Name: Selección de alto rendimiento funcional utilizando un doble resplandor de ensayo de luciferasa Homemade (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Aprende a identificar reguladores transcripcionales mediante un ensayo de luciferasa de doble resplandor casero y transfecciones robóticas de alto rendimiento en células 293T. Este método genera datos funcionales para miles de genes de forma rápida y económica.

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Damos las gracias a John Darga del MGH ADN Core para la preparación de la biblioteca de detección de ADN. Christopher Chigas de Perkin Elmer prestó apoyo invalorable para nuestra Wallac 1420 luminómetro. Steven Ciacco y Martin Thomae de Agilent proporcionó apoyo para el robot Bravo. Damos las gracias a Ron Johnson y Steve Tito en el NIH para ofrecer generosamente su protocolo de ensayo de luciferasa dual resplandor.

Para una visión general experimental, ver Figura 1. 1. Preparar reportero plásmidos que contienen la alfa-sinucleína Promotor Los elementos reguladores del gen de la alfa-sinucleína (Figura 2) abarcan aproximadamente 10 kb, desde el upstream NACP (A no componente beta amiloide) secuencia de repetición del dinucleótido 1,2 través intrón 2 3. Incluimos una parte de esta región en nuestro reportero construir. Encontramos que los plásmidos que contienen el intrón 2 se requieren procedimientos especiales para el crecimiento, que se detallan a continuación. Los plásmidos de luciferasa, pGL4.10 y pGL4.75 (Figura 3), están disponibles comercialmente de Promega y se pueden propagar a través de protocolos de biología molecular convencionales. <ol><li> Amplificar los 2 componentes de el promotor de alfa-sinucleína en las PCR separadas utilizando la receta en la Tabla 1 y los cebadores de la Tabla 2. </li><li> Verify productos de PCR en un gel de agarosa y se limpia utilizando el kit de purificación de PCR Qiaquick (Qiagen), eluyendo en 50 l de TE (Tris-EDTA). Almacenar el fragmento de 0,9 kb eluido a -20 ° C para su uso futuro. </li><li> Digerir todo el volumen del fragmento de PCR de 3,4 kb, así como 5 g de pGL4.10, con SacI y XhoI. Tratar el vector con fosfatasa alcalina de intestino de ternero (Roche) y gel de purificar utilizando el kit de PureLink Gel Extracción rápida (Invitrogen). </li><li> Se liga el fragmento y el vector utilizando ADN ligasa T4 (NEB). Limpiar la reacción completada usando el kit de PCR PureLink Micro (Invitrogen), eluyendo en 10 l de tampón TE. </li><li> Transformar 2 l de la limpiado, reacción de ligación en 20 l de células competentes ElectroMAX Stbl4 (Invitrogen) y electroporar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Agitar en un 30 ° C incubadora a 225 rpm durante 90 min. Spread 2 volúmenes en placas de LB que contenían 100 mg / ml de ampicilina y se incuba a 30 ° C durante 2 días. </li><li> Con un palillo, seleccione 4-6 pequeñas colonias de inoculación en 2 ml de TB (Terrific Broth). Cultivar estas culturas miniprep en un 30 ° C coctelera O / N. </li><li> Se purifica ADN plasmídico a partir de 1,5 ml de cada cultivo Miniprep utilizando el kit de PureLink HiPure plásmido Miniprep (Invitrogen). </li><li> Digerir las minipreparaciones con BamHI y a electroforesis en un gel de agarosa. El clon correcto debería producir fragmentos de 2,8 kb y 4,9 kb. </li><li> Restreak la cultura Miniprep restante del clon correcto en un LB (caldo de Luria) placa fresca y crecer a 30 ° C durante 2 días. </li><li> Seleccionar una pequeña colonia e inocular un cultivo iniciador 1,5 ml de TB. Agite O / N a 30 ° C. No deje que el cultivo iniciador crecer hasta la saturación. </li><li> Diluir todo el cultivo iniciador en 150 ml de TB precalentada y agitar a 30 º C durante 2 días. Antes de proceder al paso siguiente, utilizar 1,5 ml de este cultivo para una miniprep y la digestión adicional para confirmar que el clon no mutar durante replicati<html> en. </li><li> Se purifica ADN de plásmido a partir del cultivo restante utilizando el kit de PureLink HiPure plásmido maxiprep (Invitrogen). Los rendimientos esperados de este plásmido intermediario son de 50-150 mg por 150 ml de la cultura. </li><li> Descongelar el fragmento de 0,9 kb congelada en el paso 1.2. Repita los pasos 1.3 a 1.12 para clonar el fragmento de 0,9 kb en el plásmido