Name: Jeringa inyectable malla electrónica para electrofisiología roedor crónico estable (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprende a fabricar e implantar electrónica de malla para registrar neuronas de forma estable en cerebro de roedor. Este método permite estudios electrofisiológicos crónicos sin respuesta inmune.

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C.M.L. reconoce apoyo de esta obra por la oficina de investigación científica de la fuerza aérea (FA9550-14-1-0136) y un premio acelerador ingeniería y Ciencias de física de la Universidad de Harvard () Premio pionero nacional institutos de salud del Director 1DP1EB025835-01). T.G.S. agradece apoyo por el Departamento de defensa (DoD) a través del programa nacional de defensa de ciencia e Ingeniería Graduate Fellowship (NDSEG). G.H. reconoce apoyo de beca de la American Heart Association (16POST27250219) y el camino al premio independencia (padre K99/R00) del Instituto Nacional sobre el envejecimiento de los institutos nacionales de salud. Este trabajo fue realizado en parte en el centro de la Universidad de Harvard para sistemas a nanoescala (CNS), un miembro de la nacional nanotecnología coordinada infraestructura red (NNCI), que es apoyado por la National Science Foundation bajo NSF CEC Award no. 1541959.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Todos los pasos en la fabricación y el uso de la malla electrónica son importantes, pero algunos son particularmente importantes. Antes de soltar la malla electrónica de su oblea, es esencial para la oxidación de la superficie para hacer las mallas fácilmente suspendidas en solución acuosa (paso 1.6.1). Si se omite este paso, las mallas generalmente flotan en la superficie del agua, que dificulta la carga en las agujas, y si pueden ser cargados, a menudo pegarse a las paredes de las agujas de vidrio, que requieren grandes volúmenes (> 100 μL) para la inyección. Falta para oxidar la superficie antes de lanzamiento, por lo tanto, normalmente significa que no se puede utilizar las mallas y la fabricación deben volver a realizarse desde el principio. Otro paso fundamental es doblar la malla electrónica "tallo" a ~ 90° durante la entrada-salida interfaz (paso 4.3). Si el ángulo es menor que 90°, entonces todos 32 cojines de I/O no cabrán en el conector ZIF; Algunos tendrán que cortar el extremo para permitir la inserción, reducción del número de electrodos conectados. El proceso también debe hacer suavemente para evitar que se rompa el tallo.
El diseño de la malla electrónica puede modificar para requisitos particulares para diversas aplicaciones modificando los photomasks y usando el mismo procedimiento de fabricación que se indica en la figura 2. Por ejemplo, mientras que la malla electrónica las puntas de prueba utilizados para grabar los datos en la figura 9 fueron diseñados para tener 32 electrodos de grabación abarcan el ratón hipocampo y la corteza somatosensorial primaria, puede ser la colocación de electrodos dentro de la malla ultraflexible seleccionado a prácticamente cualquier región o regiones del cerebro, o más electrodos para la estimulación pueden ser incorporado27. El mismo procedimiento de fabricación y estructura de la malla básica se mantienen, pero la colocación del electrodo y el diseño se ajustan a las necesidades del estudio. Los investigadores deben tenga cuidado, sin embargo y siempre prueba que diseños modificados se pueden inyectar fácilmente a través de las agujas previstas. Pequeños cambios en la flexión mecánica de la malla electrónica puede tener efectos sustanciales sobre la inyectabilidad. Un ejemplo de ello es que un ángulo de 45° entre cintas de SU-8 transversales y longitudinales produce una sonda electrónica de malla que suelen inyectarse pero uno que cae y se obstruyen con agujas21produce un ángulo de 90°.
Medición de la impedancia de los electrodos de registro es útil para solucionar problemas. Un electrodo de Pt de 20 μm de diámetro circular debe tener un magnitud de impedancia cerca de 1 MΩ cuando se mide a una frecuencia de 1 kHz en vivo o en 1 x PBS29. Una impedancia significativamente más grande que esto implica que el electrodo no es expuesto, como puede ocurrir si se contamina con photoresist residuo o no eléctricamente conectado. Este último puede ocurrir si, por ejemplo, hay polvo en la máscara de la foto durante la PL que interconecta resultados en una desconexión en la UA, o si uno de los botones de I/O de malla no es contactado por los pines del conector ZIF en interfaces de I/O. Una magnitud de la impedancia aproximadamente la mitad del valor esperado indica que el canal puede estar en corto circuito a la adyacente, creando un circuito de dos impedancias de electrodos en paralelo. Los valores de la impedancia medida actúan como guía durante la solución de problemas; combinado con microscopía óptica de las sondas de electrónica de red, la fuente del problema puede generalmente ser identificada y corregida por consiguiente en la siguiente fabricación ejecutar o intento de interconexión de I/O.
El uso de la jeringa inyectable malla electrónica para estudios agudos se limita en que actividad spiking unitarios generalmente no se observa hasta 1 semana post inyección27, aunque trabajos recientes (inédito) muestran que este problema es fácilmente vencido. Determinantes del tiempo requerido para ver actividad de clavar la malla de diseño, el volumen de líquido inyectado en el cerebro junto con malla electrónica y el diámetro de la aguja utilizada para la inyección, como éstos afectan el grado de daño de tejido durante el inyección y la tasa de curación. Volúmenes de inyección grandes pueden ser necesarios si la malla electrónica no se trata con plasma de oxígeno antes de la liberación en Ni grabador; es decir, si la malla no es hidrofílica, puede adherirse a la aguja de vidrio. En ocasiones, las mallas tienen defectos que llevan a la flexión mecánica que los hacen difíciles de inyectar. Durante la carga de la malla electrónica, es importante comprobar que mallas se desplazan fácilmente y sin problemas dentro de la aguja (como se muestra en el Video complementario 1). Si no es así, puede usarse una sonda electrónica de malla diferentes. Con los volúmenes de inyección ideal de 10-50 μL por 4 mm de longitud de malla inyectado se logrará mejores resultados para la perfecta interconexión neuronal. Los resultados más recientes con fina malla electrónica sondas inyección o menor diámetro capilar las agujas (tan pequeñas como 150 μm de diámetro interior, diámetro exterior de 250 μm) muestran que clavar la unidad solo puede ser observada desde poco después de la inyección (medidas agudas) a través del tiempo. Archivos de diseño de máscara para estas estructuras de malla más finas están disponibles por solicitud o desde la Web de recursos, meshelectronics.org. Se estima el rendimiento global de nuestros vivo malla inyección procedimientos utilizando agujas de (diámetro exterior 650 μm) de diámetro interno de μm 400 a 70%, aunque el rendimiento es más cercano a 80-90% de nuestros trabajos más recientes con diámetro interior de 150 μm (250 μm de diámetro exterior ) agujas. Las razones más comunes para el fracaso son (1) que la malla no inyectar suavemente, dando por resultado edema cerebral desde los volúmenes de inyección inesperadamente grande en el cerebro, (2) malla roturas durante la manipulación manual requerida en la entrada-salida interfaz de procedimiento y (3) el sangrar de dañar un vaso sanguíneo durante la inyección. Dañar un vaso sanguíneo durante la inyección es raro (la causa de menos del 10% de fracasos) y podría reducirse aún más mediante cirugía guiada por imágenes. Además tenemos en cuenta que el daño de los vasos sanguíneos es una limitación común de todos los procedimientos que implica la penetración del tejido del cerebro, incluyendo la inyección de partículas virales para la transfección, implantación de sondas cerebro rígido y la inyección de la malla electrónica.
Malla electrónica son capaces de estable grabar de y seguimiento de las mismas neuronas individuales en menos meses a año plazos y no evocar casi ninguna respuesta inmune crónica, como se muestra en la figura 9 y figura 10, respectivamente. Esto representa una ventaja significativa en comparación con electrodos de profundidad de Convención, que comúnmente sufren de disminución de las amplitudes de pico, señales inestables e inflamación crónica en el transcurso de grabación experimentos14, a largo plazo 15. Adicionalmente, la malla electrónica tienen la ventaja que puede dejar en el tejido durante el corte histológico, coloración, y la proyección de imagen, en contraste con las sondas convencionales, que son demasiado rígidas y por lo tanto deben ser removida antes de histología Análisis. Por lo tanto, malla electrónica permite la capacidad única de usar el análisis de immunohistochemical para estudiar precisamente el entorno celular que rodea cada sitio de la grabación.
El protocolo presentado aquí se abre para arriba emocionantes nuevas oportunidades en la neurociencia. El método mínimamente invasivo y la integración de la electrónica de malla con tejido cerebral reduce al mínimo la interrupción de circuitos neuronales y evita respuesta inmune crónica, que podría beneficiar a casi todos los tipos de experimentos de grabación neuronal crónica. La capacidad de la malla electrónica para registrar y rastrear las mismas neuronas solo por largos períodos de tiempo sobre todo será de interés para los investigadores buscando correlacionar actividad spiking milisegundo-escala con procesos de meses a años de duración como el envejecimiento, la patogenia de la enfermedad cerebral, o cerebro desarrollo16,18. Además, existen importantes oportunidades para ampliar y personalizar este protocolo, como la adición de una electrónica activa al PCB cabeza-escenario para implementar la funcionalidad como digital multiplexado8,35, inalámbrico comunicación35,36,37y35, conjuntamente inyectar las células madre o polímeros con la malla electrónica ayuda en tejido regeneración18,38, de procesamiento de señales 39e incorporando nanocable transistores efecto de campo (NW-FETs) en malla electrónica para muy localizada y cerebro multifuncional sondas24,29,40,41 ,42.

