El uso de alta resolución de tomografía computarizada para visualizar la estructura tridimensional y la función de la Planta Vasculatura

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la tecnología de microtomografía de rayos X basada en sincrotrón para explorar la estructura y función del transporte vascular en las plantas. Esto se logra preparando primero las muestras para su instalación en un portamandril o en el soporte de plantas vivas, asegurándose de que la porción a escanear esté lo más vertical posible y tomando las medidas fisiológicas preliminares necesarias. El segundo paso es colocar las muestras preparadas o las plantas vivas en la conejera A LS Beamline 8.3 0.2 y asegurar la conejera para su escaneo. Próximo.

Después de colocar correctamente la muestra, se inicia el escaneo. El paso final es utilizar las computadoras de la estación de trabajo para normalizar, reconstruir y evaluar la calidad del escaneo antes de pasar los datos a un VISO para el proceso de visualización 3D. En última instancia, la microtomografía de rayos X se utiliza para revelar detalles finos de las interconexiones y el estado funcional de la vasculatura conductora de agua en las plantas.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el corte en serie y la microscopía óptica, es que el tejido vegetal se puede explorar en cualquier orientación con una resolución sin precedentes. Este método puede ayudarnos a comprender preguntas clave en el campo de la biología vegetal, desde aspectos fundamentales del transporte de agua en las plantas hasta la sequía y la tolerancia a la congelación hasta cómo los patógenos se mueven sistémicamente en las plantas huésped. Este protocolo, tal y como se describe, está diseñado para trabajar con una fuente de luz avanzada.

8,3 0,2. Es posible que se requieran adaptaciones de la línea de luz para trabajos en otras instalaciones de sincrotrón. Asegúrese de seguir la capacitación en seguridad y radiación requerida para el uso de estas instalaciones para comenzar la preparación de muestras para plantas vivas.

Primero cultive plantas en macetas de aproximadamente 10 centímetros de diámetro, asegurándose de que el tallo principal u otra porción de la planta que se va a escanear esté lo más centrado posible y orientado verticalmente en la maceta. Las dimensiones físicas del instrumento HRCT Hutch limitan las plantas vivas a aproximadamente un metro de altura. Como consecuencia, las imágenes de plantas vivas se realizan mejor en plántulas o árboles jóvenes.

Cultivado en macetas pequeñas, use un soporte de maceta de aluminio rígido hecho a medida para montar las plantas vivas en macetas. La altura de la placa superior debe ajustarse para adaptarse a una variedad de alturas de macetas. Aquí, la parte superior de la placa está diseñada para alinearse con la parte superior de la superficie del suelo y la planta sobresale del centro de la placa de dos partes.

Una vez montado en el soporte, mida el potencial de agua del tallo utilizando una cámara de presión estilo módulo de aterrizaje SHO o un parámetro de hoja con clip para determinar el estado fisiológico de la planta antes de escanear. Retuerza un pequeño trozo de alambre de cobre alrededor del tallo para que sirva como fiduciario y garantice una ubicación de escaneo consistente en las plantas que se escanearán repetidamente. Ahora, coloque un cilindro acrílico de pared delgada sobre la planta encima del soporte de aluminio para plantas y asegúrelo en su lugar con tornillos para estabilizar la muestra.

Se deben usar toallas de papel de envoltura de plástico adicionales y cinta adhesiva para minimizar aún más la vibración y el movimiento de las partes de la planta, lo que puede causar distorsiones en la imagen. Conecte el soporte de olla personalizado a la etapa del cojinete de aire y asegúrelo en su lugar colocado entre la fuente de rayos X y el sensor de imágenes y el equipo de la cámara. Asegúrese de colocar el tallo lo más verticalmente posible y centre la muestra en la base del mandril magnético para asegurarse de que permanezca en el campo de visión Durante la rotación, el material vegetal fresco, generalmente tallos o mascotas, se puede escanear después de sacarlo inmediatamente de una planta viva.

Si la intención del experimento es visualizar la totalidad de la red de xilema, primero se debe evacuar el agua dentro de los recipientes y reemplazarla con aire. Para hacer esto, monte la muestra en una cámara de presión estilo calumnia y empuje aire comprimido o nitrógeno a través de la muestra a baja presión durante aproximadamente cinco minutos. Las especies variarán en el tiempo requerido para evacuar la red de embarcaciones.

Si la intención es evaluar el grado de formación de embolia en el tejido fresco de la planta, extraiga muestras de la planta con una hoja de afeitar fresca para hacer los cortes bajo el agua. A continuación, envuelva la muestra en una capa de paraforma para evitar la desecación durante el escaneo, monte la muestra en un portabrocas fijado a una placa de metal atornillada en el centro de la etapa del cojinete de aire y oriente la muestra verticalmente como se describió anteriormente para asegurarse de que la muestra permanezca en el campo de visión. Para preparar muestras de tejido leñoso seco, comience cortando las muestras a aproximadamente seis centímetros de longitud.