intermedio, digiriendo lugar con KpnI y SacI. Ligar, transformar, seleccionar y crecer durante Maxipreps que el anterior. La digestión con BamHI debe producir fragmentos de 5,8 kb y 2,8 kb. Este es el plásmido que se utilizará para la pantalla. </li></ol> 2. Preparar las células 293T, el reportero plásmidos y ADN Library for Screening Células 293T se sembraron primero en placas de 96 pocillos y se transfectaron el día siguiente. Reportero plásmidos y ADN de biblioteca se diluyen en placas de 96 pocillos. Se obtuvieron placas de ADN biblioteca transfección de grado a partir del ADN del núcleo en el Hospital General de Massachusetts (obtener = &quot;_blank&quot;&gt; dnacore.mgh.harvard.edu). Este protocolo transfecta una placa única biblioteca en 2 placas idénticas de células 293T (Figura 1), por lo tanto, 2 placas de células deben ser sembradas para cada placa de la biblioteca que se proyectarán. Nota: Se cultivan las células en medio sin rojo fenol o antibióticos, ya que éstos interfieren con los ensayos de luciferasa y aumentan la toxicidad durante la transfección, respectivamente. <ol><li> Para cada placa de la biblioteca de ser controlados, volver a suspender las células 293T tratadas con tripsina a una concentración de 1,5 x 10 5 células / ml en DMEM que contenía 14% de FBS. Vierta la mezcla en un recipiente estéril (Axygen). </li><li> Coloque el depósito, 2 de fondo claro-, placas de 96 pocillos (Corning), y una caja de puntas de pipeta filtro (Agilent) en la cubierta del robot. Dispensar 100 l de células en cada pocillo de ambas placas, para una densidad de 1,5 x 10 4 células por pocillo. </li><li> Centrifugar las placas de las células a 50 xg durante 2 min, con bajas velocidades de rampa para garantizar la igualdaddensidad celular a lo largo de cada pocillo. Incubar a 37 ° C y 10% de CO 2 O / N. </li><li> Diluir la luciérnaga y Renilla reportero plásmidos a 5 ng / l en medio libre de suero. Combinar las diluciones en una proporción de 05:03 de luciérnaga a plásmido de Renilla (en volumen) en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Pipet los plásmidos combinados en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, dosificar 17 l por placa de biblioteca, además de 2-10 l exceso, en cada pocillo. </li><li> Obtener las placas de la biblioteca de ADN transfección grado que el anterior y diluir a 13,3 ng / l de agua libre de endotoxinas. El volumen mínimo por pozo debe ser de 28 l. </li></ol> 3. Lleve a cabo transfecciones En el día 2 de la pantalla, reportero plásmidos y ADN de biblioteca se transfectaron en células 293T. <ol><li> Para cada placa de biblioteca, mezclar 107,5 l de RT Optifect (Invitrogen) con 4,3 ml de medio libre de suero (1:40 dilución) en un tubo de poliestireno. Incubar durante 5 min a TA, y elN prescindir de 44 l (por placa biblioteca) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, de fondo en V de poliestireno (Greiner). </li><li> Coloque el plato de diluida Optifect, reportero plásmidos (Paso 2.5), los ADN de la biblioteca (Paso 2.6), y una caja de puntas de pipeta en la cubierta del robot. </li><li> Aspirar 17 l de reportero plásmidos, 43 l de diluirse Optifect, y 26 l de ADN de la biblioteca, la inserción de un espacio de aire 5 l entre cada aspiración. El ADN de la biblioteca debe ser aspirado pasado para evitar la contaminación cruzada. Vierta el contenido de las puntas en una nueva placa de poliestireno V de fondo, mezclar, tapar y dejar de lado por 20 minutos para permitir que los complejos de lípido / ADN para formar. Si la transfección de múltiples placas de biblioteca, reemplace las puntas de pipeta y placa de biblioteca, y repetir. </li><li> Destape la placa de mezcla Optifect / ADN y lo coloca en la cubierta del robot con 2 placas de células 293T. El uso de una sola caja de puntas de pipeta, aspire 80 l de la Optifect: mezcla de ADN y lentamente dispensar 40 l en cada placa de células. Si transfecting múltiples placas de biblioteca, repita para todos Optifect: placas de ADN. Cubra las células. </li><li> Centrifugar las placas de células a 1200 xg durante 30 min. Cubrir y volver a la incubadora. </li><li> Se incuban las células durante 4-6 horas. Durante esta incubación, preparar medio fresco mediante la mezcla de 12 ml de DMEM que contiene 10% de FBS y 10 mg / ml de