El desarrollo de herramientas capaces de cartografiar el cerebro con una resolución de la solo-neurona es de importancia central a la neurociencia y Neurología. Tecnologías no invasivas estudios neuronales tales como electroencefalografía (EEG) y magnetoencefalografía (MEG) la proyección de imagen de resonancia magnética funcional (fMRI) han demostrado ser valiosos para correlacionar actividad cerebral con el comportamiento de los seres humanos1, 2, pero falta la resolución espacio-temporal necesaria para estudiar la estructura y dinámica de redes neuronales en sus fundamental micrómetro y milisegundo escalas, respectivamente3,4. Cierta electrocorticography (ECoG) sondas y métodos de proyección de imagen ópticos con colorantes sensibles a la tensión han logrado en la grabación de una sola unidad spiking actividad en vivo5,6, pero son generalmente eficaces sólo cerca de la superficie del cerebro, limita la aplicabilidad a los estudios de regiones superficiales del cerebro. Por el contrario, sondeos eléctricos implantables pueden medir solo-neurona electrofisiología libremente pasar animales de prácticamente cualquier región del cerebro sin necesidad de etiquetado fluorescente, haciendo imprescindible a nivel de sistemas de neurociencia, sobre todo como técnicas de microfabricación de la industria de semiconductores han llevado cantidad de canales en los cientos y miles3,7,8,9. En virtud de estas capacidades, sondeos eléctricos implantables han hecho muchas contribuciones importantes a la neurociencia y Neurología, incluyendo estudios fundamentales de procesamiento en el sistema visual10, el tratamiento neurológico de la información trastornos como la enfermedad de Parkinson11y la demostración de las interfaces cerebro-máquina (IMC) para prótesis avanzada12,13.
Sin embargo, la inestabilidad a largo plazo que se manifiesta como disminución de las amplitudes de pico y señales inestables en escalas de tiempo de semanas a meses14,15 ha limitado la aplicabilidad de sondas implantables para el estudio de relativamente a corto plazo fenómenos, dejando cuestiones como el desarrollo y el envejecimiento del cerebro en gran medida sin respuesta. Las limitaciones en la inestabilidad a largo plazo son el resultado de un desajuste entre las sondas convencionales y tejido cerebral en tamaño, mecánica y topología14,15,16,17,18. En términos de tamaño, mientras que las sinapsis neuronales y Somas son aproximadamente de decenas de nanómetros a decenas de micrómetros en diámetro19, respectivamente, las puntas de prueba tradicionales son a menudo significativamente mayores, en el caso de arreglos de microelectrodos de silicio > 4 veces el tamaño de una sola neurona cuerpo celular7,8. El relativamente gran tamaño de estas puntas de prueba puede afectar la estructura y Conectividad del denso tejido neural, así contribuyendo a la respuesta inmune crónica y perturbando los circuitos neuronales que están estudiando. En cuanto a propiedades mecánicas, las puntas de prueba tradicionales son drásticamente más rígidos que el tejido neural muy suave en el que se implantan; incluso «flexible» de 10 – 20 μm espesor láminas de poliimida son al menos 100.000 veces más rígido que el cerebro tejido20,21. Este desajuste en la rigidez de flexión hace esquileo relativo movimiento entre la sonda y el cerebro tejido, llevando a poco fiables de una sola unidad seguimiento durante grabaciones extendidas e induciendo crónica gliosis en el sitio de implantación. Por último, la estructura topológica de las sondas convencionales cerebro excluye necesariamente un volumen sólido del tejido. Tal desajuste en topología interrumpe la conectividad de los circuitos neuronales, impide la distribución interpenetrada (3D) tridimensional natural de las neuronas, células gliales y vasos sanguíneos dentro del tejido de cerebro22y dificulta el transporte 3D de señalización de moléculas23. Juntos, estos defectos de las sondas convencionales han hecho están destituidos de la compatibilidad a largo plazo para aplicaciones clínicas y los estudios de Neurociencia longitudinal en el plano de la solo-neurona.
Para superar estas deficiencias, se intentó difuminar la línea entre los sistemas neuronales y electrónicas mediante el desarrollo de un nuevo paradigma de "tejido-como" sondas neuronales denominado malla electrónica16,21,24. Malla electrónica aborda los problemas que arriba en tamaño, mecánica y topología incorporando características (1) estructurales de la misma nanómetro a escala de tamaño micrométrico de tejido neural, (2) mecánicas similares a las de tejido cerebral y (3) 3D topología de macroporoso que es > 90% espacio abierto y así acomoda la interpenetración de las neuronas y la difusión de moléculas a través del ambiente extracelular. Malla electrónica sondas pueden entregarse precisamente a las regiones específicas del cerebro a través de una jeringa y una aguja, que causa mínimo daño agudo al implantar incluso en regiones de cerebro profundo21,25. Axones y soma neuronal se ha demostrado que se interpenetran la estructura de punta de prueba electrónica abierta con malla 3D dentro de semanas después de la inyección, creando una interfaz transparente, libre de gliosis entre grabación electrónica y alrededor del tejido de cerebro21 , 26 , 27. estas características únicas han permitido malla electrónica sondas rastrear estable actividad clavaba de las mismas neuronas individuales en al menos un año de plazo27. Por otra parte, la fabricación de la electrónica de malla basada en Fotolitografía (PL) proporciona alta escalabilidad del número de electrodos que pueden ser incorporados, con canal demostrado cuenta hasta 128 electrodos por sonda mediante litografía simple mascarilla contacto 28 y un diseño de (E/S) de entrada/salida de plug-and-play que permite la rápida conexión eléctrica electrónica periférica sin equipo especializado29.
Una amplia gama de estudios puede beneficiarse incorporando malla electrónica en protocolos de medición. Mayoría de grabación intracortical los experimentos podría beneficiarse del procedimiento de implantación mínimamente invasiva malla electrónica vía la inyección de la jeringa, la respuesta inmune drásticamente reducida después de la implantación, y la capacidad de dejar de malla electrónica en la tejido durante la histología subsecuente y el immunostaining para el análisis preciso del ambiente biológico alrededor de cada sitio de grabación. Experimentos de grabación crónica en particular serán obtener el valor de la capacidad única de la malla electrónica para seguimiento de gran número de neuronas individuales por meses o años. Esta capacidad crea oportunidades de estudios con la resolución de la solo-neurona que fueron previamente impráctico, tales como estudio longitudinal de envejecimiento de circuitos neuronales, las investigaciones del cerebro en desarrollo y consultas en la patogenesia de encefalopatías transmisibles16.
En este protocolo, describimos todos los pasos de la llave en un experimento de grabación neuronal de ratón típico usando jeringa inyectable malla electrónica (véase figura 1). Pasos descritos incluyen la fabricación de la malla electrónica en un posible proceso de PL estándar en muchas universidades, cargar malla electrónica en agujas capilares estándar, inyección estereotáctica de malla electrónica en vivo, respecto de la interfaces estándar de instrumentación, las sesiones de grabación restringida o libremente móvil y secciones histológicas del tejido de cerebro que contienen malla electrónica del acoplamiento I/O. Algunos investigadores usando malla electrónica sólo para estudios de histología no requieran interfaces eléctricos y de grabación, en cuyo caso pueden omitir estos pasos. Después de familiarizarse con este protocolo, los investigadores deben tener todos los conocimientos necesarios para utilizar malla electrónica en sus propios experimentos.

