El aislamiento, la identificación y purificación de células epiteliales del timo murino
8 de agosto de 2014
Aquí se describe un método eficiente para el aislamiento, identificación y purificación de ratón las células epiteliales del timo (TEC). El protocolo puede ser utilizado para estudios de la función del timo para el desarrollo normal de células T, la disfunción del timo, y la reconstitución de células T.
El objetivo general de este procedimiento es aislar, identificar y purificar las células epiteliales tímicas o la tecnología. Esto se logra primero enzimáticamente, digiriendo y alterando mecánicamente el timo para disociar la tecnología en una suspensión de una sola célula. A continuación, la tecnología puede analizarse mediante citometría de flujo o enriquecerse mediante una estrategia de paneo.
En última instancia, los subconjuntos epiteliales tímicos se pueden purificar mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia. Este método puede ayudar a responder muchas preguntas clave en el campo del desarrollo de células T, como por ejemplo, ¿cómo promueven las células epiteliales tímicas la selección tímica? ¿Qué causa la disfunción tímica en animales envejecidos y cómo podemos lograr la reconstitución de las células T in vitro?
Las principales ventajas de esta técnica son la alta recuperación de células germinales emmicas variables, el enriquecimiento imparcial de las células epiteliales emmicas y la alta pureza que se puede lograr en última instancia mediante la clasificación de células. Para aislar las células del estroma tímico, primero identifique el timo, que se encuentra justo debajo de las costillas y se ve como dos lóbulos blancos delgados que recubren el corazón. Luego, desconecte el tejido conectivo que rodea el timo y use pinzas dentadas curvas para tirar y quitar suavemente los lóbulos tímicos.
Coloque los lóbulos en una placa de seis pocillos que contenga cinco mililitros de medio y recorte la grasa y el tejido conectivo circundantes. A continuación, transfiera los lóbulos recortados a un nuevo pocillo que contenga cinco mililitros de solución enzimática recién preparada y utilice unas tijeras finas para hacer pequeñas incisiones en el tejido. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados.
Después de 20 minutos, pipetee suavemente el tejido hacia arriba y hacia abajo varias veces con una pipeta de cinco mililitros para disociar la suspensión en una sola celda. Recoja la fracción sobrenadante en un tubo de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de tampón rico en albúmina fría en hielo para neutralizar las enzimas. A continuación, añada 2,5 mililitros de solución enzimática al tejido restante.
Incuba la placa durante 15 minutos. Después de eso, agite suavemente el tejido con una jeringa de tres mililitros equipada con una aguja de 18 genes para romper los agregados. A continuación, transfiera el al tubo de recolección.
A continuación, añada 2,5 mililitros de solución enzimática al tejido restante. Incuba la placa durante 15 minutos. Después de la tercera incubación, repita la agitación mecánica con una aguja 20 5G.
Después de incubar el tejido durante los últimos cinco a 10 minutos, transfiera el sobrenadante al tubo de recolección para la centrifugación y el fin de identificar la tecnología recuperada mediante citometría de flujo. Siguiendo los procedimientos estándar de tinción de anticuerpos, ejecute las muestras en un citómetro de flujo multiparamétrico y analice los datos utilizando el software de análisis de fax adecuado para enriquecer aún más la tecnología mediante el método de paneo. En primer lugar, incubar las células con el anticuerpo adecuado para el enriquecimiento. A continuación, agregue la suspensión de celdas a una placa de paneo precodificada y luego agite la placa e incube a temperatura ambiente.
Después de 30 minutos, agite la placa vigorosamente y luego transfiera el sobrenadante a un tubo cónico. Enjuague la placa dos veces con agua fresca, media, acumulando los lavados en el tubo de recolección. Luego, después de girar las células, vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de medio fresco y transfiera la suspensión celular a una nueva placa de paneo, recogiendo las células después de girar e incubar como se acaba de demostrar para purificar aún más la tecnología enriquecida en sus subconjuntos de células tímicas.
Después de marcar con los anticuerpos apropiados, clasifique la tecnología a través de una boquilla de 100 micrómetros mediante clasificación celular activada por fluorescencia, recolectando las células en un 30% de volumen por volumen FBS en medio. En esta estrategia representativa de compuerta para la identificación de la tecnología por citometría de flujo, se puede observar la expresión de epca, pero no de CD 45 por parte de la técnica. Por lo tanto, la tecnología se puede controlar de acuerdo con su expresión ep, camm y CD 45 la tecnología se compone de subconjuntos epiteliales corticales o CEC y medulares o mtech thymic.
Estos subconjuntos se pueden distinguir por el anticuerpo vivo 51, que reconoce la G glutamil aminopeptidasa expresada por ctec y la lectina UEA uno, que se une a mtech tanto ctech como Mtech expresan MHC Clase dos en sus superficies. Aunque mtech se puede clasificar en poblaciones mtech baja y mtech alta, dependiendo de su nivel de expresión de MHC dos, se puede recuperar aproximadamente ocho veces más tech utilizando el protocolo basado en la enzima liasa recién demostrado en comparación con un protocolo con colagenasa y espacio de disco con aproximadamente nueve veces 10 a la quinta, capaz de recuperarse de un solo timo de ratón para disminuir el tiempo de clasificación y aumentar la viabilidad de la células estromales recuperadas. El paneo se puede utilizar, como se acaba de demostrar, para agotar los sitios de los timocitos en comparación con las células de timo preparadas completas.
