Caracterización histológica de avería Microdevices Brain-implantado y el tejido circundante

El objetivo de este procedimiento es obtener imágenes de la interfaz del tejido cerebral intacto alrededor de los microdispositivos implantados crónicamente en el tejido cerebral de roedores. Esto se logra utilizando primero un elastómero de silicona de celda rápida y un acrílico dental de dos partes para cubrir la craneotomía y formar una tapa de cráneo alrededor del dispositivo implantado en el cerebro. Después de perfundir al animal con el procesamiento de tejido fijador y post-mortem, la parte del dispositivo implantada en el cerebro se separa de la tapa de la cabeza quemando el acrílico dental y cortando la célula rápida.

A continuación, se extrae el cerebro y se corta con un viome para capturar el implante en una sección de tejido. El paso final es preparar el tejido para la obtención de imágenes fluorescentes mediante lavado, etiquetado y luego aclarar la sección de tejido en una solución de aclarado óptico. En última instancia, la microscopía confocal se utiliza para mostrar la respuesta biológica intacta que el implante cerebral penetrante produce en el tejido circundante a escala subcelular.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la explicación, el dispositivo, es que la técnica evita alterar el tejido que rodea y se adhiere al dispositivo implantado para que el tejido de interfaz pueda examinarse intacto. Este método se basa en técnicas avanzadas de inmunohistoquímica y microscopía y da como resultado datos de microscopía confocal que describen en detalle la región que rodea a un dispositivo implantado en el cerebro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neuroprótesis, como el grado en que la muerte celular local, la formación de cicatrices gliales y la reorganización de los vasos sanguíneos realmente afectan la vida útil de los dispositivos de microelectrodos implantados en el cerebro.

Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre la interfaz neuronal crónica de las matrices de microelectrodos implantadas en el cerebro. Las técnicas involucradas en este método también se pueden aplicar a otras áreas de investigación en neurociencia, incluidas las cánulas implantadas o la fibra óptica En una campana extractora, comience el procedimiento retirando cuidadosamente la piel y otros tejidos alrededor de la tapa de cráneo acrílica, usando pinzas y tijeras pequeñas mientras usa los guantes insensibles al calor. Use una plancha de soldar para producir una ventana en el acrílico dentado y exponga un área de sellado rápido subyacente.

El dispositivo debe estar visible en el sello rápido transparente. A continuación, bajo un microscopio quirúrgico, corte el elastómero de silicona con un par de microtijeras curvas. A continuación, retire los pequeños trozos de sellado rápido con pinzas y microtijeras hasta la posición en la que el dispositivo entra en el cerebro.

Continúe cortando a lo largo de la superficie de la craneotomía para separar los componentes del dispositivo que se adhieren al polisilicio y al cráneo de los componentes implantados en el cerebro. Tenga cuidado al cortar los componentes expuestos del dispositivo. Evite empujar o arrastrar los implantes en el tejido fijado.

Luego, retire el hueso alrededor de la tapa de la cabeza con cuidado usando las shes crudas después de eso. Use una espátula para separar el cerebro con el dispositivo implantado del cráneo. Ahora coloque el cerebro en una placa de Petri de vidrio llena de HBHS.

Utilice el bloqueo cerebral y las hojas de afeitar para seccionar el cerebro y crear un plano que coincida estrechamente con el ángulo de los dispositivos implantados. Después de eso, presione dos hojas de afeitar a través del tejido cerebral exponiendo la superficie plana que se montará en el Vibram. A continuación, coloca un poco de hielo debajo de la plataforma Vibram.

A continuación, seque brevemente la superficie del pañuelo con una toalla de papel. Después de eso, oriente la muestra de tal manera que la dimensión más ancha sea paralela a la dirección del movimiento de la hoja de tono de vibración para ayudar a evitar que la hoja pueda derribar el tejido de inmediato. Después de que el pegamento fije un PBS frío a la placa de vibrato alrededor del tejido.

Ahora corte las rodajas de tejido entre 250 y 500 micras utilizando la tasa de vibración máxima y una tasa de progresión lenta de la hoja con un ángulo de hoja de 10 grados con respecto a la horizontal. Luego, recoja las rodajas con cuidado con un cepillo y una espátula y guarde un HBHS en una placa de 24 pocillos a cuatro grados centígrados mientras recolecta las rebanadas, mantenga un registro del grosor y la ubicación de cada rebanada a medida que se retiran a la placa de 24 pocillos. Una vez que el dispositivo Insitu esté visible, recoja una rebanada de tejido de unas 500 micras de grosor.

Con el fin de capturar el dispositivo en una sola sección de tejido para recolectar una sección de tejido más delgada, se pueden recolectar cuidadosamente cortes de 100 micras para acercarse lo más posible al dispositivo. En ese momento, se puede recoger una rebanada de menos de 500 micras de grosor con el dispositivo en su interior. Comience el procesamiento de pañuelos lavando las rodajas tres veces a los cinco minutos por lavado en HBHS.

Luego incubarlos en hidruro de boro de sodio durante 15 minutos. Cada lado de la rebanada, voltee lentamente la rebanada con un pincel pequeño y evite tocar cualquier área alrededor del dispositivo implantado. También se puede usar una microcuchara recubierta de acero inoxidable o teflón junto con el pincel pequeño.