<table><tbody><tr><td>Marco estereotáxico motorizado</td><td>World Precision Instruments</td><td>MTM-3</td><td>Para cirugía estereotáxica</td></tr><tr><td>de ratón Controlador de grabación de 512 canales</td><td>Intan Technologies</td><td>C3004</td><td>Un componente del sistema de grabación neuronal</td></tr><tr><td>RHD2132 placa amplificadora</td><td>Intan Technologies</td><td>C3314</td><td>Un componente del sistema de grabación neuronal</td></tr><tr><td>RHD2000 cable</td> <td>de interfaz SPI ultra delgado de 3 piesIntan Technologies</td><td>C3213</td><td>Un componente del sistema de grabación neuronal</td></tr><tr><td>Mouse restrainer</td><td>Braintree Scientific</td><td>TV-150&nbsp; Estándar STD</td> de <td>1,25 pulgadas de diámetro interior; se utiliza para sujetar el ratón durante las sesiones de grabación restringidas.</td></tr><tr><td>Obleas Si</td><td>Nova Electronic Materials</td><td></td><td>3" P < 100> 0,001-005 ohmios-cm 356-406 y mu; m Obleas de Si SSP < grado grueso/> Prime Grade con 2 Semi-Std. Pisos & 6.000 A&deg; &plusmn; 5% de óxido térmico húmedo en ambos lados.</td></tr><tr><td>Fotomáscaras (cromo sobre vidrio sódico-cálcico)</td><td>Advance Reproductions</td><td></td><td>Advance Reproductions y otros proveedores fabrican fotomascarillas a partir de archivos de diseño proporcionados. Nuestros archivos de diseño de fotomascarillas están disponibles a pedido o en el sitio web de recursos, meshelectronics.org. Alternativamente, algunas salas limpias universitarias tienen escritores de máscaras para hacer fotomáscaras en el lugar.</td></tr><tr><td>Software AutoCAD</td><td>Autodesk Inc.</td><td></td><td>Software de diseño para dibujar fotomáscaras. Una alternativa gratuita es LayoutEditor. Nuestros archivos de diseño de fotomascarillas están disponibles a pedido o en el sitio web de recursos, meshelectronics.org.</td></tr><tr><td>Evaporador térmico</td><td>Sharon Vacuum</td><td></td><td>Se utiliza para evaporar Ni, Cr y Au en componentes electrónicos de malla durante la fabricación. Muchas salas limpias universitarias cuentan con esta herramienta u otra similar.</td></tr><tr><td>SU-8 2000.5 fotorresistencia negativa</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>Fotorresistencia negativa utilizada para definir las capas pasivantes inferior y superior de la electrónica de malla.</td></tr><tr><td>Alineador de mascarilla MA6</td><td>Karl Suss Microtec AG</td><td></td><td>Se utiliza para alinear cada fotomáscara con el patrón de la oblea y exponer la oblea a la luz UV. La mayoría de las salas limpias de las universidades tienen esta herramienta u otra similar.</td></tr><tr><td>Desarrollador de SU-8</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>Se utiliza para revelar la fotorresistencia negativa SU-8 después de la exposición a la luz UV.</td></tr><tr><td>Resistencia al despegue de LOR3A</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>Se utiliza con la fotorresistencia Shipley 1805 para promover la socavación durante los procesos de despegue del metal</td></tr><tr><td>Shipley 1805 fotorresistencia positiva</td><td>Microposit, The Dow Chemical Company</td><td></td><td>Fotorreresistencia positiva utilizada para definir interconexiones metálicas y electrodos Pt en electrónica de malla</td></tr><tr><td>MF-CD-26 revelador fotorresistente positivo</td><td>Microposit, The Dow Chemical Company</td><td></td><td>Para revelar fotorresistencia positiva S1805 después de la exposición en un alineador de mascarilla. Muchas salas limpias universitarias almacenan este químico.</td></tr><tr><td>Barnizadora</td><td>de centrifugación Reynolds Tech</td><td></td><td>Para recubrir obleas con resistencias positivas y negativas. La mayoría de las salas limpias universitarias tienen recubridores giratorios.</td></tr><tr><td>Sistema de tratamiento de superficies por plasma PJ</td><td>AST Products, Inc.</td><td></td><td>Se utiliza para oxidar la superficie de la electrónica de malla antes de liberarla en solución acuosa. La mayoría de las salas limpias de las universidades tienen esta herramienta u otra similar.</td></tr><tr><td>Evaporador de haz de electrones</td><td>Denton Vacuum</td><td></td><td>Para evaporar Cr y Pt durante la fabricación de electrónica de malla. Muchas salas limpias universitarias cuentan con esta herramienta u otra similar.</td></tr><tr><td>Removedor PG</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>Se utiliza para disolver LOR3A y Shipley S1805 resiste durante el despegue del metal</td></tr><tr><td>Solución de cloruro férrico</td><td>MG Chemicals</td><td>415-1L</td><td>Un componente de la solución de grabado de Ni,</td></tr><tr><td>solución de ácido clorhídrico al 36%,</td><td>Kanto Corp.</td><td></td><td>Un componente de la solución de grabado de Ni,</td></tr><tr><td>agujas capilares de vidrio</td><td>, Drummond Scientific Co.</td><td></td><td>Diámetro interior 0,40 mm, diámetro exterior 0,65 mm. Otros diámetros están disponibles.</td></tr><tr><td>Soporte para micropipetas tipo U Molecular</td><td>Devices, LLC</td><td>1-HL-U</td><td>Se utiliza para sujetar las agujas capilares de vidrio durante la inyección estereotáxica</td></tr><tr><td>Jeringa de 1 mL</td><td>NORM-JECT&REG;, Henke Sass Wolf</td><td></td><td>Se utiliza para la carga manual de componentes electrónicos de malla en agujas capilares Tubo de</td></tr><tr><td>catéter de polietileno intrademic</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td></td><td>Diámetro interior 1,19 mm, diámetro exterior 1,70 mm</td></tr><tr><td>Jeringa de 5 mL</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td></td><td>Utilizada en la bomba de jeringa para la inyección de electrónica de malla en vivo</td></tr><tr><td>Cámara ocular</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>DCC1240C</td><td>Se utiliza para ver la electrónica de malla dentro de las agujas capilares durante la inyección</td></tr><tr><td>ThorCam uc480 software de adquisición de imágenes para cámaras USB</td><td>Thorlabs Inc.</td><td></td><td>Se utiliza para ver la electrónica de malla dentro de las agujas capilares durante la inyección</td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD 2000</td><td>Se utiliza para hacer fluir volúmenes precisos de solución a través de agujas capilares durante la inyección de electrónica de malla</td></tr><tr><td>EXL-M40 taladro dental Osada</td><td></td><td>3144-830</td><td>Para perforar la craneotomía</td></tr><tr><td>Fresa de fresa de 0,9 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-09</td><td>Para perforar la craneotomía</td></tr><tr><td>Esterilizador de perlas calientes 14 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-50</td><td>Se utiliza para esterilizar instrumentos quirúrgicos</td></tr><tr><td>CM1950 instrumento de criosección</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Se utiliza para cortar tejido congelado en secciones. Muchas universidades tienen esta herramienta o una similar disponible en una instalación compartida.</td></tr><tr><td>0.3% Triton x-100</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Utilizado para histología</td></tr><tr><td>5% suero de cabra</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Utilizado para histología</td></tr><tr><td>3% suero de cabra</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Utilizado para histología</td></tr><tr><td>Conejo anti-NeuN</td><td>Abcam</td><td>ab177487</td><td>Utilizado para histología</td></tr><tr><td>Anti-Neurofilamento de ratón</td><td>Abcam</td><td>ab8135</td><td>Utilizado para histología</td></tr><tr><td>Rata anti-GFAP</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>PA516291</td><td>utilizado para la histología</td></tr>, <tr><td>ProLong, Gold, Antidecoloración, Mountant,</td><td>Thermo, Fisher Scientific, Inc.</td><td>P36930</td><td>Utilizado para histología</td></tr><tr><td>Poly-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>P6407-5MG</td><td>Peso molecular = 70-150 kDA</td></tr><tr><td>Abrazadera de extremo en ángulo recto</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>RA180/M</td><td>Se utiliza para fijar el soporte de pipeta al marco estereotáxico</td></tr><tr><td>Placa de circuito impreso (PCB)</td><td>Circuitos avanzados</td> Se utiliza para interactuar entre la electrónica de <td></td><td>malla y la electrónica de medición periférica, como el sistema de grabación Intan. Advanced Circuits y otros proveedores fabrican y ensamblan PCB en función de los archivos de diseño proporcionados. Nuestros archivos de diseño de PCB están disponibles a pedido o en el sitio de recursos meshelectronics.org</td></tr><tr><td>conector de amplificador estándar de 32 canales</td><td>Omnetics Connector Corp.</td><td>A79024-001</td><td>Componente ensamblado en la placa de circuito</td></tr><tr><td>impreso Cable flexible plano (FFC) de 32 canales</td> <td>152660339 Molex, LLC</td><td></td><td>Se utiliza como sustrato de sujeción cuando se interactúa con almohadillas de E/S de componentes electrónicos de malla con el conector ZIF montado en PCB</td></tr><tr><td>Conector de fuerza de inserción cero (ZIF) de 32 canales</td><td>Hirose Electric Co., LTD</td><td>FH12A-32S-0.5SH(55)</td><td>Componente ensamblado en la placa de circuito impreso</td></tr></tbody></table>

