Ensayo de citometría de flujo para identificar subconjuntos de células inmunitarias en células mononucleares de sangre periférica

Tome células mononucleares de sangre periférica o PBMC, una población de células mixtas que incluye linfocitos y monocitos.

Agregue un colorante de viabilidad fluorescente para discriminar las células muertas y un cóctel de anticuerpos marcado con fluorescencia para identificar diferentes tipos de células.

Los anticuerpos conjugados con fluorocromo A se unen a marcadores de superficie: CD3 en células T, receptor de células T γδ o TCR en células T γδ y CD56 en células asesinas naturales o NK.

Los anticuerpos conjugados con fluorocromo B se unen a CD4 y CD8 en las células T, CD19 en las células B y CD14 en los monocitos.

Usando citometría de flujo, identifique los subconjuntos de células vivas.

Mientras que las células T CD8⁺ y CD4⁺ son CD3⁺, las células CD4⁺ se encuentran entre las células CD3 positivas simples y las células CD3-CD8 doblemente positivas.

Las células T γδ expresan γδ TCR y CD3 más altas en comparación con las células CD4⁺ y CD8⁺.

Las células B y las células NK son CD3^- pero se identifican por CD19 en las células B y CD56 en las células NK.

Los monocitos se identifican por la expresión de CD14.

Para preparar los PBMC para la tinción, transfiera 100 microlitros de cada muestra a una placa inferior en V de 96 pocillos. Centrifugar la placa a 350 veces g durante tres minutos a temperatura ambiente. Con cuidado, aspire el sobrenadante sin alterar el sedimento celular. A cada pocillo, agregue 100 microlitros de PBS que contengan un colorante fijable vivo / muerto que reaccione con amina libre en las proteínas y vuelva a suspender la mezcla de PBMC con cuidado.

Posteriormente, deje reposar la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente para etiquetar las células muertas. Para cada muestra, prepare 30 microlitros de una mezcla que contenga los siete anticuerpos. En esta etapa, también se pueden agregar anticuerpos titulados contra diferentes moléculas diana y en diferentes fluorocromos. Centrifugar la placa de 96 pocillos a 350 veces g durante tres minutos a temperatura ambiente y aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el sedimento celular.

Agrega el cóctel de anticuerpos a cada pocillo y vuelve a suspender con cuidado sin generar burbujas. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de 30 minutos, agregue 150 microlitros de tampón de tinción a cada pocillo y centrifugue la placa a 350 veces g durante tres minutos a temperatura ambiente. Aspire cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el sedimento celular y vuelva a suspender las células en 200 microlitros de PBS. Las células ahora están listas para el análisis de citometría de flujo.

Para comenzar esta estrategia de activación de dos fluorocromos y siete marcadores, seleccione la puerta de los linfocitos y cree un diagrama de puntos con uno de los dos fluorocromos utilizados en este protocolo en cada eje. Puerta en las células T CD8 positivas, identificadas como células CD3 y CD8 doblemente positivas en la esquina superior derecha del diagrama de puntos. Excluya la población de CD8 tenue, que podría contener células T NK. Puerta en las células T CD4 positivas, identificadas como la población entre las células T CD8 positivas y las poblaciones CD3 positivas simples.

Puerta en células T gamma-delta, identificadas como células CD3 altas. Subdivida las células T gamma-delta en CD8 positivas y CD8 negativas. Puerta en las células NK, identificadas como la población entre las células CD3 positivas y CD3 negativas. Subdivida las células NK en CD8 positivas y CD8 negativas Gate en las células B, identificadas como la población CD3 negativa y CD19 positiva en la esquina inferior derecha del diagrama de puntos.

Seleccione la puerta de monocitos y cree un diagrama de puntos con uno de los dos fluorocromos utilizados en este protocolo en cada eje. Puerta en la población CD3 negativa, CD14 positiva.