ciprofloxacina (CellGro) para cada placa de biblioteca transfectadas. Verter medio fresco en un depósito estéril. </li><li> Coloque 2 cajas de puntas de robots, una sola placa de las células, el depósito que contiene medio fresco, y un depósito de residuos en la cubierta del robot. Aspirar 100 l de medio de las células y dispensar en el depósito de residuos parcialmente lleno con etanol al 70%. Utilizando puntas frescas, aspirado de 100 l de medio fresco y se dispensa lentamente sobre las células. Repita el procedimiento para todas las placas de células. </li><li> Placas Volver a la incubadora durante 48 horas. </li></ol> 4. Realizar Dual-Luciferase ensayos El día 4 de la pantalla, lase llevan a cabo ensayos de luciferasa de luciérnaga y Renilla. Nota: El ensayo de doble luciferasa requiere la adición secuencial de 2 tampones de ensayo, 3X tampón de ensayo de luciérnaga y de Renilla 3X tampón de ensayo, como se describe en la Tabla 3 de la luciérnaga y de Renilla luciferasas no se secretan, por lo tanto las células deben ser lisadas antes de medir la actividad luciferasa. . Tampón de ensayo Firefly lisa células y proporciona sustrato para la luciferasa de luciérnaga; tampón de ensayo Renilla apaga la señal de luciérnaga y proporciona sustrato para la luciferasa de Renilla. <ol><li> Para cada placa de biblioteca, preparar 8 ml de 3X tampón de ensayo de luciérnaga a partir de soluciones madre como se describe en la Tabla 3, y dispensar 82 l en cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en V. </li><li> Para cada placa de biblioteca, también preparar 12 ml de tampón de ensayo 3X de Renilla y dispensar 122 l en cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en V. Ponga a un lado tanto elluciérnagas y Renilla tampones de ensayo. </li><li> Coloque una caja de puntas de pipeta, un depósito de residuos, y 2 placas de células (transfectadas del mismo plato biblioteca) en la cubierta del robot. </li><li> Aspirar 60 l de los medios de comunicación de cada placa y desechar en el depósito de residuos parcialmente lleno de etanol al 70%. Las placas de cubierta y reservar. Si la transfección de múltiples placas de biblioteca, repita para todos los conjuntos de placas. </li><li> Coloque 2 cajas de puntas de pipeta, la placa de 3X tampón luciérnaga ensayo, y un conjunto de placas de las células de la cubierta del robot. </li><li> Aspirar 40 l de tampón 3X luciérnaga ensayo y la agregan a la primera placa de células, mezclando bien. El cambio a las nuevas puntas de pipeta, repita el procedimiento para la segunda placa de la célula. Colocar las células a temperatura ambiente durante 10 minutos para completar la lisis. Si la transfección de múltiples placas de biblioteca, cambie las cajas de puntas y placas de las células, y repetir. </li><li> Luminiscencia Record de cada pocillo de cada placa de células en un luminómetro, grabar durante 1 segundo por pocillo. Placas Volver al robotcubierta. </li><li> Coloque 2 cajas de puntas de pipeta, la placa de tampón de ensayo 3X Renilla, y un conjunto de placas de las células de la cubierta del robot. </li><li> Aspirar 60 l de tampón de ensayo 3X Renilla, y agregarlo a la primera placa de células, mezclando bien. El cambio a una nueva caja de puntas de pipeta, repita el procedimiento para la segunda placa de la célula. Si la transfección de múltiples placas de biblioteca, repita para todos los conjuntos de placas de las células. </li><li> Luminiscencia Registro de todas las placas en un luminómetro, registrando cada pocillo durante 1 segundo el anterior. Deseche las placas. </li></ol> 5. Análisis de Datos <ol><li> Calcular la luciérnaga: relación Renilla luminiscencia (&quot;F: relación R&quot;) para cada bien dividiendo los condes de la señal de la luciérnaga por los condes de señal de Renilla. </li><li> Calcular el valor de inducción dividiendo la relación F: R de cada pocillo por el promedio de F: relación R de la placa, excluido el de mayor y más bajo 25% de los pozos. </li><li> La media de los valores de inducción a través de repeticionespara una placa de biblioteca única transfectadas. Los genes que inducen o reprimen la alfa-sinucleína más de tres pliegues son considerados &quot;hits&quot; en esta pantalla y están sujetas a una mayor validación y pantallas secundarias. </li></ol>