jeringa inyectable malla electrónica para electrofisiología roedor crónico estable

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

Puntas de prueba de electrofisiología cerebral implantable son herramientas valiosas en Neurociencia debido a su capacidad para grabar actividad neuronal con alta resolución espaciotemporal de regiones someras y profundas del cerebro. Su uso ha sido obstaculizado, sin embargo, por desajustes mecánicos y estructurales entre las sondas y cerebro tejido que comúnmente conducen a micromotion y gliosis con que señal de inestabilidad en los experimentos de grabación crónica. En contraste, después de la implantación de la ultraflexible malla electrónica vía la inyección de la jeringa, la malla de sondeos forma una interfaz transparente, libre de gliosis con el tejido de cerebro circundante que permite seguimiento estable de neuronas individuales en al menos un año escala de tiempo. Este detalles de protocolo los pasos clave en un experimento de grabación neuronal de ratón típico usando jeringa inyectable malla electrónica, incluyendo la fabricación de la malla electrónica en un estándar Fotolitografía proceso posible en muchas universidades, carga malla electrónica en agujas capilares estándar, inyección estereotáctica en vivo, conexión de la malla de entrada/salida para interfaces de instrumentación estándar, refrenados o mover libremente las sesiones de grabación e histológica de secciones del cerebro que contiene el tejido de malla electrónica. Se presentan grabaciones representativas de nervios y datos de la histología. Investigadores familiarizados con este protocolo tendrá los conocimientos necesarios para incorporar malla electrónica en sus propios experimentos y tomar ventaja de las oportunidades únicas que ofrece interconexión neuronal estable a largo plazo, tales como estudios de envejecimiento procesos, el desarrollo del cerebro y la patogenesia de la enfermedad cerebral.

