Selección de alto rendimiento funcional utilizando un doble resplandor de ensayo de luciferasa Homemade

El objetivo general de este procedimiento es identificar reguladores transcripcionales de cualquier gen de interés utilizando un protocolo simple de transfección de alto rendimiento y un ensayo casero de luciferasa de doble brillo. Esto se logra diseñando y clonando primero un conjunto único de plásmidos reporteros de luciferasa duales. Estos plásmidos se transfectan en células T 2 9 3 en microplaca con plásmidos de una biblioteca de expresión de ADN, de modo que cada pocillo se transfecta con un solo plásmido de biblioteca.

Después de 48 horas, se analiza la actividad de la luciferasa de luciérnaga, seguida de un ensayo de la actividad de la luciferasa de vainilla. El paso final es calcular las proporciones de actividad de luciferasa de luciérnaga a vainilla. En última instancia, la inducción relativa del gen de interés en respuesta a cada biblioteca.

El gen se infiere por la proporción de la actividad de luciferasa de luciérnaga y vainilla en cada pozo después de la normalización basada en placas. La principal ventaja de esta técnica sobre los protocolos de ensayo reporteros existentes es su capacidad para generar rápidamente datos funcionales para un gran número de genes con un mínimo de mano de obra y costo. Un día antes de la transfección designada como el primer día de la pantalla, 2 9 3 células T se colocan en 96.

Las células de las placas de pocillos se dimensionan, se cuentan y se resuspenden a una concentración de 1,5 veces 10 a la quinta célula por mililitro. En DMEM que contiene 14% de FBS, vierta las células en un depósito estéril. Coloque el depósito con seis placas de 96 pocillos de fondo transparente y una caja de puntas de pipeta de filtro en la cubierta del robot del manipulador de líquidos automatizado.

Se deben colocar dos placas de celdas para cada placa de la biblioteca que se va a proyectar. Dispense 100 microlitros de células en cada pocillo de cada placa para una densidad de 1,5 por 10 a la cuarta celda por pocillo. En esta demostración se proyectarán tres placas de biblioteca.

Por lo tanto, se preparan seis placas de celdas, centrifugan las placas de celdas a 50 veces G durante dos minutos, utilizando velocidades de rampa bajas para garantizar una densidad celular igual en cada pocillo. Esta imagen ilustra cómo deben verse las celdas plateadas después de la centrifugación. Incubar las células a 37 grados centígrados y 10% de dióxido de carbono durante la noche.

Para preparar los plásmidos reporteros de luciérnaga y vainilla, diluya cada uno a cinco nanogramos por microlitro en agua libre de endotoxinas en un tubo cónico de 15 mililitros. Combine las diluciones en una proporción de cinco a tres plásmido de luciérnaga a vainilla por volumen. Pipetear los plásmidos combinados en cada pocillo de una placa de 96 pocillos que dispensa 17 microlitros por placa de biblioteca, más un exceso de dos a 10 microlitros en cada pocillo. Las células se transfectan en el segundo día de la criba.

Para comenzar este procedimiento, para cada placa de biblioteca, mezcle 107.5 microlitros de defecto de temperatura ambiente con 4.3 mililitros de medio libre de suero, una dilución de uno a 40 en un tubo de poliestireno, incube durante cinco minutos a temperatura ambiente, dispense 44 microlitros por placa de biblioteca en cada pocillo de una placa con fondo de poliestireno de 96 pocillos. Coloque la placa de ADN de la biblioteca, la placa de efecto opt diluida, la placa de plásmido reportero y una caja de puntas de pipeta en el aspirado de la cubierta del robot. 17 microlitros de plásmidos reporteros, 43 microlitros de efecto opt diluido y 26 microlitros de ADN de biblioteca insertando un espacio de aire de cinco microlitros entre cada aspiración.

El ADN de la biblioteca debe aspirarse en último lugar para evitar la contaminación cruzada. Dispense el contenido de las puntas en una nueva cubierta de mezcla de placa de poliestireno con fondo en V y déjela reposar durante 20 minutos para permitir que se formen complejos de ADN lipídico. Si secciona varias placas de biblioteca, reemplace las puntas de pipeta y la placa de biblioteca y repita después de 20 minutos, descubra la placa de mezcla de ADN de efecto opt y colóquela en la plataforma del robot con dos placas de 2 9 3 células T usando una sola caja de puntas de pipeta.

Aspire 80 microlitros de la mezcla de ADN de efecto opt y dispense lentamente 40 microlitros por pocillo para cada placa de células. Cubra las células después de que la mezcla de ADN del efecto opt se haya agregado a las células en todas las placas. Centrifugar las placas a 1,200 veces G durante 30 minutos.

Regrese las placas a la incubadora e incube las células durante cuatro a seis horas. Durante esta incubación, prepare medios frescos mezclando 12 mililitros de DMEM que contengan 10% de FBS y 10 microgramos por mililitro de ciprofloxina. Para cada placa de biblioteca transfectada, vierta medios frescos en un depósito estéril.

