El aislamiento, la identificación y purificación de células epiteliales del timo murino

El objetivo general de este procedimiento es aislar, identificar y purificar las células epiteliales tímicas o la tecnología. Esto se logra primero enzimáticamente, digiriendo y alterando mecánicamente el timo para disociar la tecnología en una suspensión de una sola célula. A continuación, la tecnología puede analizarse mediante citometría de flujo o enriquecerse mediante una estrategia de paneo.

En última instancia, los subconjuntos epiteliales tímicos se pueden purificar mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia. Este método puede ayudar a responder muchas preguntas clave en el campo del desarrollo de células T, como por ejemplo, ¿cómo promueven las células epiteliales tímicas la selección tímica? ¿Qué causa la disfunción tímica en animales envejecidos y cómo podemos lograr la reconstitución de las células T in vitro?

Las principales ventajas de esta técnica son la alta recuperación de células germinales emmicas variables, el enriquecimiento imparcial de las células epiteliales emmicas y la alta pureza que se puede lograr en última instancia mediante la clasificación de células. Para aislar las células del estroma tímico, primero identifique el timo, que se encuentra justo debajo de las costillas y se ve como dos lóbulos blancos delgados que recubren el corazón. Luego, desconecte el tejido conectivo que rodea el timo y use pinzas dentadas curvas para tirar y quitar suavemente los lóbulos tímicos.

Coloque los lóbulos en una placa de seis pocillos que contenga cinco mililitros de medio y recorte la grasa y el tejido conectivo circundantes. A continuación, transfiera los lóbulos recortados a un nuevo pocillo que contenga cinco mililitros de solución enzimática recién preparada y utilice unas tijeras finas para hacer pequeñas incisiones en el tejido. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados.

Después de 20 minutos, pipetee suavemente el tejido hacia arriba y hacia abajo varias veces con una pipeta de cinco mililitros para disociar la suspensión en una sola celda. Recoja la fracción sobrenadante en un tubo de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de tampón rico en albúmina fría en hielo para neutralizar las enzimas. A continuación, añada 2,5 mililitros de solución enzimática al tejido restante.

Incuba la placa durante 15 minutos. Después de eso, agite suavemente el tejido con una jeringa de tres mililitros equipada con una aguja de 18 genes para romper los agregados. A continuación, transfiera el al tubo de recolección.

A continuación, añada 2,5 mililitros de solución enzimática al tejido restante. Incuba la placa durante 15 minutos. Después de la tercera incubación, repita la agitación mecánica con una aguja 20 5G.

Después de incubar el tejido durante los últimos cinco a 10 minutos, transfiera el sobrenadante al tubo de recolección para la centrifugación y el fin de identificar la tecnología recuperada mediante citometría de flujo. Siguiendo los procedimientos estándar de tinción de anticuerpos, ejecute las muestras en un citómetro de flujo multiparamétrico y analice los datos utilizando el software de análisis de fax adecuado para enriquecer aún más la tecnología mediante el método de paneo. En primer lugar, incubar las células con el anticuerpo adecuado para el enriquecimiento. A continuación, agregue la suspensión de celdas a una placa de paneo precodificada y luego agite la placa e incube a temperatura ambiente.

Después de 30 minutos, agite la placa vigorosamente y luego transfiera el sobrenadante a un tubo cónico. Enjuague la placa dos veces con agua fresca, media, acumulando los lavados en el tubo de recolección. Luego, después de girar las células, vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de medio fresco y transfiera la suspensión celular a una nueva placa de paneo, recogiendo las células después de girar e incubar como se acaba de demostrar para purificar aún más la tecnología enriquecida en sus subconjuntos de células tímicas.

Después de marcar con los anticuerpos apropiados, clasifique la tecnología a través de una boquilla de 100 micrómetros mediante clasificación celular activada por fluorescencia, recolectando las células en un 30% de volumen por volumen FBS en medio. En esta estrategia representativa de compuerta para la identificación de la tecnología por citometría de flujo, se puede observar la expresión de epca, pero no de CD 45 por parte de la técnica. Por lo tanto, la tecnología se puede controlar de acuerdo con su expresión ep, camm y CD 45 la tecnología se compone de subconjuntos epiteliales corticales o CEC y medulares o mtech thymic.

Estos subconjuntos se pueden distinguir por el anticuerpo vivo 51, que reconoce la G glutamil aminopeptidasa expresada por ctec y la lectina UEA uno, que se une a mtech tanto ctech como Mtech expresan MHC Clase dos en sus superficies. Aunque mtech se puede clasificar en poblaciones mtech baja y mtech alta, dependiendo de su nivel de expresión de MHC dos, se puede recuperar aproximadamente ocho veces más tech utilizando el protocolo basado en la enzima liasa recién demostrado en comparación con un protocolo con colagenasa y espacio de disco con aproximadamente nueve veces 10 a la quinta, capaz de recuperarse de un solo timo de ratón para disminuir el tiempo de clasificación y aumentar la viabilidad de la células estromales recuperadas. El paneo se puede utilizar, como se acaba de demostrar, para agotar los sitios de los timocitos en comparación con las células de timo preparadas completas.

La proporción de tecnología aumenta de menos del 0,5% a más del 15% en la población de células postenriquecidas. Después del panoramizado, las proporciones de los subconjuntos tecnológicos no se alteran, lo que sugiere que ninguno de los subconjuntos se pierde selectivamente durante el panoramizado. En comparación con la muestra de enriquecimiento de acicalamiento, la tasa de recuperación de la tecnología es de aproximadamente el 85%Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo enriquecer las células germinales temáticas de más de por pánico, así como cómo identificar y purificar más subyentes epiteliales temicos mediante citometría de flujo.