Resultados variará según la especie animal en el estudio, la región cerebral específica, el tiempo transcurrido desde la inyección, la cantidad de daño agudo durante la inyección y el éxito de la entrada-salida interfaz de procedimiento, entre otros factores. Actividad spiking unitarios puede no aparecer hasta 1 día (en el caso de 150 μm agujas de diámetro interno) para 1 semana después de que las amplitudes de inyección y spike pueden variar hasta 4 – 6 semanas. La figura 9 muestra datos electrofisiológicos representativos de una punta de prueba de 32 canales malla electrónica inyectada en el hipocampo y la corteza somatosensorial primaria de un ratón C57BL/6J macho adulto. Aproximadamente 300 μV amplitud campo locales potenciales (LFPs) fueron registrados en todos los 32 canales y actividad clavaba una sola unidad se registró en 26 canales. El LFPs y picos aislados seguían siendo similares entre 2 y 4 meses, lo que sugiere una interfaz altamente estable entre grabación electrónica y las neuronas en este período de tiempo prolongado. La figura 10 muestra resultados representativos de secciones histológicas y el immunostaining del tejido de cerebro que contienen malla electrónica 1 año después de la inyección. Coloración para NeuN, marcador de Somas neuronales y neurofilament, un marcador para axones neuronales, no revela poco o ninguna pérdida de densidad del tejido en el sitio de inyección, implicando inconsútil interfaz entre el tejido de malla electrónica y el cerebro. Coloración para GFAP (marcador de astrocitos) más revela niveles de cerca de fondo de astrocitos en malla electrónica, indicando que su presencia provoca respuesta inmune poco crónica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig1.jpg"> Figura 1: pasos en una jeringa inyectable malla electrónica experimento. Este protocolo describe todos los pasos claves en un experimento típico roedor grabación neuronales usando malla electrónica. Experimentos implican generalmente, en orden de ejecución, (1) fabricación de la malla electrónica, (2) carga de la malla electrónica en agujas capilares, inyección (3) estereotáxicas de malla electrónica en el cerebro, (4) eléctricos I/O interface para malla electrónica, grabaciones contenidas o libre movimiento (5) y (6) malla tejido seccionado y tinción para histología. En algunos estudios, sólo los datos de la histología pueden desear, en cuyo caso puede omitirse pasos (4) y (5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig2.jpg"> Figura 2: esquema que representa el procedimiento de fabricación de electrónica de red plug-and-play en la región de dispositivo ultraflexible (fila superior), madre interconecta la región (fila media) y región de I/O (fila inferior). (A) SU-8 photoresist negativo (rojo) es modelado con máscara de PL-1 para definir el fondo pasivado de capa de cada sonda electrónica de acoplamiento plug-and-play. (B) dibujo con máscara-2 PL, evaporación térmica y despegue metal definir Au interconecta y I/O (oro). (C) dibujo con máscara-3 PL, evaporación de viga del electrón y despegue metal definir electrodos de Pt (azul). (D) SU-8 photoresist negativo (rojo) es modelado con máscara de PL-4 para definir la capa de pasivación superior. Las aberturas en el SU-8 quedan en cada electrodo de Pt y la almohadilla de I/O. (E) A terminado malla sonda electrónica con cajas discontinuas que indica las posiciones ampliadas en la parte superior, media y filas de fondo. Archivos de diseño de fotomáscara están disponibles por petición de los autores o desde el sitio de recursos, meshelectronics.org. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig3.jpg"> Figura 3: fotografías e imágenes de microscopio óptico de plug-and-play de malla electrónica. (A) imágenes de microscopio óptico de una sonda electrónica de malla jeringa inyectable con la entrada-salida del plug-and-play de baldosas. La sonda era reflejada después de la finalización de la fabricación los pasos en la figura 2 pero antes del lanzamiento del substrato Ni revestido. Cajas discontinuas corresponden de izquierda a derecha a las secciones de la región de dispositivo ultraflexible, vástago, I/O región y magnificado en C, D y E, respectivamente. Barra de escala = 1 mm. (B) fotografía de una oblea de Si de 3 pulgadas que contiene 20 terminado malla electrónica sondas. Barra de escala = 20 mm. (C) imagen de microscopio óptico de electrodos grabación Pt 20 μm de diámetro en la región de dispositivo ultraflexible. Barra de escala = 100 μm. (D) imagen de microscopio óptico de alta densidad Au interconecta en la región del tallo. Cada interconexión de Au es aislada eléctricamente y conecta un solo electrodo de Pt con un solo botón I/O. Barra de escala = 100 μm. (E) óptico microscopio imagen de cojines I/O. Cada almohadilla se compone de una región de malla plegable y una región de película delgada continua ubicado en el tallo. Realización de no SU-8 cintas conectan las partes de acoplamiento de las pastillas para ayudar a mantener la alineación. Barra de escala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig4.jpg"> Figura 4: montaje del aparato para sostener agujas capilares durante la inyección. (A) fotografía de los componentes del aparato. Los componentes incluyen (1) una aguja capilar de vidrio, (2) un soporte de pipeta, (3) un sujetador de tornillo circular portador de la pipeta y (4) una arandela conica para el titular de la pipeta. Artículos (2) a (4) se incluyen con la compra de un soporte de pipeta. La flecha marca la salida del titular de pipeta que se pega con epoxi. (B) fotografía del titular de la pipeta después de Asamblea y la inserción de una aguja capilar de vidrio. El agregado de epoxy es visible en la salida superior del porta pipeta (señalada con flecha) y tubo capilar conecta el soporte de la pipeta con una jeringa (no mostrada). (C) fotografía del titular de la pipeta y la aguja capilar después de la fijación al bastidor estereotáxicas con una abrazadera de ángulo recto final. Barras de escala son 