Jeringa inyectable malla electrónica para electrofisiología roedor crónico estable

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como cómo se manifiestan los procesos de envejecimiento en el cerebro, cómo se desarrolla el cerebro y cómo se originan y progresan las enfermedades cerebrales. La principal ventaja de esta técnica es que la electrónica de malla no provoca una respuesta inmunitaria crónica en la gliosis una vez implantada en el cerebro y permite una integración perfecta con el tejido neural circundante. Tao Zhou, estudiante graduado en el Grupo Lieber, y Jung Min Lee, postdoctorado en el Grupo Lieber, demostrarán el procedimiento.

Para comenzar el procedimiento, cargue una oblea de silicio limpia en un evaporador térmico y evapore 100 nanómetros de níquel. A continuación, centrifuga la capa fotorresistente negativa SU-8 2000.5 sobre la oblea a 400 revoluciones por minuto para un espesor aproximado de SU-8 de 400 a 500 nanómetros. Cargue la oblea en un alineador de máscara para exponer el SU-8 con la máscara de fotolitografía correspondiente a la capa SU-8 de malla inferior.

Exponga a una dosis de 100 milijulios por centímetro cuadrado. Ellos, sumergen la bandeja de la oblea en el revelador SU-8. Agite suavemente la solución durante dos minutos, hasta que el patrón de malla en el SU-8 se haya desarrollado por completo.

Luego, enjuague la oblea en una bandeja de alcohol isopropílico durante un minuto y séquela con secador. Hornee la oblea en una placa caliente a 180 grados centígrados durante una hora. A continuación, centrifugar la capa LOR 3A sobre la oblea a 4.000 revoluciones por minuto para obtener un grosor aproximado de 300 nanómetros.

Spin coat S1805 fotorresistente positivo a 4.000 revoluciones por minuto para un espesor aproximado de 500 nanómetros. Posteriormente, cargue la oblea en un alineador de máscara para exponer el S1805 con máscara de fotolitografía dos correspondientes a las interconexiones metálicas y las almohadillas de entrada, salida. Expuesto a dosis de línea H a 40 milijulios por centímetro cuadrado, luego sumerja la oblea en una bandeja de revelador fotorresistente CD-26.

Agite suavemente la solución durante un minuto hasta que el patrón de interconexiones metálicas se haya desarrollado por completo. Enjuague la oblea en una bandeja con agua desionizada durante un minuto y séquela con un soplo. A continuación, evapora térmicamente tres nanómetros de cromo seguidos de 80 nanómetros de oro.

Sumerja la oblea en un vaso de precipitados plano de removedor PG durante aproximadamente tres horas, hasta que el metal se haya socavado por completo, dejando el metal solo en las regiones de interconexión y almohadilla de entrada y salida deseadas de la electrónica de malla. Repita el recubrimiento de centrifugado, la litografía, la evaporación y despegue para dejar tres nanómetros de cromo y 50 nanómetros de platino en las regiones de los electrodos. Posteriormente, repita el recubrimiento de espín y la fotolitografía de SU-8 para definir la capa superior de malla de SU-8.

Trate la oblea con plasma de oxígeno a 50 vatios durante un minuto. Luego, sumerja la oblea en un grabado de níquel en solución durante aproximadamente tres horas, hasta que la electrónica de malla se haya liberado completamente de la oblea de silicio. Utilice una pipeta pasteur para transferir las sondas electrónicas de malla liberadas del grabado de níquel a un vaso de precipitados de 100 mililitros de agua desionizada.

Luego, transfiera la electrónica de malla a un vaso de precipitados nuevo con agua desionizada al menos tres veces para garantizar el enjuague. Para cargar la electrónica de malla en una aguja, inserte una aguja capilar de vidrio en el vaso de precipitados de 100 mililitros de PBS que contiene la electrónica de malla. Coloque el extremo de la aguja cerca de las almohadillas de entrada y salida de una sonda electrónica de malla y retraiga manualmente la jeringa para introducir una sonda electrónica de malla en la aguja.

Empuje y tire del émbolo de la jeringa mientras aún está sumergido en solución salina para ajustar la posición de la electrónica de malla dentro de la aguja. Para inyectar componentes electrónicos de malla en el cerebro de un ratón, use un taladro dental y un marco estereotáxico para abrir una craneotomía en las coordenadas deseadas en el cráneo. Abra una segunda craneotomía lejos del sitio de inyección para la inserción de un tornillo o alambre de acero inoxidable.