<ol><li>Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+allelic+variation+at+the+NACP-Rep1+repeat+upstream+of+the+%CE%B1-synuclein+gene+%28SNCA%29+on+transcription+in+a+cell+culture+luciferase+reporter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).</li>
<li>Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+intra-allelic+variation+at+NACP-Rep1+in+the+alpha-synuclein+gene%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene.</a> 113 (5), 426-431 (2003).</li>
<li>Scherzer, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA+transcription+factors+directly+regulate+the+Parkinson%27s+disease-linked+gene+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">GATA transcription factors directly regulate the Parkinson's disease-linked gene α-synuclein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 10907-10912 (2008).</li>
<li>Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-Synuclein+in+Lewy+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">α-Synuclein in Lewy Bodies.</a> Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).</li>
<li>Pankratz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meta-analysis+of+Parkinson%27s+disease%3A+identification+of+a+novel+locus%2C+RIT2%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Meta-analysis of Parkinson's disease: identification of a novel locus, RIT2.</a> Ann. Neurol. 71 (3), 370-384 (2012).</li>
<li>Satake, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+identifies+common+variants+at+four+loci+as+genetic+risk+factors+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).</li>
<li>Simón-Sánchez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+reveals+genetic+risk+underlying+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).</li>
<li>Polymeropoulos, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+in+the+alpha-synuclein+gene+identified+in+families+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease.</a> Science. 276 (5321), 2045-2047 (1997).</li>
<li>Ibáñez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causal+relationship+between+a-synuclein+gene+duplication+and+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson's disease.</a> Lancet. 364 (9440), 1169-1171 (2004).</li>
<li>Chartier-Harlin, M. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a-Synuclein+locus+duplication+as+a+cause+of+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease.</a> Lancet. 364 (9440), 1167-1169 (2004).</li>
<li>Singleton, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a-Synuclein+locus+triplication+causes+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">a-Synuclein locus triplication causes Parkinson's disease.</a> Science. 302 (5646), 841 (2003).</li>
<li>Ahn, T. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a-Synuclein+gene+duplication+is+present+in+sporadic+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease.</a> Neurology. 70 (1), 43-49 (2008).</li>
<li>Boyce, F. M., Bucher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus-mediated+gene+transfer+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+USA%22%5BJournal%5D)">Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells.</a> Proc. Nat. Acad. USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).</li>
<li>Montigny, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+influencing+high-efficiency+transfection+of+bacterial+artificial+chromosomes+into+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells.</a> Biotechniques. 35, 796-807 (2003).</li>
<li>Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+genomes+which+express+chloramphenicol+acetyltransferase+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells.</a> Mol. Cell. Biol. 2 (9), 1044-1051 (1982).</li>
<li>Li, J. J., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+ORC6%2C+a+Component+of+the+Yeast+Origin+Recognition+Complex+by+a+One-Hybrid+System%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System.</a> Science. 262, 1870-1874 (1993).</li>
<li>Dejardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Proteins+Associated+with+Specific+Genomic+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci.</a> Cell. 136, 175-186 (2009).</li>
<li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+the+cis-regulatory+sequences+in+the+mouseGenome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome.</a> Nature. 488, 116-120 (2012).</li>
<li>Fan, F., Wood, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+assays+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent assays for high-throughput screening.</a> Assay Drug Dev. Technol. 5 (1), 127-136 (2007).</li>
<li>Hampf, M., Gossen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+combined+Photinus+and+Renilla+luciferase+quantification+compatible+with+protein+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays.</a> Anal. Biochem. 356 (1), 94-99 (2006).</li>
<li>Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+PTC124+activity+in+cell-based+luciferase+assays+of+nonsense+codon+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).</li>
<li>Pearlberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screens+using+RNAi+and+cDNA+expression+as+surrogates+for+genetics+in+mammalian+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells.</a> Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).</li>
</ol>