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig5.jpg"> Figura 5: carga de la malla electrónica en agujas de cristal. (A) Ilustración esquemática del procedimiento de carga de plug-and-play malla electrónica. Una aguja de vidrio se coloca cerca del extremo de I/O de una sonda electrónica de acoplamiento mientras que está suspendido en la solución. Émbolo de la jeringa luego se retrae manualmente para dibujar en la punta de prueba electrónica de malla. Posición ideal es con la región ultraflexible dispositivo justo en el extremo de la aguja. (B) fotografías correspondientes a (A) de una sonda electrónica de malla se cargue en una aguja de vidrio. Barras de escala = 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig5large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig6.jpg"> Figura 6: esquema de la estación de cirugía estereotáctica. Un armazón estereotáxicas motorizado (A) con soporte para pipeta adjunta se utiliza para colocar la aguja en la región del cerebro deseada. La posición de la aguja y el acoplamiento de carga electrónica son monitoreados con un objetivo y adjunto cámara (B) y en un ordenador (C). Una bomba de jeringa (D) fluye precisa volúmenes de solución salina a través de la aguja, permitiendo para la inyección precisa y controlada de la malla electrónica en la región del cerebro deseado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig7.jpg"> Figura 7: Plug-and-play I/O interface procedimiento. (A) FFC un sustrato de fijación se asegura con cemento dental adyacente a la craneotomía. (B) Plug-and-play malla electrónica stereotaxically se inyecta en la región del cerebro deseada utilizando el método de campo de visión. (C) la aguja, con las almohadillas de I/O de la malla electrónica dentro de la punta de prueba, es reposicionado sobre FFC sustrato de fijación. (D) flujo se reasume a través de la aguja para extraer las pastillas de I/O en el FFC sustrato de fijación. (E) las almohadillas de I/O están doblados a 90 ° en relación con la madre, se desarrolló con la dirección hacia arriba y secar en lugar. Sustrato (F) la FFC se recorta con unas tijeras a una línea recta aprox. 0,5 mm desde el borde de las pastillas de I/O. Substrato sobrante se corta para permitir la inserción de un conector ZIF de 32 canales. (G) la entrada-salida pastillas se introducen en un conector ZIF de 32 canales montado sobre un PCB personalizado. El conector ZIF esté bien cerrada para hacer contacto con las almohadillas de I/O. Se cementa (H) el pestillo cerrado, la placa se voltea en el cráneo, y el PCB se fija en su lugar con cemento dental. () El PCB forma un headstage compacto con un conector de amplificador estándar para interfaces de fácil durante las sesiones de grabación. Barras de escala = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig7large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig8.jpg"> Figura 8: grabaciones contenidas y libremente móviles. (A) fotografía del macho ratón C57BL/6J un limitador durante una sesión de grabación. Un PCB de preamplificador de canal 32 se ha insertado en el conector del amplificador estándar. (B) fotografía del mismo ratón con 32 canales preamplificador PCB durante un experimento de grabación libremente móviles. Barras de escala = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig8large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig9.jpg"> Figura 9: grabación neuronales representativas resultados. (A) representante LFP mapas de calor de 32 canales de malla de puntas de prueba electrónica inyectadas en el ratón hipocampo y la corteza somatosensorial. Los datos fueron registrados mientras que el ratón explora libremente su jaula en 2 meses (arriba) y después de la inyección 4 meses (parte inferior). Amplitud de la LFP es codificados por colores según la barra de color a la derecha. High-pass filtrados rastros (negro) que muestra actividad spiking son overlaid en el espectrograma para cada uno de los 32 canales. (B) espigas aisladas después de ordenar los datos trazados en (A). Se detectó actividad clavaba una sola unidad en 26 de los 32 canales ambos 2 meses posterior a la inyección (arriba) y 4 meses posterior a la inyección (parte inferior). Los números sobre cada racimo de picos corresponden a los números de canal en (A). Esta figura ha sido modificada de Fu, et al. 28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig9large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58003/58003fig10.jpg"> Figura 10: resultados de histología representativa. (A) diagrama esquemático que ilustra la orientación de la malla electrónica en horizontal (panel central) y sagital rebanadas de cerebro (panel inferior). (B) imagen de microscopio de fluorescencia de un trozo de cerebro cortical gruesa de 10 μm un año después de la inyección de una sonda electrónica de malla de 16 canales. El segmento ha sido immunostained para NeuN (verde). (C) el mismo segmento de cerebro immunostained para neurofilamentos (rojo). (D) el mismo cerebro rebanada immunostained para GFAP (cian). (E) A imagen compuesta (b) a (D) que muestra el tejido malla electrónica interfaz con etiquetado NeuN (verde), neurofilamentos (rojo), GFAP (cian) y malla electrónica (azul). Barras de escala = 100 μm. Esta figura ha sido modificada de Fu et al. 27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/58003fig10large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
1 Video complementario: repetida carga e inyección de malla electrónica en solución. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58003/video1.mp4">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Malla electrónica sondas perfectamente integraran y proporcionan nivel estable, a largo plazo, solo-neurona grabación dentro del cerebro. Este protocolo utiliza malla electrónica para los experimentos en vivo , que implica la fabricación de la malla electrónica, carga en agujas, inyección estereotáctica, interfaces de entrada/salida, experimentos de la grabación y la histología del tejido con malla puntas de prueba.

