

Invierta los tubos suavemente cada dos minutos. Al final de la incubación, añadir 5 ml de HBSS para detener la lelisis. Centrifugar los tubos a 433 g y a 4 grados centígrados durante cinco minutos.

Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en aproximadamente 5 ml de HBSS. A continuación, llene los tubos con HBSS. Repita este proceso, desde la centrifugación de las muestras hasta el llenado del tubo con HBSS, una vez.

Centrifugar los tubos una vez más a 433 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en HBSS. Obtener 5 ml de tubos de fondo redondo con tapas de cola de células.

Transfiera 1 ml de la suspensión de células timicas y 500 microlitros de la suspensión de la célula esplénica a los tubos aplicando la suspensión a las tapas de los despejadores celulares. En primer lugar, coloque un tubo cónico de 15 ml en un bastidor. Coloque una malla metálica estéril de 250 micrómetros sobre el tubo.

Enjuagar la malla con 1 ml de RPMI. A continuación, transfiera los ganglios linfáticos a la malla metálica y use un par de pinzas para molerlos a través de la malla. Aplique 1 ml de RPMI en la malla para vaciar las células en el tubo.

Repita este proceso de transferir y moler los ganglios linfáticos tres veces para cada muestra, y luego retire la malla. Centrifugar los tubos a 433 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en aproximadamente 5 ml de RPMI.

A continuación, llene los tubos con RPMI. Repita este proceso, desde la centrifugación de las muestras hasta el llenado del tubo con RPMI, una vez. Centrifugar los tubos de nuevo a 433 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.

Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 2 ml de RPMI. Transfiera 2 ml de la suspensión celular en tubos de fondo redondo de 5 ml con tapas de celuladora. En primer lugar, centrifugar la suspensión celular del timo, el bazo y las muestras de PDLN a 433 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.

Deseche el sobrenadante. Manchar las células con anticuerpos superficiales como se describe en el protocolo de texto, e incubar los tubos sobre hielo durante 40 minutos. A continuación, agregue 200 microlitros de búfer FACS a cada tubo.

Centrifugar a 433 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos, y desechar el sobrenadante. Repita este proceso, agregando el búfer, centrifugando y descartando el sobrenadante, una vez. Vuelva a suspender el pellet celular en 500 microlitros de tampón de fijación de permeabilización para fijar y permeabilizar las células.

Transfiera los tubos a un refrigerador a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, centrifugar los tubos a 433 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 500 microlitros de tamplización de permeabilización.

Centrifugar las células de nuevo a 433 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Manchar las células con anticuerpos intracelulares, como se describe en el protocolo de texto. Incubar los tubos sobre hielo durante 1 hora.

Después de esto, agregue 500 microlitros de tampinador de permeabilización a cada tubo. Centrifugar a 433 g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tamplización de permeabilización.

Centrifugar una vez más a 433 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 300 microlitros de tampón FACS. Entonces, analice las células en un citometro de flujo, como se describe en el protocolo de texto.

En este estudio, las células individuales se aíslan de las glándulas timicas, PDLNs y bazos de ratones NOD glucémicos normales, y se tiñen con marcadores celulares Treg, CD4, CD25, Foxp3, Helios y neuropilin-1 para el análisis citométrico de flujo. Los resultados se analizan y se muestran aquí como estrategias representativas de medición. La proporción de células Helios positivas entre las células Treg CD4 positivas, CD8 negativas, CD25-positivas se considera mayor que la de las células positivas de Nrp1 en los tres órganos.

Más del 80% de las células Treg en el timo se ven para expresar Helios, que es más alto que en el PDLN, y el bazo. La proporción de células NrP1 positivas entre las células Treg positivas de Helios se observa que es mayor en el PDLN que en el timo o el bazo. La mayoría de las células Treg positivas de Nrp1 también expresan Helios, y la proporción de células Helios positivas entre las células Treg positivas de Nrp1 se observa que es más alta en el timo y el bazo que en el PDLN.

Juntos, estos resultados indican que Helios es un mejor marcador para detectar células Treg que Nrp1. Los ganglios linfáticos son pequeños, pero algunos marcadores intracelulares requieren un gran número de células para dar una buena señal en la citometría de flujo. Otros métodos no se pueden realizar después de este procedimiento porque las celdas ya están manchadas y muertas.

Pero los cuatro marcadores celulares del animal pueden ser reemplazados para estudiar otros tipos de células inmunitarias.