Luego, fije un sustrato de sujeción al cráneo con cemento dental. Un corte de aproximadamente un milímetro de ancho en el sustrato mejora la fiabilidad del paso de plegado posterior en el procedimiento. A continuación, monte el soporte de pipeta con la aguja que contiene la electrónica de malla en el marco estereotáxico mediante una abrazadera de extremo en ángulo recto.

Conecte la salida lateral del soporte de pipeta a una jeringa de cinco mililitros sujeta a una bomba de jeringa con un tubo capilar de 0,5 a un metro de largo. A continuación, utilice el marco estereotáxico para colocar la punta de la aguja en el lugar de inicio deseado dentro del cerebro. Coloque la cámara para mostrar la parte superior de la sonda electrónica de malla dentro de la aguja de vidrio.

Inicie el flujo ajustando la bomba de jeringa a una velocidad baja y presionando inicio. Aumente lentamente el caudal si la sonda electrónica de malla no se mueve dentro de la aguja. A medida que la sonda electrónica de malla comienza a moverse dentro de la aguja, use el marco estereotáxico para retraer la aguja a la misma velocidad con la que se inyecta la sonda electrónica de malla utilizando la posición original marcada de la electrónica de malla como guía.

Continúe fluyendo solución salina y retrayendo la aguja hasta que la aguja haya salido del cráneo. Luego, detenga el flujo de la bomba de jeringa. En este procedimiento, use el marco estereotáxico para guiar cuidadosamente la aguja hacia el sustrato de sujeción de cable plano y flexible a través del espacio, haciendo fluir la solución con la bomba de jeringa para generar una holgura en las interconexiones electrónicas de malla.

Una vez que la aguja esté por encima del sustrato de sujeción y a través del espacio, reanude el flujo a un ritmo rápido para inyectar las almohadillas de entrada y salida de la electrónica de malla en el sustrato de sujeción. Con unas pinzas y una pipeta de agua desionizada, doble las almohadillas de entrada y salida en un ángulo de 90 grados lo más cerca posible de la primera almohadilla de entrada y salida. Una vez que las almohadillas de entrada y salida estén alineadas y dobladas y en un ángulo de 90 grados con respecto al vástago de malla, séquelas en su lugar con aire comprimido que fluya suavemente.

Corte el sustrato de sujeción en un borde estrecho de aproximadamente 0,5 a un milímetro del borde de las almohadillas de entrada y salida. Además, corte las partes extrañas del sustrato de sujeción que dificultarán la inserción en el conector zif de 32 canales montado en PCB. Luego, inserte las almohadillas de entrada y salida en el conector zif de la PCB y cierre el pestillo.

Utilice la electrónica de medición para medir la impedancia entre los canales y el tornillo de tierra para confirmar la interfaz. Si los valores de impedancia son demasiado altos, desenganche el conector zif, ajuste la inserción y vuelva a probar hasta que se confirme que la conexión se ha realizado correctamente. Posteriormente, cubra el conector zif y la electrónica de malla expuesta se interconecta con el cemento dental para su protección.

Voltee la PCB en el espacio en el sustrato y fije la PCB con cemento en el cráneo del ratón. Para grabaciones que se mueven libremente, suelte el mouse del retenedor después de insertar la PCB del preamplificador y conectar a tierra el tornillo de referencia. Registre durante el período de tiempo deseado utilizando el sistema de adquisición de datos mientras el mouse se comporta libremente.

Aquí se muestran los mapas de calor de campo local representativos de las sondas electrónicas de malla de 32 canales inyectadas en el hipocampo y la corteza somatosensorial del ratón. Los datos se registraron mientras el ratón exploraba libremente su jaula a los dos meses y cuatro meses después de la inyección. La amplitud de potencial de campo local está codificada por colores de acuerdo con la barra de color de la derecha.

Las trazas de filtro de paso alto, negras, que muestran actividad de picos, se superponen en el espectrograma para cada uno de los 32 canales. Aquí están los picos aislados después de ordenar los datos trazados. Se detectó actividad de aumento de una sola unidad en 26 de los 32 canales, tanto dos meses después de la inyección como cuatro meses después de la inyección.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar probar la interfaz de E/S para confirmar que la conexión eléctrica se ha realizado correctamente con la sonda electrónica de malla. La impedancia de medición ayuda a solucionar el origen de cualquier problema y es fundamental para identificar problemas con la interfaz o la fabricación. Siguiendo este procedimiento, se puede realizar la histología para estudiar el entorno celular alrededor de cada electrodo registrado.

A diferencia de las sondas cerebrales rígidas convencionales, la electrónica de malla se puede dejar en el tejido durante la histología, lo que permite correlacionar con precisión los datos electrofisiológicos con el análisis inmunohistoquímico.