Jeringa inyectable malla electrónica para electrofisiología roedor crónico estable

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como cómo se manifiestan los procesos de envejecimiento en el cerebro, cómo se desarrolla el cerebro y cómo se originan y progresan las enfermedades cerebrales. La principal ventaja de esta técnica es que la electrónica de malla no provoca una respuesta inmunitaria crónica en la gliosis una vez implantada en el cerebro y permite una integración perfecta con el tejido neural circundante. Tao Zhou, estudiante graduado en el Grupo Lieber, y Jung Min Lee, postdoctorado en el Grupo Lieber, demostrarán el procedimiento.Para comenzar el procedimiento, cargue una oblea de silicio limpia en un evaporador térmico y evapore 100 nanómetros de níquel. A continuación, centrifuga la capa fotorresistente negativa SU-8 2000.5 sobre la oblea a 400 revoluciones por minuto para un espesor aproximado de SU-8 de 400 a 500 nanómetros. Cargue la oblea en un alineador de máscara para exponer el SU-8 con la máscara de fotolitografía correspondiente a la capa SU-8 de malla inferior.Exponga a una dosis de 100 milijulios por centímetro cuadrado. Ellos, sumergen la bandeja de la oblea en el revelador SU-8. Agite suavemente la solución durante dos minutos, hasta que el patrón de malla en el SU-8 se haya desarrollado por completo.Luego, enjuague la oblea en una bandeja de alcohol isopropílico durante un minuto y séquela con secador. Hornee la oblea en una placa caliente a 180 grados centígrados durante una hora. A continuación, centrifugar la capa LOR 3A sobre la oblea a 4.000 revoluciones por minuto para obtener un grosor aproximado de 300 nanómetros.Spin coat S1805 fotorresistente positivo a 4.000 revoluciones por minuto para un espesor aproximado de 500 nanómetros. Posteriormente, cargue la oblea en un alineador de máscara para exponer el S1805 con máscara de fotolitografía dos correspondientes a las interconexiones metálicas y las almohadillas de entrada, salida. Expuesto a dosis de línea H a 40 milijulios por centímetro cuadrado, luego sumerja la oblea en una bandeja de revelador fotorresistente CD-26.Agite suavemente la solución durante un minuto hasta que el patrón de interconexiones metálicas se haya desarrollado por completo. Enjuague la oblea en una bandeja con agua desionizada durante un minuto y séquela con un soplo. A continuación, evapora térmicamente tres nanómetros de cromo seguidos de 80 nanómetros de oro.Sumerja la oblea en un vaso de precipitados plano de removedor PG durante aproximadamente tres horas, hasta que el metal se haya socavado por completo, dejando el metal solo en las regiones de interconexión y almohadilla de entrada y salida deseadas de la electrónica de malla. Repita el recubrimiento de centrifugado, la litografía, la evaporación y despegue para dejar tres nanómetros de cromo y 50 nanómetros de platino en las regiones de los electrodos. Posteriormente, repita el recubrimiento de espín y la fotolitografía de SU-8 para definir la capa superior de malla de SU-8.Trate la oblea con plasma de oxígeno a 50 vatios durante un minuto. Luego, sumerja la oblea en un grabado de níquel en solución durante aproximadamente tres horas, hasta que la electrónica de malla se haya liberado completamente de la oblea de silicio. Utilice una pipeta pasteur para transferir las sondas electrónicas de malla liberadas del grabado de níquel a un vaso de precipitados de 100 mililitros de agua desionizada.Luego, transfiera la electrónica de malla a un vaso de precipitados nuevo con agua desionizada al menos tres veces para garantizar el enjuague. Para cargar la electrónica de malla en una aguja, inserte una aguja capilar de vidrio en el vaso de precipitados de 100 mililitros de PBS que contiene la electrónica de malla. Coloque el extremo de la aguja cerca de las almohadillas de entrada y salida de una sonda electrónica de malla y retraiga manualmente la jeringa para introducir una sonda electrónica de malla en la aguja.Empuje y tire del émbolo de la jeringa mientras aún está sumergido en solución salina para ajustar la posición de la electrónica de malla dentro de la aguja. Para inyectar componentes electrónicos de malla en el cerebro de un ratón, use un taladro dental y un marco estereotáxico para abrir una craneotomía en las coordenadas deseadas en el cráneo. Abra una segunda craneotomía lejos del sitio de inyección para la inserción de un tornillo o alambre de acero inoxidable.Luego, fije un sustrato de sujeción al cráneo con cemento dental. Un corte de aproximadamente un milímetro de ancho en el sustrato mejora la fiabilidad del paso de plegado posterior en el procedimiento. A continuación, monte el soporte de pipeta con la aguja que contiene la electrónica de malla en el marco estereotáxico mediante una abrazadera de extremo en ángulo recto.Conecte la salida lateral del soporte de pipeta a una jeringa de cinco mililitros sujeta a una bomba de jeringa con un tubo capilar de 0,5 a un metro de largo. A continuación, utilice el marco estereotáxico para colocar la punta de la aguja en el lugar de inicio deseado dentro del cerebro. Coloque la cámara para mostrar la parte superior de la sonda electrónica de malla dentro de la aguja de vidrio.Inicie el flujo ajustando la bomba de jeringa a una velocidad baja y presionando inicio. Aumente lentamente el caudal si la sonda electrónica de malla no se mueve dentro de la aguja. A medida que la sonda electrónica de malla comienza a moverse dentro de la aguja, use el marco estereotáxico para retraer la aguja a la misma velocidad con la que se inyecta la sonda electrónica de malla utilizando la posición original marcada de la electrónica de malla como guía.Continúe fluyendo solución salina y retrayendo la aguja hasta que la aguja haya salido del cráneo. Luego, detenga el flujo de la bomba de jeringa. En este procedimiento, use el marco estereotáxico para guiar cuidadosamente la aguja hacia el sustrato de sujeción de cable plano y flexible a través del espacio, haciendo fluir la solución con la bomba de jeringa para generar una holgura en las interconexiones electrónicas de malla.Una vez que la aguja esté por encima del sustrato de sujeción y a través del espacio, reanude el flujo a un ritmo rápido para inyectar las almohadillas de entrada y salida de la electrónica de malla en el sustrato de sujeción. Con unas pinzas y una pipeta de agua desionizada, doble las almohadillas de entrada y salida en un ángulo de 90 grados lo más cerca posible de la primera almohadilla de entrada y salida. Una vez que las almohadillas de entrada y salida estén alineadas y dobladas y en un ángulo de 90 grados con respecto al vástago de malla, séquelas en su lugar con aire comprimido que fluya suavemente.Corte el sustrato de sujeción en un borde estrecho de aproximadamente 0,5 a un milímetro del borde de las almohadillas de entrada y salida. Además, corte las partes extrañas del sustrato de sujeción que dificultarán la inserción en el conector zif de 32 canales montado en PCB. Luego, inserte las almohadillas de entrada y salida en el conector zif de la PCB y cierre el pestillo.Utilice la electrónica de medición para medir la impedancia entre los canales y el tornillo de tierra para confirmar la interfaz. Si los valores de impedancia son demasiado altos, desenganche el conector zif, ajuste la inserción y vuelva a probar hasta que se confirme que la conexión se ha realizado correctamente. Posteriormente, cubra el conector zif y la electrónica de malla expuesta se interconecta con el cemento dental para su protección.Voltee la PCB en el espacio en el sustrato y fije la PCB con cemento en el cráneo del ratón. Para grabaciones que se mueven libremente, suelte el mouse del retenedor después de insertar la PCB del preamplificador y conectar a tierra el tornillo de referencia. Registre durante el período de tiempo deseado utilizando el sistema de adquisición de datos mientras el mouse se comporta libremente.Aquí se muestran los mapas de calor de campo local representativos de las sondas electrónicas de malla de 32 canales inyectadas en el hipocampo y la corteza somatosensorial del ratón. Los datos se registraron mientras el ratón exploraba libremente su jaula a los dos meses y cuatro meses después de la inyección. La amplitud de potencial de campo local está codificada por colores de acuerdo con la barra de color de la derecha.Las trazas de filtro de paso alto, negras, que muestran actividad de picos, se superponen en el espectrograma para cada uno de los 32 canales. Aquí están los picos aislados después de ordenar los datos trazados. Se detectó actividad de aumento de una sola unidad en 26 de los 32 canales, tanto dos meses después de la inyección como cuatro meses después de la inyección.Al intentar este procedimiento, es importante recordar probar la interfaz de E/S para confirmar que la conexión eléctrica se ha realizado correctamente con la sonda electrónica de malla. La impedancia de medición ayuda a solucionar el origen de cualquier problema y es fundamental para identificar problemas con la interfaz o la fabricación. Siguiendo este procedimiento, se puede realizar la histología para estudiar el entorno celular alrededor de cada electrodo registrado.A diferencia de las sondas cerebrales rígidas convencionales, la electrónica de malla se puede dejar en el tejido durante la histología, lo que permite correlacionar con precisión los datos electrofisiológicos con el análisis inmunohistoquímico.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Este protocolo describe el ensamblaje y el uso de un inyecturo para la administración precisa de fármacos en regiones específicas del cerebro de una rata anestesiada, seguido de la monitorización de la actividad neuronal a través de señales eléctricas registradas.