Este trabajo fue apoyado por las regalías obtenidas por BacMamreagents licencia (patente EE.UU. 5.731.182).

Alfa-sinucleína se ha implicado en la enfermedad de Parkinson (EP) como un componente de los cuerpos de Lewy 4, inclusiones intracelulares considerados patognomónicos de la enfermedad. Numerosos estudios de asociación del genoma han relacionado polimorfismos de nucleótido único en la alfa-sinucleína con un mayor riesgo para los esporádicos PD 5,6,7. Aunque menos común que la enfermedad de Parkinson esporádica, PD familiar puede estar también causada por mutaciones en alfa-sinucleína 8, a...

La capacidad de identificar elementos reguladores genéticos clave y los factores que actúan sobre ellas es fundamental para la exploración de numerosos procesos biológicos. Sin embargo, los factores que regulan la expresión de genes en los tipos de células raras, como la identificación de poblaciones neuronales específicas, puede ser un reto. Aquí, se presenta un protocolo para la identificación de nuevos reguladores transcripcionales de alfa-sinucleína (SNCA), un gen asociado con la enfermedad de Parkinson y expresado en las neuronas dopaminérgicas en la substantianigra pars compacta de la región del cerebro medio. Esto lo logramos mediante una pantalla reportero de alto rendimiento, doble luciferase, in vitro para deconstruir la expresión de alfa-sinucleína en las células 293T. El promotor de alfa-sinucleína se clona primero en un plásmido que contiene el gen reportero de luciferasa de luciérnaga. Un plásmido comercialmente disponible que contiene la luciferasa de Renilla bajo el control de un promotor constitutivamente activo sirve como un control interno. Thesconstrucciones e reportero se transfectan conjuntamente en células 293T en microplacas con plásmidos de una biblioteca de expresión de ADN, de tal manera que cada pocillo se transfectaron con un único plásmido de la biblioteca. Después de 48 horas, la actividad de la luciferasa para cada reportero se mide de forma secuencial utilizando un ensayo de doble resplandor. La expresión relativa de alfa-sinucleína en respuesta a cada gen biblioteca se deduce por la relación de luciérnaga: la actividad de luciferasa de Renilla en cada pocillo (F: relación R) después de la normalización a base de placa. Este protocolo proporciona la capacidad de detectar un gran número de genes (~ 2,500 por semana) por su capacidad para transactivar un gen reportero usando mano de obra mínima (1-2 personas) y un costo mínimo (unos 3 dólares el costo de reactivos por ensayo de microplacas). Reguladores de la transcripción de los genes neuronales (por ejemplo, alfa-sinucleína), que son difíciles de estudiar en neuronas cultivadas refractarios a la manipulación genética, se pueden comparar lado a lado en este ensayo funcional directa. Incluimos en nuestroprotocolo de un método detallado para la clonación y el crecimiento de plásmidos que contienen el promotor de alfa-sinucleína, ya que encontramos que los plásmidos que contienen esta región son inestables cuando se cultivan con procedimientos convencionales (véase la discusión). También incluimos una alternativa económica a los reactivos disponibles en el mercado dual de luciferasa para ensayos de alto rendimiento. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para dirigirse a otros elementos reguladores de interés, o a cualquier proceso que requiere de alto rendimiento transfecciones transitorias.