La proporción de tecnología aumenta de menos del 0,5% a más del 15% en la población de células postenriquecidas. Después del panoramizado, las proporciones de los subconjuntos tecnológicos no se alteran, lo que sugiere que ninguno de los subconjuntos se pierde selectivamente durante el panoramizado. En comparación con la muestra de enriquecimiento de acicalamiento, la tasa de recuperación de la tecnología es de aproximadamente el 85%Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo enriquecer las células germinales temáticas de más de por pánico, así como cómo identificar y purificar más subyentes epiteliales temicos mediante citometría de flujo.
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Información general
Este artículo presenta un método para el aislamiento, identificación y purificación de células epiteliales tímicas (CET) de ratón. El protocolo está diseñado para facilitar estudios sobre la función del timo, el desarrollo de células T y la disfunción tímica.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Biología celular
- Función del timo
Antecedentes
- Las células epiteliales tímicas juegan un papel crucial en el desarrollo de las células T.
- Entender las CET puede proporcionar información sobre los procesos de selección tímica.
- La disfunción tímica está asociada con el envejecimiento y varias enfermedades.
- La reconstitución de las células T es vital para las estrategias terapéuticas.
Propósito del estudio
- Aislar y purificar CET para un análisis detallado.
- Investigar los mecanismos de selección tímica.
- Explorar las causas de la disfunción tímica en el envejecimiento.
Métodos utilizados
- Digestión enzimática y disrupción mecánica del timo.
- Citometría de flujo para el análisis de CET.
- Estrategia de panning para el enriquecimiento de CET.
- Ordenación celular activada por fluorescencia para la purificación de subconjuntos de CET.
Resultados principales
- Aislamiento y purificación exitosa de CET.
- Identificación de subconjuntos clave de CET involucrados en el desarrollo de células T.
- Información sobre los mecanismos de selección tímica.
- Posibles implicaciones para las terapias de reconstitución de células T.
Conclusiones
- El método descrito es efectivo para estudiar CET.
- Los hallazgos contribuyen a la comprensión de la función y disfunción tímica.
- La investigación futura puede basarse en este protocolo para explorar el desarrollo de células T.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Isolating rare stromal populations like thymic epithelial cells enables mechanistic de-risking of T-cell development hypotheses and supports predictive confidence in immunotherapy target validation. This method provides a disease-relevant system for studying thymic selection and dysfunction, directly informing preclinical model design and translational biomarker discovery. By improving recovery and viability of rare cell subsets, it reduces biological ambiguity in early discovery and enhances portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of thymic epithelial cell function in T-cell commitment and selection pathways.
- Operational Value: Provides unbiased enrichment of rare TECs from murine thymus, increasing yield approximately eightfold over collagenase-based methods.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by allowing multiparameter flow cytometry identification of cortical and medullary TEC subsets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified TEC subsets suitable for downstream functional assays like gene expression profiling and Western blot.
- Operational Value: Reduces cell sorting time and minimizes viability loss through thymocyte depletion via panning prior to FACS.
- Operational Value: Enables standardized preparation of single-cell suspensions from thymic stroma for reproducible immunological assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling of thymic dysfunction in aging and immune reconstitution studies.
- Operational Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation by providing purified TECs for in vitro T-cell reconstitution.
- Scientific Value: Enables mechanistic de-risking of targets involved in thymic selection and T-cell development pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology to lead identification continuum by providing validated stromal inputs for immunological target assessment and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of thymic epithelial roles in positive and negative T-cell selection through isolatable, analyzable subsets.
- Screening: Delivers assay-ready, purified TEC populations with enhanced recovery and reduced sorting time for compound or modulator screening.
- Analytics: Enables quantitative multiparameter flow cytometry and molecular profiling (PCR, Western blot) for objective comparison of TEC states.
- Translational Research: Connects to preclinical T-cell reconstitution models by providing purified TECs capable of supporting lymphoid development in vitro.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for isolating rare thymic stromal cells applicable across immunology and immunotherapy discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in T-cell development models by enabling reliable isolation and characterization of rare TEC subsets.
- Operational Value: Improves reproducibility and scalability through enzymatic-mechanical dissociation and panning-based enrichment prior to FACS.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by improving target validation in thymus-dependent immunological pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insights into thymic selection and stromal-immune crosstalk.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymatic tissue dissociation, flow cytometry staining, and fluorescence activated cell sorting.
- Dependent on access to cell culture incubators, centrifuges, flow cytometers, and panning plates coated with appropriate substrates.
- Necessitates standardization of enzyme digestion times and mechanical agitation steps to ensure consistent single-cell suspension quality.
- Requires adaptation considerations when applying to different mouse strains, ages, or disease models affecting thymic cellularity and stromal composition.
- Practical limitations include the rarity of TECs necessitating enrichment steps and the need for careful viability maintenance during prolonged sorting.