Microinyección de fármacos con registro electrofisiológico en el cerebro de una rata

El video muestra la inyección de sondas electrónicas de malla en el cerebro de un ratón para grabaciones estables a largo plazo a nivel de una sola neurona. Un ratón anestesiado con un cráneo expuesto se asegura en un marco estereotáxico, y la región del dispositivo de malla de la sonda se inyecta en el cerebro a través de orificios perforados. Las almohadillas de entrada-salida de la sonda están conectadas a un circuito, y las grabaciones se obtienen utilizando un sistema de adquisición de...

Electrónica de malla inyectable para grabaciones estables de una sola neurona en el cerebro de un ratón

Fuente: Lai, J., et al. Registro electrofisiológico simultáneo y microinyecciones de agentes inhibidores en el cerebro de roedores. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra una técnica basada en microinyección para el registro e inhibición neuronal simultáneos en el colículo superior de rata. El procedimiento implica la focalización estereotáxica, la perforación del cráneo y la inserción de un inyectrode, que administra un neurotransmisor inhibidor mientras registra la actividad neuronal. La...

Inhibición de la actividad neuronal y su detección mediante electrofisiología en una rata

Aquí, creamos una pipeta de vidrio con doble función: inhibición de estructuras cerebrales profundas mediante microinyecciones de fármacos y monitorización en tiempo real de sus efectos mediante registros electrofisiológicos simultáneos.

Grabación simultánea electrofisiológico y micro-inyecciones de agentes inhibitorios en el cerebro de roedores

Aquí demostramos el uso de una tecnología inalámbrica para el electroencefalograma (EEG) en modelos neonatos de roedores con enfermedades humanas. Con la telemetría, no hay conexiones que entorpezcan, lo que permite comportamientos naturales.

A largo plazo Monitoreo EEG continua en Modelos pequeño roedor de las enfermedades humanas Uso del Sistema Transmisor inalámbrico Epoch

Presentamos métodos para la construcción de electrodos que registren simultáneamente la actividad neuronal extracelular y liberen múltiples sustancias neuroactivas en las proximidades de los sitios de registro en ratones despiertos. Esta técnica permite el análisis detallado de las entradas sinápticas locales putativas a la neurona de interés.

Extracelular de grabación de la actividad neuronal junto con la aplicación de sustancias Microiontophoretic neuroactivos en ratones Awake

Ratones anestesiados exhiben la presión arterial sistémica no fisiológico, que impide una evaluación significativa del tono autonómico, dada la íntima relación entre la presión arterial y el sistema nervioso autónomo. Así, se describe un método novedoso para la actividad del nervio simpático renal al mismo tiempo récord y la presión arterial con la infusión intravenosa en ratones conscientes.

Nuevo enfoque para la grabación simultánea de la actividad nerviosa simpática Renal y presión arterial con la infusión intravenosa en consciente, libre de ratones.

A continuación se describe un método para la implantación de múltiples matrices de electrodos de polímeros en regiones cerebrales anatómicamente distantes para la grabación electrofisiológica crónica en ratas que se mueven libremente. La preparación y la implantación quirúrgica se describen en detalle, con énfasis en los principios de diseño para guiar la adaptación de estos métodos para su uso en otras especies.

Implantación Crónica de Múltiples Matrices de Electrodos Flexibles de Polímeros

Presentamos un sistema de microinyección diseñado para electrofisiología y entrega asistida de sondas experimentales (es decir, nanosensores, microelectrodos), con infusión de fármacos opcional. Los componentes microfluídicos ampliamente disponibles se acoplan a una cánula que contiene la sonda. Se incluye un protocolo paso a paso para la construcción de microincrimógenos, con resultados durante la perfusión de muscimol en corteza macaca.

Sistema de Microinyección para Infusión Combinada de Drogas y Electrofisiología

Aquí, presentamos un sistema de implante de sonda liviano y rentable para electrofisiología crónica en roedores optimizado para la facilidad de uso, la recuperación de la sonda, la versatilidad experimental y la compatibilidad con el comportamiento.

El implante DREAM: un sistema de implantes ligero, modular y rentable para la electrofisiología crónica en ratones de cabeza fija y de comportamiento libre

Este protocolo fue desarrollado para crear un sistema confiable y de fácil acceso para registrar EEG de roedores en movimiento libre.

Un protocolo rentable y mínimamente invasivo para el registro de electroencefalografía crónica multisitio en ratones que se mueven libremente

Aprende a fabricar e implantar electrónica de malla para registrar neuronas de forma estable en cerebro de roedor. Este método permite estudios electrofisiológicos crónicos sin respuesta inmune.

Jeringa inyectable malla electrónica para electrofisiología roedor crónico estable

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