<table><tr><tbody><td colspan="4"><fuerte>Material</fuerte></td></tr><tr><td>QIAQuick PCR Kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Kit de extracción rápida de gel</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-12</td><td></td></tr><tr><td>PureLink PCR Micro Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K310250</td><td></td></tr><tr><td>PureLinkHiPure Kit de minipreparación de plásmidos</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-03</td><td></td></tr><tr><td>PureLinkHiPure Kit de Plásmido Maxiprep</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-07</td><td></td></tr><tr><td>Bravo Robot</td><td>Agilent-Robot</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Puntas de pipeta con filtro</td><td>Agilent</td><td>19477-022</td><td></td></tr><tr><td>Robot Puntas de pipeta sin filtro</td><td>Agilent</td><td>19477-002</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 pocillos de fondo claro</td><td>Embalses Corning</td><td>3610</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Axygen</td><td>RES-SW96-HP-SI</td><td></td></tr><tr><td>Placa de poliestireno de 96 pocillos con fondo en V</td><td>Greiner</td><td>651101</td><td></td></tr><tr><td>Placa de polipropileno de 96 pocillos con fondo en V</td><td>Greiner</td><td>651201</td><td></td></tr><tr><td>Cubiertas de placa adhesiva</td><td>CryoStuff</td><td>#FS100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>Reactivo</fuerte></td></tr><tr><td>Phusion ADN polimerasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>BAC 2002-D6</td><td>Invitrogen</td><td>2002-D6</td><td></td></tr><tr><td>Intestino de ternera Fosfatasa alcalina</td><td>Roche</td><td>10713023001</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>Nueva Inglaterra Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>pGL4.10</td><td>Promega</td><td>E6651</td><td></td></tr><tr><td>pGL4.74</td><td>Promega</td><td>E6931</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMAX Stbl4 Células competentes</td><td>Invitrogen</td><td>11635-018</td><td></td></tr><tr><td>Eficiencia de subclonación DH5 y alfa; Células Competentes</td><td>Invitrogen</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sin Rojo de Fenol</td><td>Invitrogen</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Optifect</td><td>Invitrogen</td><td>12579017</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacina</td><td>CellGro</td><td>61-277-RF</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Clorhidrato en polvo</td><td>Sigma</td><td>93287</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base Polvo </td><td>Sigma</td><td>93286</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Líquido Puro</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td></td></tr><tr><td>C&#8211; nzyme A</td><td>Nanolight</td><td>309</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Invitrogen</td><td>L2912</td><td></td></tr><tr><td>h-CTZ</td><td>Nanolight</td><td>301</td><td></td></tr><tr><td>PTC124</td><td>SelleckBiochemicals</td><td>S6003</td><td></td></tr></tbody></table>

selección de alto rendimiento funcional utilizando un doble resplandor de ensayo de luciferasa homemade