Ahora lave las rodajas tres veces a cinco minutos por lavado en solución de lavado a temperatura ambiente. Bloquéelos en solución de lavado durante dos horas a temperatura ambiente mientras voltea las rodajas. Después de una hora después de dos horas, incubar las rodajas en anticuerpo primario durante aproximadamente 48 horas a cuatro grados centígrados.

A continuación, realice seis lavados rápidos de tres minutos con solución de lavado. A continuación, realice seis lavados de una hora en solución de lavado. Después de eso, incubarlos en un anticuerpo secundario durante aproximadamente 48 horas a cuatro grados centígrados.

Nuevamente, realice seis lavados rápidos de tres minutos seguidos de seis lavados de una hora en solución de lavado. Posteriormente, retire la solución de lavado y agregue la solución de limpieza de incrustaciones U2 a base de glicerol. Cubra el plato con papel de aluminio y guárdelo a cuatro grados centígrados.

Deje que las rodajas gruesas se aclaren aproximadamente una semana o las secciones de tejido muy gruesas durante dos o tres semanas de cuatro grados centígrados. Después de la holgura, monte las secciones de tejido en portaobjetos utilizando una solución de limpieza como medio de montaje. Selle todos los portaobjetos con esmalte de uñas transparente y guárdelos a cuatro grados centígrados lejos de la luz, utilizando objetivos de microscopio de mayor distancia de trabajo.

Comience a obtener imágenes con un microscopio confocal de barrido láser o un microscopio de dos fotones. Demostraremos con un software de envío XS L SM seven 10 Carl Xi y una etapa de traducción XY controlada por ordenador para obtener una imagen panorámica en 3D alrededor de un implante para corregir el índice de refracción de la solución de aclarado. En esta demostración, introducimos un valor de índice de refracción de 1,4 en el software del microscopio Leica Zen para la solución de limpieza U2.

Esta configuración ajusta sutilmente los intervalos de pasos Z para tener en cuenta la falta de coincidencia del índice de refracción en el tejido cerca del dispositivo. Evalúe aproximadamente la ventana del eje Z adecuada y la configuración de recopilación de datos en la dimensión zdi para cada canal fluorescente utilizando una potencia láser baja, aproximadamente del 0,5 al 5% y tamaños de paso Z grandes. A continuación, utilice el software de panorama Zen para establecer el objetivo en el centro XY del panorama final y determinar el número de posiciones de recolección necesarias para los ejes x e y.

Para cubrir la región de interés, vuelva a evaluar y finalice la ventana de recopilación del eje Z comprobando rápidamente el primer y el último fotograma de la pila. A continuación, configure manualmente la sensibilidad del detector y la potencia del láser para que aumenten adecuadamente con el aumento de la profundidad. Por lo general, el objetivo es mantener aproximadamente la misma intensidad de imagen, independientemente de la profundidad de la imagen en el corte de tejido, y también evitar un alto ruido de fondo.

Recoja cada serie de datos de imágenes fluorescentes si es necesario para evitar señales superpuestas, ejecute líneas láser secuencialmente. Cambie la configuración del software para recopilar los datos o los datos de transmitancia y utilice un láser de longitud de onda más larga y penetrante, como 6 a 33 nanómetros para capturar estos canales. A continuación, determine la potencia láser adecuada y detecte una sensibilidad para la recogida de reflectancia y transmitancia y repita la misma serie de recogida alrededor del dispositivo implantado.

Por último, exporte los datos para su posterior procesamiento, cuantificación y análisis. La obtención de imágenes a través de cualquiera de los lados del portaobjetos puede permitirle evaluar la interfaz alrededor de un dispositivo, como se muestra aquí, donde la microglía a lo largo del respaldo de silicio de un MEA es visible desde un lado y la microglía a lo largo de los sitios y trazas de los electrodos son visibles en el otro lado. Una vez que se pueden obtener imágenes del tejido montado utilizando una etapa de traducción XY, se pueden generar vistas generales de las etiquetas fluorescentes en todo el corte de tejido con la resolución deseada.

Aquí, los núcleos celulares se tiñen con los ganchos 3, 3, 3, 4, 2 y los monocitos microglia marcados con 3, 2, 9. El anti IBA uno fue fotografiado simultáneamente en canales separados. También se recogieron la luz de transmisión y la reflectancia, mostrando la ubicación del implante de cuatro semanas con respecto a los ganchos y los datos de IVA uno, la superposición de todos los canales, pero aquí se muestra la transmisión.

El examen detallado de la interfaz de tejido morfológicamente preservado alrededor de los microdispositivos implantados se puede recopilar con gran aumento para el análisis de la respuesta tisular local, la reflectancia y la transmitancia permiten la localización del dispositivo, mientras que las etiquetas químicas o de anticuerpos fluorescentes permiten obtener imágenes detalladas de los componentes del tejido a lo largo de la interfaz de tejido intacta. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe tomarse su tiempo con la separación cuidadosa de los dispositivos implantados a través de la tapa de la cabeza y planificar que este paso tome más de 30 minutos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo recolectar y procesar cortes de cerebro que contienen dispositivos implantados.

También debe ser capaz de etiquetar y recopilar datos histológicos que describan la neurobiología que rodea a estos dispositivos.