A continuación, coloque dos cajas de puntas de robot, una sola placa de celdas, el depósito que contiene medios frescos y un depósito de residuos en la plataforma del robot. A continuación, aspire 100 microlitros de medio de las células y dispense en el depósito de residuos, parcialmente lleno de etanol al 70%. Con las puntas frescas, aspire 100 microlitros de medios frescos y dispense lentamente sobre las células.

Regrese las placas a la incubadora durante 48 horas. Se realizan los ensayos de luciferasa de luciérnaga y vainilla. 48 horas después de la transfectación en el cuarto día de la pantalla para cada placa de biblioteca, prepare ocho mililitros de tres x tampón de ensayo de luciérnaga y 12 mililitros de tres x tampón de ensayo de vainilla de sus respectivas soluciones madre dispense 82 microlitros de tampón de ensayo de luciérnaga en cada pocillo de una placa con fondo en V de 96 pocillos para cada placa de biblioteca que se va a ensayar.

Del mismo modo, dispense 122 microlitros de tampón de ensayo de vainilla en cada pocillo de otra placa con fondo en V de 96 pocillos. Para cada placa que se va a ensayar, reserve ambos tampones de ensayo. Coloque una caja de puntas de pipeta, un depósito de residuos y dos placas de células transfectadas de la misma placa de biblioteca en la plataforma del robot, aspire 60 microlitros de medios de cada placa y deséchelos en el depósito de residuos parcialmente lleno con placas de cubierta de etanol al 70% y reserve.

A continuación, coloque dos cajas de puntas de pipeta. La placa de tres x tampón de ensayo de luciérnaga y un conjunto de placas de celdas en la cubierta del robot. Aspire 40 microlitros de tres tampones de ensayo de luciérnaga y agréguelo a la primera placa de células, mezclando bien.

Cambio a nuevas puntas de pipeta. Repita para la segunda placa de celda. Coloque las células a temperatura ambiente durante 10 minutos para completar la lisis.

Registre la luminiscencia de cada pocillo de cada placa de celda en el registro del luminómetro durante un segundo por pocillo. Placas de retorno a la cubierta del robot. Coloque dos cajas de puntas de pipeta, la placa de tres tampones de ensayo y un conjunto de placas de celdas en la cubierta del robot.

Aspire 60 microlitros de tres tampones de ensayo de vainilla y agréguelo a la primera placa de celdas. Mezclando bien. Cambio a una nueva caja de puntas de pipeta.

Repita para la segunda placa de celda. Registre la luminiscencia de todas las placas en un luminómetro. Grabando cada pocillo durante un segundo.

En estas tablas se muestran los valores típicos de luciferasa para una sola media placa. La relación de luminiscencia entre luciérnaga y renovación o la relación F dos R para cada pozo se calcula dividiendo los recuentos de la señal de luciérnaga por los recuentos de la señal de renovación corrida y los resultados se muestran en el Panel C. El panel D muestra el valor de inducción para cada pozo calculado dividiendo la relación F dos R del pozo por la relación F dos R promedio de la placa, excluyendo el 25% más alto y el 25% más bajo de los pozos. Los valores de inducción deben promediarse entre réplicas para una sola placa de biblioteca transfectada.

Y los genes que inducen o reprimen la alfa sinucleína más del triple se consideran hits. Observe el inductor de 32 pliegues en el pozo H dos, en este resultado representativo que se muestra aquí hay una representación gráfica de los valores de inducción para la placa simple con el pozo H dos resaltado en azul. Hi.H two es un factor de transcripción neuronal no asociado previamente con la expresión de alfa sinucleína.

Es importante verificar que el cribado se realiza dentro del rango lineal de los ensayos reporteros, de modo que los clones que causan un aumento de la expresión se midan como un aumento de la actividad de la luciferasa, con este fin, las células se transfectaron con cantidades crecientes de plásmidos luciferasa de luciérnaga y vainilla bajo el control del promotor y ensayo H-C-M-V-I-E fuerte. Con este protocolo, se observó que la actividad de las luciérnagas se mantiene lineal a través de un amplio rango de valores. Mientras que la curva de actividad de la vainilla se aplana por encima de los 15 nanogramos por pocillo.

También es importante realizar los ensayos inmediatamente después de la etapa de incubación para evitar la no linealidad debido al agotamiento del sustrato. Un curso de tiempo de la señal de desintegración para el ensayo de luciferasa de luciferasa de luciferasa de luciérnaga de luciérnaga reveló una actividad significativa hasta una hora después de la adición de reactivos utilizando este protocolo, se examinaron 7.670 genes humanos y finalmente se identificaron 68 nuevos reguladores de alfa sinucleína en los resultados representativos que se muestran aquí. Cada línea horizontal representa la relación de inducción de un solo gen en comparación con un inductor neutro de GFP controlado.

Las líneas azules representan inductores positivos, mientras que la única línea roja representa un supresor, los valores de inducción se calculan como la relación entre la actividad de la luciferasa impulsora del promotor de la sinucleína alfa y la actividad de la luciferasa que impulsa la luciferasa del promotor del CMV de cada golpe, normalizada a la misma luciferasa, construye el ensayo utilizando un inductor GFP Siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la PCR cuantitativa, junto con ensayos adicionales de sobreexpresión y knockdown, para garantizar que los resultados identificados regulen el objetivo endógeno.