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Se presenta un protocolo de cribado de alto rendimiento rápido y barato para identificar reguladores de la transcripción de la alfa-sinucleína, un gen asociado con la enfermedad de Parkinson. Células 293T se transfectaron de forma transitoria con plásmidos de una biblioteca de expresión ORF dispuestos, junto con plásmidos informadores de luciferasa, en un formato de microplaca de un gen-por-así. Actividad de la luciferasa de la luciérnaga se ensaya después de 48 horas para determinar los efectos de cada gen de la biblioteca después de la transcripción alfa-sinucleína, normalizada para la expresión de una construcción de control interno (un promotor de hCMV dirigir la luciferasa de Renilla). Este protocolo se ve facilitada por un robot de sobremesa encerrado en una cabina de bioseguridad, que realiza la manipulación de líquidos aséptica en formato de 96 pocillos. Nuestro protocolo de transfección automatizado es fácilmente adaptable a la producción de alto rendimiento biblioteca lentiviral u otros protocolos de cribado funcionales que requieren triples-transfecciones de un gran número de plásmidos de la biblioteca únicos en conjugadoFuncione con un conjunto común de plásmidos auxiliares. También presentamos una alternativa económica y validado para comercialmente disponibles reactivos de luciferasa duales, que emplea el PTC124, EDTA, y pirofosfato para suprimir la actividad luciferasa de luciérnaga antes de la medición de la luciferasa de Renilla. El uso de estos métodos, que exhibió 7.670 genes humanos y se identificaron 68 reguladores de la alfa-sinucleína. Este protocolo es fácilmente modificables para atacar otros genes de interés.

Luciferase valores típicos, F: R ratios y valores de inducción para un único medio de placas se muestran en la Figura 4 Nota del éxito en el pozo H2, un inductor de 32 veces.. Los genes que causan una toxicidad excesiva (por ejemplo, así E3), o los pozos que fueron mal transfectadas, producirán valores bajos para ambos luciérnaga y luciferasa Renilla, pero un valor medio de inducción. Los genes que causan la inducción no específica de la actividad de la luciferasa, tal vez a través de ...

Se presenta un método de diagnóstico rápido y de bajo costo para la identificación de los reguladores transcripcionales utilizando alto rendimiento transfecciones robóticos y un ensayo de luciferasa dual brillo casero. Este protocolo genera rápidamente datos funcionales directos de lado a lado para miles de genes y es fácilmente modificable para apuntar cualquier gen de interés.

Selección de alto rendimiento funcional utilizando un doble resplandor de ensayo de luciferasa Homemade

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar reguladores transcripcionales de cualquier gen de interés utilizando un protocolo simple de transfección de alto rendimiento y un ensayo casero de luciferasa de doble brillo. Esto se logra diseñando y clonando primero un conjunto único de plásmidos reporteros de luciferasa duales. Estos plásmidos se transfectan en células T 2 9 3 en microplaca con plásmidos de una biblioteca de expresión de ADN, de modo que cada pocillo se transfecta con un solo plásmido de biblioteca.Después de 48 horas, se analiza la actividad de la luciferasa de luciérnaga, seguida de un ensayo de la actividad de la luciferasa de vainilla. El paso final es calcular las proporciones de actividad de luciferasa de luciérnaga a vainilla. En última instancia, la inducción relativa del gen de interés en respuesta a cada biblioteca.El gen se infiere por la proporción de la actividad de luciferasa de luciérnaga y vainilla en cada pozo después de la normalización basada en placas. La principal ventaja de esta técnica sobre los protocolos de ensayo reporteros existentes es su capacidad para generar rápidamente datos funcionales para un gran número de genes con un mí

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí se describen los procedimientos para el estudio de los cambios en la fagocitosis inducida por la expresión de genes con un enfoque de luciferasa basado en genes utilizando el sistema de doble GloTM ensayo luciferasa de Promega.

El estudio de biogénesis de la membrana con un ensayo de luciferasa basado en genes

Los relojes circadianos funcionar dentro de las células individuales, es decir, son células autónomas. A continuación, se describen los métodos para la generación de células autónomas modelos de reloj de forma no invasiva, luciferasa tiempo real basado en la tecnología de bioluminiscencia. Células Reporter proporcionar sistemas manejables, modelo funcional para el estudio de la biología circadiana.

Monitoreo de células autónomas Ritmos reloj circadiano de expresión génica utilizando luciferase reporteros Bioluminiscencia

En este video, describimos un método que destaca la utilidad del ensayo de bioluminiscencia para el cribado sensible y rápido de fármacos. Estos fármacos pueden probarse solos o en combinación para evaluar la sinergia en su modo de acción.