Seleccione muestras que estén lo más rectas posible en la región de escaneo objetivo y que tengan un diámetro de aproximadamente un centímetro. El siguiente paso es deshidratar lentamente toda la muestra para garantizar una visualización óptima de la muestra de tejido y el contraste de la imagen. Coloque la muestra de tejido leñoso en un horno de secado a baja temperatura para secar lentamente la muestra sin causar grietas o divisiones en el tejido.

En algunas situaciones, puede ser deseable tener un marcador fiduciario adjunto a la muestra. Esto asegura que la disección y visualización posteriores mediante microscopía electrónica de barrido se puedan orientar a puntos específicos de la imagen de HRCT. Para hacer esto, fije una cuenta o alambre de metal o vidrio en el exterior del tallo con perfume.

Finalmente, monte la muestra en el control de perforación y centro como se describió anteriormente antes de escanear. Determine el aumento que funcionará mejor para su aplicación. El A LS Beamline 8.3 0.2 utilizado aquí tiene la capacidad de escanear con lentes con aumentos de dos x cinco x y 10 x.

Ajuste la energía de los rayos X a 15 kilovoltios de electrones. Los tiempos de exposición dependen generalmente del grosor y la densidad de la muestra y oscilan entre 100 y 1000 milisegundos. Elija un incremento angular que sea adecuado para su aplicación.

Las muestras se giran 180 grados durante un escaneo, y el número de imágenes tomadas durante la rotación puede tener un impacto significativo en el tamaño del conjunto de datos, la longitud del intervalo de escaneo y la calidad final de la imagen. Los escaneos típicos se realizan en incrementos de 0,25 grados, lo que produce 513 imágenes por escaneo. Se pueden lograr intervalos de escaneo más cortos utilizando la configuración de tomografía continua durante la cual la muestra gira continuamente mientras se capturan las imágenes para cada exploración, también se deben recopilar imágenes de campo claro y campo oscuro.

Las imágenes de campo claro son imágenes sin la muestra en el haz. A menudo se recogen antes y después de la exploración de la muestra mediante la traducción horizontal de la muestra. Los campos oscuros se recogen cerrando el obturador de rayos X.

Mide la cantidad de señal que muestra la cámara sin rayos X. Una vez finalizado el escaneo, transfiera las imágenes TIFF 2D sin procesar desde el ordenador de adquisición a un servidor de archivos y, a continuación, expórtelas a un ordenador para utilizarlas en el procesamiento de datos. A continuación, las imágenes deben convertirse a una escala de transmisión porcentual.

El Beamline 8.3 0.2 tiene un complemento de normalización de fondo personalizado que se puede descargar y usar con los paquetes de software disponibles gratuitamente. Image J o Fiji cargan las imágenes normalizadas en el paquete de software Octopus, luego reconstruyen un conjunto de datos 3D a partir de los archivos de imagen TIFF RAW 2D utilizando los pasos de procesamiento designados. A continuación, la pila de imágenes se puede visualizar en uno de una variedad de paquetes de software.

Aquí se utiliza el paquete de software aviso, cargue conjuntos de datos en la memoria del sistema y muestre la muestra en orientaciones de corte transversal, longitudinal o radial virtual Debido a los atributos 3D del conjunto de datos, los cortes virtuales a través de la muestra se pueden rotar en cualquier plano para alinearse con las regiones de interés. Una vez que se ha logrado la segmentación, es posible cuantificar las estructuras de la planta objetivo o los cambios funcionales en volumen, longitud, ancho, presencia o ausencia de agua, aire, etc. Los escaneos de TCAR de sincrotrón se han implementado con éxito en una amplia variedad de tejidos y especies de plantas utilizando Beamline 8.3 0.2, y han proporcionado nuevos conocimientos sobre la estructura y función del xilema de las plantas con una resolución sin precedentes en 3D.

Las capacidades de visualización y exploración proporcionadas por las reconstrucciones en 3D, como se ve aquí, permiten determinar con precisión la ubicación y la orientación de las estructuras con las redes de xilema tanto en muestras de impuestos especiales como en plantas vivas. Aquí vemos una reconstrucción en 3D del tallo de la secuoya sometida a estrés por sequía y que exhibe traqueosas llenas de aire y agua Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en minutos si se hace correctamente Siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como la microscopía electrónica de barrido, se pueden utilizar para validar las estructuras que vemos dentro de las plantas y llegar a umbrales de tamaño, que luego se introducen en los programas de procesamiento que utilizamos para el análisis de datos.