Ensayo basado en bioluminiscencia celular: un método de alto rendimiento para el cribado combinatorio de fármacos

El video muestra el ensayo de luciferasa utilizado para cuantificar proteínas marcadas con luciferasa. El ensayo utiliza una enzima luciferasa modificada genéticamente compuesta por un fragmento grande que se une con el fragmento pequeño, que se conjuga con una proteína de interés. Las subunidades unidas forman una enzima activa que, en presencia del sustrato, libera una señal luminiscente. A continuación, esta señal se cuantifica mediante un luminómetro.

El ensayo de luciferasa: un ensayo de alto rendimiento para medir señales luminiscentes utilizando bioreporteros basados en sistemas de nanoluciferasa de ingeniería

El logro de un nivel de comprensión de los sistemas de procesos celulares es un objetivo de la biología celular moderna. Se describe aquí estrategias para luciferase reporteros multiplexación de varias funciones celulares puntos finales para interrogar la función de genes utilizando RNAi bibliotecas escala del genoma.

Una plataforma de detección de luciferasa basado multiplexado para interrogar cáncer asociado transducción de señales en las células cultivadas

En ensayos in vitro para medir la replicación del virus se han mejorado en gran medida por el desarrollo de virus de ARN recombinantes que expresan luciferasa u otras enzimas capaces de bioluminiscencia. A continuación te detallamos una tubería de cribado de alto rendimiento que combina dichas cepas recombinantes de virus del sarampión y chikungunya para aislar a los antivirales de amplio espectro de bibliotecas químicas.

Screening de alto rendimiento para los de amplio espectro químico Inhibidores de Virus ARN

Este artículo presenta un método basado en la expresión de luciferasa de alto rendimiento para valorar varios virus de ARN y ADN utilizando manipuladores de líquidos automatizados y manuales.

De Alto Rendimiento La titulación de luciferasa que expresan virus recombinantes

Aquí describimos un ensayo de genes reporteros basado en células como una herramienta valiosa para examinar bibliotecas químicas en busca de compuestos que modulan los mecanismos de control postranscripcional ejercidos a través de 3' UTR.

Selección de alto rendimiento para moduladores químicos de genes post-transcripcionalmente regulados

Se desarrolló un ensayo en tiempo real de alto rendimiento para identificar simultáneamente (1) antimicrobianos penetrantes en células eucariotas dirigidos a un patógeno bacteriano intracelular, y (2) evaluar la citotoxicidad de las células eucariotas. Posteriormente, se combinó una variación de la misma tecnología con la tecnología de dispensación digital para permitir estudios fáciles, de alta resolución, de dosis-respuesta y de sinergia bidimensional y tridimensional.

De alto rendimiento, en tiempo real, Prueba de doble lectura de Intracelular Actividad antimicrobiana y la citotoxicidad celular eucariótica

Presentamos en el estudio actual un ensayo basado en fluorescencia novela usando linfocitos derivados de un ratón transgénico. Este ensayo es adecuado para la selección de alto rendimiento (HTS) de moléculas pequeñas dotados de la capacidad de cualquiera de inhibición o promoción de la activación de linfocitos.

Una de linfocitos ensayo basado en la fluorescencia adecuado para el cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas

Para identificar nuevos reguladores de los factores de transcripción, desarrollamos un enfoque para las bibliotecas de ARN lentivirales o retrovirales arrayed utilizando un ensayo de reportero transcripcional basado en doble luciferasa. Este enfoque ofrece una forma rápida y relativamente económica de examinar a cientos de candidatos en un solo experimento.

Identificación de reguladores de factores de transcripción mediante la proyección de rendimiento medio de bibliotecas de matriz y un reportero basado en la doble luciferasa

Aprende a identificar reguladores transcripcionales mediante un ensayo de luciferasa de doble resplandor casero y transfecciones robóticas de alto rendimiento en células 293T. Este método genera datos funcionales para miles de genes de forma rápida y económica.

Selección de alto rendimiento funcional utilizando un doble resplandor de ensayo de luciferasa Homemade

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